Мембрана d: Мембрана гидро-пароизоляционная Изоспан D 1,6х43,75 м, цена

Содержание

Что такое мембрана в одежде?

Одежда из мембранной ткани хороша тем, что «дышит» и отталкивает воду, то есть паропроницаема и влагоустойчива. Различается четыре вида мембранных покрытий. Они бывают:

  • без пор, идет осаживание пара на покрытии и выведение его под давлением;
  • с порами, т.е. попавшая извне влага не может проникнуть сквозь преграду из крошечных пор, но испарения от разогретой кожи сквозь них спокойно проходят и испаряют влагу;
  • комбинированные, пористая поверхность сверху имеет покрытие из полиуретана без пор;
  • и недавно разработанные eVent, здесь пленка с порами обладает дополнительной опцией отталкивания загрязнений и жира.

Предназначение

Женская и мужская спортивная одежда из мембраны применяется практически для любых видов спорта, экстремального туризма, альпинистских походов, классического туризма. Также она пригодится на охоте и рыбалке в холодное время года.

Многие спортсмены используют ее для тренировок с кардионагрузками. В коллекции Futurelight бренда The North Face можно подобрать мужские и женские мембранные куртки и жилеты как для спортивных занятий и туризма, так и для повседневных образов в качестве максимальной защиты от проливных дождей и сильных снегопадов.

Мембранная верхняя одежда: плюсы

Вещи с мембраной маловесны и в свернутом виде компактны, их легко уместить даже в самый маленький багаж. Кроме отличной ветро- и водозащиты, такие изделия сезонно универсальны. В ассортименте можно найти куртки как для теплой весенне-осенней погоды, так и для жгущих морозов. Мембранная зимняя одежда предполагает особый подбор вещей, надеваемых под нее: это термобелье в комплекте с полартековыми либо флисовыми толстовками. Также стоит отметить, что изделия максимально комфортны и практичны в ношении, с них несложно удалить загрязнения, но, чтобы вещь прослужила долго, в уходе за ней требуется следовать рекомендациям производителя.


Как выглядит мембрана в одежде?

В зависимости от способа совмещения мембраны с материалом и получившихся слоев вещи выглядят по-разному. У ткани 2-layer (два слоя) мембрана закрепляется на изнанке, защитой ей служит тонкая подкладка. У 2,5-layer — два слоя защищает вспененный полимер с поверхностью, покрытой пупырышками. У 3-layer — третьим слоем выступает мелкая сетка с изнанки, закрепленная методом ламинирования.

Мембранная спортивная одежда пользуется большой популярностью. Технологии ее производства постоянно совершенствуются, вот почему она прекрасно выполняет свои главные задачи.


Гидроизоляционная мембрана

Гидроизоляционная мембрана — это материал, который используется для защиты здания от влаги, конденсата и атмосферных осадков.

Гидроизоляционная мембрана защищает кровли крыши, пол, стены и другие части дома от негативного воздействия влаги. Без гидроизоляционной мембраны утеплитель быстро намокнет и потеряет свои теплоизолирующие свойства. Это напрямую отразится на температуре в доме и затратах на отопление.

В статье мы расскажем об особенностях гидроизоляционной мембраны, ее видах, основных правилах выбора и укладки.

Как работает гидроизоляционная мембрана

Часто люди путают гидроизоляционные мембраны и пароизоляционные пленки. Несмотря на их схожесть (материал производства, толщина, плотность), они обладают одним фундаментальным отличием. А именно — принципом действия.

Пароизоляционная пленка защищает утеплитель от внутренней влаги дома. Особенно это актуально в помещениях с повышенной влажностью. Например, в ванной.

Пароизоляционная пленка не пропускает пар и влагу. Совсем другое дело гидроизоляция. Кроме влаго- и ветрозащитных свойств, она обладает паропроницаемостью. Это необходимо для отвода влаги, которая все же просочилась в утеплитель. В мембране есть микроскопические поры, которые пропускают молекулы воды.

Читайте также: Что такое пароизоляционная пленка

Характеристики гидроизоляционных мембран

Гидроизоляционная мембрана относится к большой группе полимерных изоляционных материалов. Мембрана достаточно прочная, не боится перепада температур, эластична и проста в эксплуатации.

Основные свойства гидроизоляционных мембран:

  • эластичность;
  • прочность;
  • хорошая стойкость к атмосферным явлениям;
  • не боится перепадов температур;
  • долговечность.

Где применяются гидроизоляционные мембраны

Мембраны применяются в следующих сферах:

Гидроизоляция кровли — выполняет функцию ветро- и влагозащиты;
— отводит избыточную влагу от утеплителя и сохраняет его эксплуатационные свойства;
— можно использовать в роли временной крыши (не более 1.5 месяца).
Гидроизоляция бассейна
— высокая прочность обеспечивает надежность гидроизоляции;
— выполняет декоративную функцию — пленка бывает разных оттенков и приятная на ощупь.
Гидроизоляция подвалов, подземных туннелей и сооружений — работы можно выполнять в холодное время года;
— применяется в конструкциях, где ожидается их значительная осадка.

Виды гидроизоляционных мембран

Гидроизоляционные мембраны бывают следующих видов:

Диффузионная мембрана

Отличается более сложной структурой, чем обычная пленка. Поры мембраны напоминают микроскопические воронки. Благодаря этому свойству, она не пропускает пар с внешней стороны, но прекрасно отводит влагу с внутренней.

При монтаже такой пленки узкую часть пор выкладывают к кровле, а широкую — к утеплителю. Требует вентиляционного зазора с обеих сторон от мембраны.

Подробнее

Супердиффузионная мембрана

По принципу действия похожа на диффузионную мембрану. Основное отличие заключается в скорости отвода влаги — супердиффузионная пленка делает это намного быстрее. Как результат, не нужны вентиляционные зазоры.

Подробнее

Антиконденсатная мембрана

Некоторые типы кровельных покрытий (к примеру, металлочерепица) очень чувствительны к выпадению конденсата на внутренней стороне. Для решения этой проблемы используют антиконденсатную мембрану. Она не выпускает наружу избыточную влагу. Вместо этого мембрана задерживает воду с тыльной стороны своими мельчайшими ворсинками. Таким образом, влага может уйти по воздушным потокам вентиляционного зазора.

Подробнее

По форме мембраны бывают следующих видов:

Плоские пленочные мембраны Производятся из ПЭВП (полиэтилен высокой плотности), ПЭНП (полиэтилен низкой плотности), полиолефина (ТПО), ПВХ. Имеют вид обычной плоской пленки. Ее стандартная толщина — 0,2-2 мм. Бывает
трехслойной
.
Профилированная пленка Производится только из ПЭВП. Внешне напоминает листы с круглыми или квадратными выступами. Пленки бывают однослойными и двухслойными. Стандартная толщина — 0,5-1 мм. Глубина выступов может быть до 8 мм.

Гидроизоляционная мембрана Ондутис D (RV)

D — серая ткань с защитным слоем и добавкой UV-стабилизатора, который в течение 1,5 месяцев выдерживает прямое солнечное излучение. Может служить в качестве временной кровли.

На основание D Смарт нанесена самоклеющаяся лента. Это значительно упрощает процесс монтажа. Также ее можно использовать в роли гидробарьера в подвальных помещениях.

Как выбрать мембрану

Основная функция гидроизоляции — защита от воды. Поэтому наиболее важный параметр — водоупорность (измеряется в мм водяного столба — чем выше, тем эффективнее мембрана задерживает воду). Еще одна важная характеристика — разрывная нагрузка. Чем она выше, тем прочнее материал.

Также не стоит забывать и о цене. Сравнивая разные виды мембран, лучше всего ориентироваться на стоимость 1 кв. метра пленки. Более детально об особенностях выбора гидроизоляции читайте в статье: Как выбрать гидроизоляционную пленку.

Правильный монтаж гидроизоляционной мембраны

Способ монтажа гидроизоляционных мембран отличается в зависимости от того, куда она укладывается — на кровлю или на стены. Но общие этапы укладки гидроизоляционных мембран следующие:

  1. Гидроизоляционная мембрана всегда укладывается на утеплитель, который предварительно монтируется на кровле и стенах.
  2. Мембрана нарезается на куски необходимой длины и расстилается на поверхности.
  3. Монтаж мембраны осуществляется снизу-вверх горизонтальными полотнищами нужной длины.
  4. Для фиксации на деревянных элементах можно использовать строительный степлер.
  5. Последующие слои мембраны накладываются с обязательным нахлестом примерно в 10 см.
  6. Для надежной защиты стыков используется специальная монтажная лента.
  7. Следующий этап — закрепление мембраны деревянными брусками и монтаж наружной обшивки для стен или кровельных материалов для крыши.

Монтаж гидроизоляционной мембраны — это несложный процесс, который не требует особых навыков. Более подробно читайте в статье «монтаж гидроизоляционной плёнки» и смотрите видео ролики.

Что такое хирургическая мембрана и для чего она нужна?

По мере того, как медицина погружается глубже в освоение проблематики заболеваний, появляются новые методики решения этих проблем; соответственно, для новых методик требуются новые технологии и материалы. Так появились хирургические мембраны, успешно применяемые в стоматологии.

Такие мембраны представляют собой тонкие эластичные плёночные фрагменты, применяемые при хирургических/имплантологических операционных вмешательствах. Подробнее рассмотрим, в каких случаях применяются мембраны, что даст более полное представление о том, что это такое.

Наибольшее применение хирургические мембраны нашли в дентальной имплантации.

Напомним, что «классическая» методика проведения имплантации подразумевает два этапа: внедрение имплантата и последующую ортопедическую часть запланированного лечения (то есть, установку протеза на прижившийся имплантат). Так как обычно после утраты зуба и до операции по вживлению искусственного корня проходит довольно большой период, работам непосредственно с имплантатом предшествует операция по реставрации необходимого объёма кости (остеопластика), в связи с тем, что наблюдается атрофия костной ткани.

При проведении таких операций врач использует либо фрагменты костной ткани самого пациента (подсадка костных блоков), либо материалы/препараты, способствующие росту кости. И в том, и в другом случае хирург может применить мембрану (костные блоки могут быть закреплены титановыми винтами; для фиксации остеопластического материала использование мембраны целесообразно и обусловлено физическими свойствами материала). В данном случае мембрана выполняет как бы армирующую функцию: удерживает костнопластический материал в необходимом правильном положении. Как армирующее средство мембрана может быть применена и при имплантации с одномоментной подсадкой остеопластического материала. Мембрана может быть закреплена на кости или на соседних от места вмешательства зубах.

Хирургические мембраны могут быть применены при удалении зуба.

Как было упомянуто выше, потеря зуба постепенно приводит к убыли костной ткани. В частности, кость атрофируется, не получая необходимой нагрузки. Риск атрофии костной ткани появляется и после удаления зуба (удаления корня). Дело в том, что костная ткань и мягкие ткани имеют разную способность и скорость регенерации: дёсенная ткань разрастается и как бы занимает пространство, не давая расти кости, восстановление которой «не поспевает» за ростом мягких тканей. В этом случае мембрана выполняет барьерную функцию, препятствуя такому разрастанию дёсенных тканей (таким образом, хирургические мембраны также называют барьерными мембранами).

Использование мембран может быть целесообразно для укрепления подвижных зубов при пародонтологических лоскутных операциях.

В современной стоматологии применяется несколько десятков различных мембран, которые можно разделить на две большие группы:

  • Резорбируемые. Такие мембраны постепенно рассасываются.
  • Нерезорбируемые. В определённый момент врачу надо будет хирургически удалить установленную ранее мембрану.

Мембрану какого именно типа использовать определяется конкретными клиническими данными и планом лечения.

Как видим, помещение мембраны не является самостоятельной процедурой – это часть показанной по определённому случаю операции.

Хирургические операции различного назначения в сети клиник «Здоровая Улыбка» проводятся опытными квалифицированными специалистами.

HOTROCK | Мембрана Хотрок D

Гидро- пароизоляционная пленка повышенной прочности Хотрок D.

Хотрок D применяется в зданиях и постройках любого назначения. Универсальный гидро-пароизоляционный строительный материал высокой прочности с широким спектром применения. Предназначен для защиты строительных конструкций от проникновения водяных паров, конденсата, атмосферной и капиллярной влаги. Хотрок D представляет собой полипропиленовое тканое полотно с односторонним ламинированием.

Высокое сопротивление паропроницанию, водоупорность и повышенная прочность позволяет улучшить сохранность, физико-механические и теплофизические свойства базальтового утеплителя Хотрок и увеличить срок эксплуатации конструкции и здания в целом. Благодаря повышенной прочности материал способен выдерживать значительные механические нагрузки в процессе монтажа и эксплуатации, а также нести снеговую нагрузку.

Преимущества Мембраны Хотрок D:

  • удобство в монтаже и эксплуатации;
  • энергоэффективность;
  • экологичность и отсутствие вредных веществ в испарениях;
  • биостойкость к бактериям и плесени;
  • антикоррозийность;
  • стойкость к воздействию химических веществ.

Применяется в качестве подкровельной гидро-пароизоляции неутепленных скатных кровель и чердаков — для защиты элементов конструкции от проникновения конденсата, атмосферной влаги, ветра и снега, проникающих в местах неплотной укладки кровли.
В качестве пароизоляции в конструкциях плоских кровель.

В качестве гидроизоляции при устройстве цементных стяжек, полов по бетонным, земляным и иным влагопроницаемым основаниям, в цокольных перекрытиях и во влажных помещениях.

Материал может применяться в качестве временного покрытия для гидроизоляции стен и кровель, но не более 3-4 месяцев.

Совместим с продукцией ХОТРОК таких марок как: Руф Н; Руф С; Флор; Лайт; Блок.

Выпускается в упаковках 70 м2. Также возможен выпуск мембран другого метража.

Изолайк тип AQ подкровельная мембрана в Тюмени: цена, характеристики

Материалы Изолайк в каталоге «Стандарт+»

1. Ветро-влагозащитные паропроницаемые мембраны.

Ветро-влагозащитные паропроницаемые мембраны Изолайк. Покрытия защищают здания и утеплитель от ветра, конденсата, влаги, мембранная поверхность обеспечивает выветривание паров. В эту категорию входят следующие мембраны на один, два и три слоя.

Изолайк А — однослойная паропроницаемая мембрана, предназначенная для защиты утеплителя и внутренних конструкций кровель и стен от возможного проникновения атмосферной влаги,  а так же обеспечивает выведение водяных паров из подкровельного пространства и утеплителя. Применение паропроницаемой мембраны позволяет сохранить теплозащитные характеристики утеплителя и продлить срок службы всей конструкции. 

Изолайк А2 — экономичная двухслойная гидро-ветрозащитная мембрана. Применяется для защиты утеплителя и элементов кровли и стен от ветра, пыли, конденсата и влаги из внешней среды. Мембрана укладывается на утеплитель без устройства вентиляционного зазора, что позволяет избежать затрат на обрешетку. Благодаря своему строению, в основе которого лежит диффузионная мембрана, материал Изолайк А2 имеет высокую паропропускающую способность и водоупорность.  

Изолайк А3 — трехслойная гидро-ветрозащитная мембрана. Применяется для защиты утеплителя и элементов кровли и стен от ветра, пыли, конденсата и влаги из внешней среды. Мембрана укладывается на утеплитель без устройства вентиляционного зазора, что позволяет избежать затрат на обрешетку. Благодаря своему строению, в основе которого лежит диффузионная мембрана, материал Изолайк А3 имеет высокую паропропускающую способность и водоупорность. Применение трехслойной мембраны Изолайк А3 позволяет сохранить теплозащитные характеристики утеплителя, продлить срок службы всей конструкции и вести монтажные работы при любых погодных условиях.

Изолайк AQ  — новая подкровельная мембрана черного цвета.

2. Гидро-пароизоляционные пленки.

Гидро-пароизоляционные пленки Изолайк. Назначение материала – защита от влаги и конденсата, образующегося внутри здания. К категории пленок относятся Изолайк В, Изолайк C, Изолайк D.

Изолайк В — пароизоляционный материал. Используется в качестве паробарьера для защиты строительных конструкций и утеплителя от насыщения парами воды изнутри помещения в зданиях любого типа. Материал имеет двухслойную структуру: одна сторона гладкая, другая с шероховатой поверхностью для удержания конденсата и последующего его испарения. Благодаря этому существенно улучшаются теплоизолирующие свойства утеплителя. В холодный период материал препятствует образованию конденсата, грибковому заражению и коррозии элементов конструкции; защищает внутреннее пространство здания от проникновения частиц волокнистого утеплителя.

Изолайк С — гидро-пароизоляционный материал. Создан на основе ламинированного полипропиленового полотна повышенной плотности. Высокие качества полотна являются следствием неоднородности его конструкции. С наружной стороны материал имеет гладкую поверхность, обладающую паронепроницаемыми свойствами. Противоположная сторона имеет шероховатую поверхность, которая способствует удержанию капель конденсата и последующему их испарению.

Изолайк D — универсальный гидро-пароизоляционный материал высокой прочности. Создан на основе полипропиленовой ткани с односторонним ламинированием из полипропиленовой пленки. Применяется для защиты строительных конструкций от проникновения водяных паров, конденсата, атмосферной и капиллярной влаги. Материал обладает высокой прочностью и выдерживает значительные механические усилия в процессе монтажа и может длительное время нести дополнительную нагрузку, например в виде снега.

3. Отражающая пароизоляция.

Отражающая пароизоляция. Нетканое полотно и металлизированная пленка отражают тепловое излучение, за счет чего обеспечивает защита от проникновения влаги.

Изолайк FT — это полипропиленовое нетканое полотно, дублированное металлизированной пленкой. Материал обладает способностью отражать тепловое излучение от нагревательной системы и выполнять функции гидро-пароизоляции. Изолайк FT предназначен для защиты утеплителя и строительных конструкций кровли и стен от проникновения влаги и ветра из внешней среды, а также от паров воды изнутри помещения. Изолайк FT улучшает теплотехнические параметры утеплителя и продлевает срок службы всей конструкции, а также позволяет сократить затраты на отопление помещения.

Сравнение технических характеристик материалов «Изолайк» и «Ондутис»

Гастермин D, активированный инфламмасомой, вызывает пироптоз за счет образования пор мембраны

  • 1

    Shi, J. et al. Расщепление GSDMD воспалительными каспазами определяет пироптотическую гибель клеток. Природа 526 , 660–665 (2015)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 2

    Kayagaki, N. et al. Каспаза-11 расщепляет газдермин D для неканонической передачи сигналов воспаления. Природа 526 , 666–671 (2015)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 3

    Ратинам, В.A. et al. TRIF лицензирует каспазо-11-зависимую активацию инфламмасом NLRP3 грамотрицательными бактериями. Ячейка 150 , 606–619 (2012)

    CAS Статья Google Scholar

  • 4

    Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K. & Miao, E. A. Цитоплазматический LPS активирует каспазу-11: влияние на TLR4-независимый эндотоксический шок. Наука 341 , 1250–1253 (2013)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 5

    Лоу, Р.H. et al. Структурная основа связывания мембран и образования пор перфорином лимфоцитов. Природа 468 , 447–451 (2010)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 6

    Монталь М. Дизайн молекулярной функции: каналы коммуникации. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 , 31–57 (1995)

    CAS Статья Google Scholar

  • 7

    Росадо, К.J. et al. Семейство порообразующих токсинов MACPF / CDC. Ячейка. Microbiol. 10 , 1765–1774 (2008)

    CAS Статья Google Scholar

  • 8

    Geourjon, C. & Deléage, G. SOPMA: значительные улучшения в предсказании вторичной структуры белка путем консенсусного предсказания на основе множественных выравниваний. Вычисл. Прил. Biosci. 11 , 681–684 (1995)

    CAS PubMed Google Scholar

  • 9

    Bordier, C.Фазовое разделение интегральных мембранных белков в растворе Triton X-114. J. Biol. Chem. 256 , 1604–1607 (1981)

    CAS Статья Google Scholar

  • 10

    Dotiwala, F. et al. Лимфоциты-киллеры используют гранулизин, перфорин и гранзимы для уничтожения внутриклеточных паразитов. Nat. Med. 22 , 210–216 (2016)

    CAS Статья Google Scholar

  • 11

    Вальч, М.и другие. Цитотоксические клетки убивают внутриклеточные бактерии посредством доставки гранзимов, опосредованной гранулизином. Ячейка 157 , 1309–1323 (2014)

    CAS Статья Google Scholar

  • 12

    ван Меер, Г., Фелькер, Д. Р. и Фейгенсон, Г. В. Мембранные липиды: где они находятся и как ведут себя. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 , 112–124 (2008)

    CAS Статья Google Scholar

  • 13

    Левентис, П.А. и Гринштейн, С. Распределение и функция фосфатидилсерина в клеточных мембранах. Annu. Rev. Biophys. 39 , 407–427 (2010)

    CAS Статья Google Scholar

  • 14

    Шламе, М. Синтез кардиолипина для сборки бактериальных и митохондриальных мембран. J. Lipid Res. 49 , 1607–1620 (2008)

    CAS Статья Google Scholar

  • 15

    Паспаракис, М.& Vandenabeele, П. Некроптоз и его роль в воспалении. Природа 517 , 311–320 (2015)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Dondelinger, Y. et al. MLKL нарушает целостность плазматической мембраны, связываясь с фосфатидилинозитолфосфатами. Отчеты по ячейкам 7 , 971–981 (2014)

    CAS Статья Google Scholar

  • 17

    Ван Х.и другие. Смешанный белок MLKL, подобный домену киназы, вызывает разрушение некротической мембраны при фосфорилировании с помощью RIP3. Мол. Ячейка 54 , 133–146 (2014)

    CAS Статья Google Scholar

  • 18

    Sun, L. et al. Белок, подобный домену киназы смешанного происхождения, опосредует передачу сигналов некроза ниже киназы RIP3. Ячейка 148 , 213–227 (2012)

    CAS Статья Google Scholar

  • 19

    Вильшут, Дж.& Papahadjopoulos, D. Индуцированное Ca 2+ слияние фосфолипидных везикул контролировали путем смешивания водного содержимого. Природа 281 , 690–692 (1979)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 20

    He, W. T. et al. Гасдермин D является возбудителем пироптоза и необходим для секреции интерлейкина-1β. Cell Res. 25 , 1285–1298 (2015)

    CAS Статья Google Scholar

  • 21

    Финзель, Б.C. et al. Кристаллическая структура рекомбинантного человеческого интерлейкина-1β с разрешением 2,0 Å. J. Mol. Биол. 209 , 779–791 (1989)

    CAS Статья Google Scholar

  • 22

    Ламканфи М. и Диксит В. М. Механизмы и функции инфламмасом. Ячейка 157 , 1013–1022 (2014)

    CAS Статья Google Scholar

  • 23

    Рюль, С.& Broz, P. Caspase-11 активирует каноническую инфламмасому NLRP3, способствуя оттоку K + . евро. J. Immunol. 45 , 2927–2936 (2015)

    Артикул Google Scholar

  • 24

    Warren, S.E., Mao, D.P., Rodriguez, A.E., Miao, E.A. и Aderem, A. Множественные Nod-подобные рецепторы активируют каспазу 1 во время заражения Listeria monocytogenes . J. Immunol. 180 , 7558–7564 (2008)

    CAS Статья Google Scholar

  • 25

    Сервантес, Дж., Nagata, T., Uchijima, M., Shibata, K. & Koide, Y. Intracytosolic Listeria monocytogenes вызывает гибель клеток через активацию каспазы-1 в мышиных макрофагах. Ячейка. Microbiol. 10 , 41–52 (2008)

    CAS PubMed Google Scholar

  • 26

    Aachoui, Y. et al. Каспаза-11 защищает от бактерий, покидающих вакуоль. Наука 339 , 975–978 (2013)

    ADS CAS Статья Google Scholar

  • 27

    Ву, Дж., Fernandes-Alnemri, T. и Alnemri, E. S. Участие инфламмасом AIM2, NLRC4 и NLRP3 в активации каспазы-1 Listeria monocytogenes. J. Clin. Иммунол. 30 , 693–702 (2010)

    CAS Статья Google Scholar

  • 28

    Sauer, J. D. et al. Listeria monocytogenes запускает AIM2-опосредованный пироптоз при нечастом бактериолизе в цитозоле макрофагов. Cell Host Microbe 7 , 412–419 (2010)

    CAS Статья Google Scholar

  • 29

    Мяо, Э.A. et al. Пироптоз, индуцированный каспазой-1, является эффекторным механизмом врожденного иммунитета против внутриклеточных бактерий. Nat. Иммунол. 11 , 1136–1142 (2010)

    CAS Статья Google Scholar

  • 30

    Тиери, Дж., Валч, М., Дженсен, Д. К., Мартинвалет, Д. и Либерман, Дж. Выделение цитотоксических Т-клеток и гранул NK и очистка их эффекторных белков. Curr. Protoc. Cell Biol. 47 , 3.37: 3.37.1–3.37.29 (2010)

    Статья Google Scholar

  • Мембранный витамин D — обзор

    II Функции и биохимические показатели витамина D

    Витамин D необходим для большого числа физиологических процессов, и поэтому соответствующие уровни необходимы или благоприятны для оптимального здоровья (Stechschulte et al. др. , 2009 г.). Современная догма гласит, что витамин D через его гормональную форму 1,25 (OH) 2 D (кальцитриол) является центральным регулятором гомеостаза кальция.Кальцитриол выполняет эту роль главным образом через механизм, опосредованный рецептором витамина D (VDR), в котором гормон непосредственно регулирует экспрессию генов на уровне транскрипции.

    Большая часть 1,25 (OH) 2 D в организме синтезируется в первичных почечных канальцах почек, но синтез также происходит во многих внепочечных участках в клетках, которые экспрессируют CYP27B1 (фермент 1α-гидроксилазы) (Jones и др., , 2007). Производство 1,25 (OH) 2 D почками происходит в ответ на снижение уровня циркулирующего Ca 2+ , который стимулирует выработку паратироидного гормона (ПТГ).ПТГ, в свою очередь, индуцирует продукцию CYP27B1 первичными почечными канальцами.

    Когда уровни циркулирующего 1,25 (OH) 2 D повышаются, он подавляет собственное производство через петлю отрицательной обратной связи, в которой VDR связывается с промотором CYP27B1, подавляя его экспрессию. 1,25 (OH) 2 D увеличивает поглощение Ca 2+ кишечником, что приводит к снижению уровня ПТГ. Кроме того, 1,25 (OH) 2 D индуцирует в остеоцитах FGF-23, который подавляет выработку ПТГ.Кроме того, витамин D индуцирует выработку CYP24, митохондриального фермента цитохрома P450, который катаболизирует как 1,25 (OH) 2 D, так и 25 (OH) D, тем самым ограничивая его собственное производство.

    Экстраренальное производство витамина D происходит в костях, эпителиальных клетках кожи, легких и толстой кишки, паращитовидных железах и иммунных клетках. Считается, что широкое распространение фермента 1α-гидроксилазы (CYP27B1) увеличивает продуцируемый почками 1,25 (OH) 2 D с локально продуцируемым 1,25 (OH) 2 D в его клетках-мишенях, чтобы способствовать дальнейшим ролям. для витамина D в дополнение к классическим функциям гомеостаза кальция.

    Конформационно гибкий 1,25 (OH) 2 D может взаимодействовать с VDR, локализованным в ядре клетки, для генерации геномных ответов и в кавеолах с VDR плазматической мембраны для генерации быстрых ответов. Таким образом, спектр витамин D-зависимых генов не ограничивается горсткой специфических генов, связанных с кальцием, но широк и, вероятно, охватывает сотни или даже тысячи. Большинство делящихся типов клеток, нормальных и злокачественных, могут экспрессировать VDR и отвечать на 1,25 (OH) 2 D, и VDR экспрессируется по крайней мере в 30 различных тканях-мишенях.Функции витамина D в иммунной системе, коже, мышцах, поджелудочной железе, почках и мозге привели к утверждениям, что 1,25 (OH) 2 D, биологически активный гормон, участвует в патогенезе псориаза определенных типов. рака, рассеянного склероза, диабета 1 типа, регуляции артериального давления, мышечной слабости, сердечно-сосудистых заболеваний и микробных инфекций.

    Фактически появляется все больше свидетельств того, что витамин D может регулировать различные клеточные процессы, связанные с канцерогенезом (дифференциация, пролиферация и апоптоз), и играть роль в защите от болезней сердца, диабета, астмы и снижения мышечного тонуса (Giovannucci, 2009 г.).Несмотря на то, что были проведены обширные исследования витамина D, молекулярные и клеточные механизмы, ответственные за его многочисленные преимущества, до конца не выяснены, и список нетрадиционных заболеваний и состояний, связанных с дефицитом витамина, продолжает расти.

    Растущее признание вклада дефицита 25-гидроксивитамина D во многие клинические проблемы способствует значительным дебатам относительно диагностики дефицита витамина D и концентрации в крови, определяющей дефицит витамина D.

    В настоящее время мы не знаем всех ролей витамина D, но мы знаем, что большой объем данных (Jesudason et al. , 2002; Lips, 2001; Malabanan et al. , 1998; Vieth et al. al. , 2003) предполагают множественные потенциальные преимущества с минимальным риском неблагоприятных последствий, по крайней мере, до уровней около 75 нмоль / л (30 нг / мл) (Cavalier et al. , 2008).

    Растущий интерес к витамину D способствовал недавнему всплеску запросов на 25 оценок витамина D, что повысило потребность в надежных измерениях.Хотя несколько доступных анализов могут измерять концентрацию 25 (OH) 2 D в сыворотке крови, они имеют методологические ограничения.

    Основная трудность измерения 25 (OH) D связана с самой молекулой. 25 (OH) D, вероятно, является наиболее гидрофобным соединением, измеренным с помощью анализа связывания с белками (PBA), который представляет собой либо конкурентный PBA, либо радиоиммуноанализ (RIA). Липофильная природа 25 (OH) D делает его особенно уязвимым для матричных эффектов любого PBA. Все, что присутствует в сосуде для анализа образца, чего нет в сосуде для анализа калибратора, может вызвать матричные эффекты.Эти вещества, влияющие на матрикс, обычно представляют собой липиды, но в новых прямых анализах они могут быть чем угодно, что содержится в образце сыворотки или плазмы. Эти матричные факторы изменяют способность связывающего агента, антитела или связывающего белка равным образом связываться с 25 (OH) D в образце или стандарте. Когда это происходит, это заметно снижает достоверность анализа.

    Тот факт, что молекула существует в двух формах, 25 (OH) D 2 и 25 (OH) D 3 , усложняет ее измерение с помощью PBA.Другой проблемой для количественного определения 25 (OH) D 3 может быть сильное связывание молекулы с ее специфическим связывающим белком (витамин D-связывающий белок, VDBP) с переменным сродством. Гидрофобная природа 25 (OH) D, его связывание со специфическим связывающим белком (VDBP) с высоким сродством и с более низким сродством к липопротеинам и альбумину, а также влияние матрицы образца на эффективность анализа делают определение 25 (OH) D представительным. задача не из легких. Дополнительный аспект измерения витамина D, который получил лишь ограниченное исследование, — это индивидуальная биологическая изменчивость, которая не только отражает сезонную изменчивость, но также требует стабильного потребления или измерения минимальной концентрации во времени (Holick, 2009a).

    Высокая вариабельность в измерениях 25 (OH) D из-за используемых технологий тестирования и анализа, отсутствие равноправия 25 (OH) D 2 и 25 (OH) D 3 распознавание метаболитов (проблемы невозможности иммуноанализа) для измерения 25-гидроксивитамина D 2 ) (Binkley et al. , 2008), а отсутствие эталонного метода часто затрудняет правильную оценку статуса витамина D. Методы, доступные для оценки концентраций 25 (OH) D, представляют собой множество различных методик высвобождения 25 (OH) D из его белковой связи с последовательным количественным определением молекулы.

    Создание специфических антител облегчило разработку RIA и хемилюминесцентных анализов, которые вместе с конкурирующими PBA совместимы с различными платформами клинической химии. В этих анализах используется химическое высвобождение аналита из VDBP с последующим классическим иммуноанализом. Эта процедура может привести к вмешательству в VDBP, если полное химическое высвобождение 25 (OH) D из его связывающего белка и необратимая денатурация VDBP не достигнуты или если есть влияние матричных факторов сыворотки (например.g., липиды) в финальной иммунологической реакции.

    Еще одним новым достижением на арене методологий стал анализ витамина D с жидкостной хроматографией и тандемной масс-спектроскопией (ЖХ-МС / МС), в котором используется сопоставимая химическая очистка образцов и сочетаются превосходная разрешающая способность высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). с молекулярной фрагментацией и масс-спектрометрическим детектированием на основе массы / заряда. Предварительная очистка образца гарантирует оценку концентрации 25 (OH) D без каких-либо мешающих соединений в образце.Пригодность для рутинного измерения метаболитов 25-гидроксивитамина D делает метод LC-MS / MS без помех идеальным инструментом для измерения 25-гидроксивитамина D 2 и D 3 (Glendenning et al. , 2006 ).

    На первый взгляд казалось, что ЖХ-МС / МС предлагает несколько преимуществ перед иммуноанализом, включая повышенную точность и лучшее измерение 25-гидроксивитамина D 2 , но эффективность этих анализов в DEQAS (схемы внешней оценки качества витамина D) не отразил это оптимистическое убеждение, показав плохое межлабораторное согласие (Carter et al., 2004; Roth et al. , 2008).

    Фактически, существуют очевидные проблемы со стандартизацией анализа, такие как ошибки при приготовлении стандартов в различных матрицах, использование различных материалов внутреннего стандарта, альтернативные подходы к калибровке и отсутствие материала международного стандарта. Следовательно, крайне важно, чтобы был произведен согласованный на международном уровне стандартный материал для 25-гидроксивитамина D 2 и D 3 , который можно было бы использовать во всем мире для улучшения не только согласованности ЖХ-МС / МС, но и сопоставимости результатов иммуноанализа. .

    Такое улучшение характеристик анализа, как мы надеемся, приведет к более последовательному определению дефицита витамина D с лучшей сопоставимостью клинических испытаний с использованием различных результатов для измерения дефицита витамина D. Кроме того, следует отметить улучшение результатов для пациентов, получающих добавку витамина D, поскольку целевая общая концентрация 25-гидроксивитамина D, достигнутая в таких исследованиях, будет иметь большую сопоставимость между исследованиями (Carter and Jones, 2009; Fraser, 2009).

    В настоящее время существует общий консенсус по некоторым ключевым моментам измерения витамина D, которые следует резюмировать следующим образом: (a) выбрать анализ, который измеряет как 25 (OH) D 2 , так и 25 (OH) D 3 ; (b) при использовании анализа, который разделяет 25 (OH) D 2 и 25 (OH) D 3 (т.е. ВЭЖХ или ЖХ / МС-МС), укажите сумму двух соединений (25OHD 2 + 25OHD 3 ) в качестве основных результатов в вашем лабораторном отчете; (c) участвовать во внешней схеме оценки качества, которая предоставляет материалы, заменяемые на образцы от пациентов; и (d) сообщать о соответствующих уровнях дефицита и токсичности витамина D в дополнение к референсным уровням, полученным у тщательно отобранных референтных субъектов.

    Гастермин D, активированный инфламмасомами, вызывает пироптоз, образуя поры мембраны

    Рисунок 1. GSDMD-NT образует олигомеры, нарушенные мутацией четырех положительно заряженных остатков

    a ,…

    Рисунок 1. GSDMD-NT образует олигомеры, нарушенные мутацией четырех положительно заряженных остатков.

    a , клетки HEK293T, трансфицированные указанными плазмидами, лизированные в невосстанавливающих условиях, разделяли на нативном геле, подвергали иммуноблоттингу на Flag.b , Flag-иммунопреципитация лизатов клеток HEK293T, трансфицированных HA-GSDMD-NT и / или Flag-GSDMD-NT, анализировали с помощью иммуноблоттинга. c , клетки HEK293T, временно трансфицированные указанными плазмидами, оценивали через 16 часов после трансфекции на образование олигомеров с помощью иммуноблоттинга Flag невосстанавливающих (слева) или восстанавливающих (справа) гелей. Восстанавливающий гель также подвергали блоттингу на наличие каспазы-11. d , iBMDM, экспрессирующие Flag-GSDMD, подвергали электропорации с фосфатно-буферным раствором (PBS), LPS или Pam3CSK4 и анализировали через 2 часа с помощью иммуноблоттинга Flag. e , Кластер из четырех эволюционно консервативных, положительно заряженных аминокислот (красный и подчеркнутый) в GSDMD-NT был мутирован в Ala. Вторичные структуры дикого типа и 4A-мутированного фрагмента GSDMD мыши были предсказаны с использованием алгоритма SOPMA. h, спираль; е, лист; t, поворот; c, катушка. f, g , Мутации GSDMD-NT мыши блокируют GSDMD-NT-опосредованный пироптоз ( f ) и олигомеризацию ( g ). С первой по четвертую аминокислоты (R138 / K146 / R152 / R154) мутировали на Ala.Указаны мутированные остатки, т.е. в NT4A все 4 остатка мутированы; в NT 3, 4A мутированы 3-й и 4-й остатки. В NT1S3A R138 был изменен на Ser, три других остатка были мутированы на Ala. FL, полноразмерный GSDMD; NT, GSDMD-NT. Клетки HEK293T, трансфицированные GSDMD-NT дикого типа (WT) или мутантным GSDMD-NT, анализировали через 18 часов на предмет гибели клеток (анализ CytoTox96) и олигомеризации GSDMD (иммуноблот Flag). Указаны мономер и олигомер GSDMD-NT. ч , iBMDM, котрансфицированные с контролем или siRNA Gsdmd и указанные siRNA-устойчивые экспрессионные плазмиды Gsdmd , электропорировали с LPS.Количество выживших клеток определяли с помощью теста CellTiter-Glo через 2,5 часа. Среднее ± стандартное отклонение. показаны три технических повтора одного из трех независимых экспериментов ( f, h ). Статистические различия относятся к образцам, экспрессирующим Flag-GSDMD-NT ( f ). ** P <0,01 (двусторонний t -тест). NS, не имеет значения; нет., не трансфицированные ЛПС.

    границ | Взаимодействие витамина D с мембранными сигнальными путями

    Введение

    Активный метаболит витамина D 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 (1α, 25 (OH) 2 D 3 ) является ключевым регулятором экспрессии генов у высших организмов.Он модулирует активность рецептора витамина D (VDR), члена суперсемейства рецепторов ядерных гормонов, которые регулируют транскрипцию генов. Полногеномные исследования иммунопреципитации хроматина показали, что VDR связывается с сотнями сайтов генома даже в отсутствие 1α, 25 (OH) 2 D 3 и что связывание лиганда увеличивается и частично изменяет эти сайты связывания, которые зависят от тип клеток и продолжительность лечения (Carlberg and Campbell, 2013). В то время как подмножество сайтов связывания VDR может отвечать за контроль экспрессии генов (VDRE или элементы ответа на витамин D), другие могут быть временными якорными местами для популяции нелигандированных «спящих» VDR.Согласно классической точке зрения, VDR связывает ДНК как гетеродимеры с ретиноидным X-рецептором (RXRα, β или γ) и при связывании лиганда изменяет скорость транскрипции соседних генов.

    Однако многие гены, экспрессия которых изменена 1α, 25 (OH) 2 D 3 , не содержат VDRE. Предполагаемые механизмы этого действия включают посттранскрипционную регуляцию через изменения уровней микроРНК, которые модулируют период полужизни и / или трансляцию их информационных РНК (Thorne et al., 2011; Wang et al., 2011; Альварес-Диас и др., 2012; Kasiappan et al., 2012; Guan et al., 2013). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 могут регулировать гены посттрансляционно посредством изменений фосфорилирования или других модификаций белков, которые влияют на их стабильность (Lin et al., 2003; Li et al., 2004) или через изменения уровня или активности протеаз, которые нацелены на них (Alvarez-Díaz et al., 2010).

    В последнее время все большее значение придается другому механизму действия 1α, 25 (OH) 2 D 3 : модуляции сигнальных путей, запускаемых другими агентами на плазматической мембране.Действительно, ряд исследований показал, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 модулирует эффекты факторов роста и цитокинов, изменяя либо их цитозольные сигнальные пути, либо активность целевых факторов транскрипции в ядре, либо даже паракринным образом, подавляя их синтез и секрецию соседними клетками.

    Здесь мы рассматриваем доступные данные об этих неклассических альтернативных механизмах, с помощью которых 1α, 25 (OH) 2 D 3 модулирует экспрессию генов.Примечательно, что для конкретных генов, таких как c- MYC , описаны как прямые транскрипционные, так и непрямые способы регуляции с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Pan and Simpson, 1999; Pálmer et al., 2001; Торопайнен и др., 2010; Салехи-Табар и др., 2012).

    Взаимодействие 1α, 25 (OH)

    2 D 3 с путями Wnt, Hedgehog и Notch

    Сигнальные пути Wnt, Hedgehog и Notch, которые, как давно известно, играют решающую роль во время развития, теперь считаются критическими для многих онкогенных процессов, в которых они функционируют ненормально из-за мутации и / или изменений в экспрессии компонентов.

    Факторы Wnt активируют несколько сигнальных путей при связывании с разными рецепторами плазматической мембраны: канонический или Wnt / β-catenin и неканонический (плоская полярность, Ca 2+ …) пути (Clevers and Nusse, 2012). Активация пути Wnt / β-катенина путем мутации генов-супрессоров APC или AXIN или CTNNB1 / онкогена β-катенина вместе с изменениями экспрессии ряда регуляторных генов ( SFRP , DICKKOPF (DKK) s …) является отличительной чертой большинства колоректального рака и различной доли некоторых других злокачественных новообразований (Clevers and Nusse, 2012).В серии исследований сообщается, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 противодействует передаче сигналов Wnt / β-катенин в раковых клетках толстой кишки за счет нескольких механизмов: снижения транскрипционно активных комплексов β-катенин / фактор Т-клеток, индукция перемещения β-катенина из ядра к адгезивным соединениям структур на плазматической мембране и повышение уровня ингибитора Wnt DKK-1 (Pálmer et al., 2001; Shah et al., 2006; Aguilera et al., 2007) (рисунок 1). Таким образом, конечная точка пути, т.е.е. активация генов-мишеней β-катенина ослабляется 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Pálmer et al., 2001). Подчеркивая важность этого действия, был предложен дополнительный косвенный механизм антагонизма Wnt / β-катенина при раке толстой кишки с участием IL-1β, который будет рассмотрен в разделе 1α, 25 (OH) 2 D 3 и цитокины. . Хотя 1,25 (OH) 2 D 3 ингибирует транскрипционную активность β-катенина / TCF в толстой кишке и других раковых клетках, была описана повышающая регуляция пути Wnt / β-катенина с помощью активированного лигандом или не связанного с лигандом VDR. в остеобластах и ​​кератиноцитах, где он способствует образованию костей и дифференцировке волосяных фолликулов соответственно (Larriba et al., 2013). Однако результаты, полученные в кератиноцитах, противоречивы: в то время как VDR усиливает передачу сигналов Wnt посредством прямого связывания с лимфоцитным энхансер-связывающим фактором (LEF) -1 независимо от лиганда и β-катенина (Luderer et al., 2011), активированный лигандом VDR является считается, что он ингибирует передачу сигналов Wnt / β-catenin (Bikle, 2011; Jiang et al., 2012).

    Рис. 1. Схематическое изображение многоуровневых перекрестных помех 1α, 25 (OH) 2 D 3 (1,25) с путями передачи сигналов Wnt, Hedgehog и Notch .Для простоты показаны только основные компоненты и регуляторы путей. Пояснения, подробности и ссылки можно найти в тексте.

    Также предполагалось ингибирование передачи сигналов Hedgehog (Hh) соединениями витамина D. В исследовании, объединяющем эксперименты на рыбках данио, дрожжи Pichia pastori и мышиные фибробласты, секретирующие витамин D 3 или его предшественник 7-дегидрохолестерин (7-DHC), опосредуют паракринное ингибирование Smoothened (Smoothened) посредством Патченный (Ptch) 1, который приводит к инактивации пути (Bijlsma et al., 2006). В предложенной модели, которая включает связывание витамина D 3 с Smo при высоких (микромолярных) концентрациях, лиганды Hh активируют этот путь, блокируя индукцию секреции витамина D 3 /7-DHC с помощью Ptch2 (Bijlsma et al., 2006) (рисунок 1). Путь Hh аберрантно активируется в базальноклеточной карциноме, наиболее частом типе опухолей человека. Интересно, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 подавляет пролиферацию и индуцирует дифференцировку базальноклеточных карцином мышей и эмбриональных рабдомиосарком с активированным путем Hh из-за делеции Ptch2 (Uhmann et al., 2011, 2012). Как и в предыдущем исследовании, 1α, 25 (OH) 2 D 3 действует на уровне Smo независимым от VDR образом (Рисунок 1). Любопытно, что Tang et al. обнаружили, что витамин D 3 ингибирует Hh и пролиферацию клеток более эффективно, чем 7-DHC, 25 (OH) D 3 или 1α, 25 (OH) 2 D 3 в клетках базальноклеточной карциномы мыши (Tang и др., 2011). Витамин D 3 также ингибирует пролиферацию и путь Hh за счет инактивации Smo в культивируемых клетках аденокарциномы поджелудочной железы мыши, но не имеет противоопухолевой активности in vivo (Brüggemann et al., 2010). Общей проблемой всех этих исследований является высокая концентрация витамина D 3 , необходимая для наблюдения отмеченных эффектов. Исследования на мышах с дефицитом Vdr и на эксплантатах кожи мышей показали, что отсутствие VDR увеличивает экспрессию нескольких компонентов пути Hh, таких как Shh , Smo , Gli1 , Gli2 и Ptch2. , а 1α, 25 (OH) 2 D 3 подавляет их экспрессию (Bikle et al., 2013) (рисунок 1). Однако взаимодействие между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и передачей сигналов Hh в коже человека еще предстоит выяснить.

    Несколько исследований связывают витамин D с передачей сигналов Notch. Дифференциация человеческих остеобластов витамином D 3 и дексаметазоном отчетливо влияет на экспрессию членов семейства рецепторов Notch (Schnabel et al., 2002). В остеобластах грызунов фактор транскрипции Hes-1, который является эффектором пути Notch, усиливает индукцию транскрипции SPP1 / остеопонтин с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 , что указывает на сотрудничество 1α , 25 (OH) 2 D 3 и Notch пути в ремоделировании кости (Shen and Christakos, 2005) (Рисунок 1).Транскриптомный анализ иммортализованных неканцерогенных клеток предстательной железы RWPE1 человека показал снижение уровней РНК лигандов NOTCH JAGGED ( JAG) 1 , JAG2 и дельта-подобных ( DLL) 1 на 1α. , 25 (OH) 2 D 3 (Коваленко и др., 2010) (рис.1). Напротив, никаких изменений в экспрессии NOTCH-1 и JAG1 не было обнаружено в культивируемых кератиноцитах человека после обработки 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Reichrath and Reichrath, 2012).Поскольку транскрипция JAG1 и, следовательно, передача сигналов Notch активируются с помощью Wnt / β-катенина в клетках колоректального рака (Rodilla et al., 2009), репрессивный эффект 1α, 25 (OH) 2 D 3 на Путь Notch в этой системе может быть вторичным по отношению к антагонизму пути Wnt / β-catenin (Figure 1).

    Взаимодействие 1α, 25 (OH)

    2 D 3 с агентами, которые запускают сигнальные пути через рецепторы киназных мембран плазмы

    Существует взаимный антагонизм между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и эпидермальным фактором роста (EGF), мощным митогеном, в первичных эпителиальных клетках толстой кишки и в сформировавшейся толстой кишке (Caco-2) и молочной железе (T47D) линии опухолевых клеток.Это основано на перекрестном ингибировании экспрессии их соответствующих рецепторов, VDR и EGFR (Tong et al., 1998, 1999). Однако это зависит от типа клеток, поскольку EGF увеличивает VDR в тонком кишечнике крысы, а 1α, 25 (OH) 2 D 3 увеличивает EGFR в клетках рака молочной железы BT-20 (Bruns et al., 1989; Desprez et al., 1991). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 ингибирует передачу сигналов EGFR за счет увеличения уровня белка E-кадгерина на плазматической мембране, который подавляет EGFR (Pálmer et al., 2001; Andl and Rustgi, 2005), и за счет уменьшения SPROUTY-2, цитозольного белка, который снижает убиквитинирование, интернализацию и деградацию EGFR (Cabrita and Christofori, 2008; Barbáchano et al., 2010).

    Трансформирующий фактор роста (TGF) -β играет противоположную роль в канцерогенезе: он ингибирует пролиферацию нормальных эпителиальных клеток, но позже вызывает эпителиально-мезенхимальный переход, иммуносупрессию и метастазирование (Pickup et al., 2013). 1α, 25 (OH) 2 D 3 индуцирует экспрессию рецептора TGF-β типа I, и оба агента, 1α, 25 (OH) 2 D 3 и TGF-β, взаимодействуют в Caco- 2 ингибирование роста клеток (Chen et al., 2002; Pálmer et al., 2003). Более того, Smad3, медиатор передачи сигналов TGF-β, является соактиватором VDR и участвует в регуляции генов с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Yanagisawa et al., 1999), эффект, который отменяется Smad7 в трансфицированных клетках COS-7 (Yanagi et al., 1999). Усиливая взаимодействие между обоими сигнальными путями, 1α, 25 (OH) 2 D 3 индуцирует экспрессию якоря Smad для активации рецептора (SARA) (Pálmer et al., 2003), который поддерживает эпителиальный фенотип путем набора Smads 2/3 к активированным рецепторам TGF-β и регулирует эндоцитарный транспорт EGFR и других белков (Tang et al., 2011; Костарас и др., 2013). Примечательно, что недавнее исследование группы RM Evans показало перекрытие сайтов связывания VDR и Smad3 по всему геному, которое отвечает за отмену лигандами VDR опосредованной TGF-β1 активации звездчатых клеток печени во время фиброза печени (Ding et al. др., 2013). Эти авторы показывают, что передача сигналов TGF-β1 перераспределяет сайты связывания VDR в геноме и облегчает связывание VDR с генами-мишенями профиброза Smad3. После активации лиганда связывание VDR с корегулируемыми генами снижает занятость Smad3 в этих сайтах, вызывая ингибирование фиброза (Ding et al., 2013). Это регуляторный механизм обратной связи, в котором лиганды VDR ограничивают фиброзный процесс и, таким образом, обеспечивают соответствующий непатологический ответ ткани. Учитывая решающую роль TGF-β в канцерогенезе, будущие исследования должны изучить, играют ли соединения витамина D аналогичную роль в поддержании целостности эпителия, препятствуя возникновению карцином.

    1α, 25 (OH) 2 D 3 и TGF-β также взаимодействуют в кости. Любопытно, что в остеобластных клетках крысы (UMR 106 и ROS 17 / 2,8) и человека (MG-63) TGF-β увеличивает экспрессию VDR, но ингибирует стимуляцию транскрипции остеокальцина и остеопонтина и уровни РНК на 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Staal et al., 1994). TGF-β оказывает этот ингибирующий эффект за счет снижения связывания комплексов VDR-RXR с VDRE, локализованными в промоторе этих генов, не влияя на доступность VDR в ядре, по крайней мере, в клетках ROS 17 / 2.8 (Staal et al., 1996). В отличие от стимуляции синтеза остеокальцина в клетках человека и крысы, 1α, 25 (OH) 2 D 3 снижает продукцию остеокальцина в культурах длинных костей плода мышей и неонатальных остеобластических клетках MC3T3, одновременно стимулируя резорбцию кости (Staal et al., 1998). Это действие резорбции кости 1α, 25 (OH) 2 D 3 дозозависимо ингибируется TGF-β (Staal et al., 1998).

    Между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и инсулиноподобными факторами роста (IGF) -I и II существует сложная взаимосвязь, зависящая от типа клеток, контекста и иногда от возраста. Например, в миобластах C2C12 1α, 25 (OH) 2 D 3 снижает экспрессию IGF-I, в то время как увеличивает экспрессию IGF-II (Garcia et al., 2011). В клетках карциномы толстой кишки HT29 несколько соединений витамина D ингибируют секрецию IGF-II, тем самым ослабляя его активность в отношении пролиферации клеток (Oh et al., 2001). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 блокирует митогенную активность инсулина и IGF-I в клетках рака молочной железы MCF7, по крайней мере, частично из-за ингибирования активации c-FOS (Vink-van Wijngaarden и др., 1996). 1α, 25 (OH) 2 D 3 и IGF-I также оказывают противоположное действие на длинные кости мышей: IGF-I увеличивает выработку остеокальцина, который полностью блокируется 1α, 25 (OH) 2 D 3 и подавляет усиление резорбции кости, вызванное 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Staal et al., 1998). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 по-разному регулирует экспрессию нескольких IGF-связывающих белков (IGFBP), группы молекул с плейотропным действием, которые транспортируют IGF, а также модулируют выживаемость / апоптоз клеток: 1α, 25 ( OH) 2 D 3 индуцирует экспрессию IGFBP3 в карциноме толстой кишки SW480-ADH, остеосаркоме SaOS-2, раке предстательной железы PC3, карциноме груди MCF7 и нормальных клетках молочной железы MCF-10A (Pálmer et al., 2003; Matilainen et al. , 2005; Малинен и др., 2011; Brosseau et al., 2013), IGFBP6 в клетках SaOS-2, SW480-ADH и карциномы толстой кишки HT29 (Oh et al., 2001; Pálmer et al., 2003; Matilainen et al., 2005), IGFBP1 и IGFBP5 в SaOS -2 и PC3, а также IGFBP4 в клетках SaOS-2 (Matilainen et al., 2005). Напротив, 1α, 25 (OH) 2 D 3 репрессирует IGFBP4 в клетках HT29 и SW480-ADH и IGFBP2 в клетках HT29 (Oh et al., 2001; Pálmer et al., 2003). В клетках яичников только 1α, 25 (OH) 2 D 3 индуцирует продукцию IGFBP1, но, наоборот, усиливает ингибирующий эффект инсулина (Parikh et al., 2010). Любопытно, что недавние исследования показывают, что IGFBP3 взаимодействует с VDR (Li et al., 2013) и что IGFBP6 связывает VDR и блокирует индукцию дифференцировки остеобластов с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Cui et al., 2011).

    Зависимые от типа клеток эффекты 1α, 25 (OH) 2 D 3 также были описаны для передачи сигналов фактора роста гепатоцитов (HGF). 1α, 25 (OH) 2 D 3 активирует промотор гена HGF и индуцирует экспрессию и секрецию HGF в интерстициальных фибробластах почек крыс NRK-49F (Li et al., 2005) и в келоидных фибробластах человека (Zhang et al., 2011). В соответствии с этими результатами, дефицит витамина D снижает экспрессию HGF и рецептора HGF / c-Met во время регенерации печени у крыс (Goupil et al., 1997). И наоборот, 1α, 25 (OH) 2 D 3 снижает уровень РНК HGF в клетках промиелоцитной лейкемии HL-60 человека (Inaba et al., 1993), гладкомышечных клетках (Shalhoub et al., 2010). ) и клетки остеосаркомы MG-63 (Chattopadhyay et al., 2003). Более того, экспрессия c-Met ингибируется 1α, 25 (OH) 2 D 3 в линии гепатоцеллюлярных клеток человека MHCC97 (Wu et al., 2007). Любопытно, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 и HGF взаимодействуют для увеличения остеогенной дифференцировки стволовых клеток костного мозга человека и созревания клеток-предшественников хондроцитов (Grumbles et al., 1996; D’Ippolito et al., 2002 ; Chen et al., 2011, 2012). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 и HGF аддитивно ингибируют пролиферацию андроген-нечувствительных клеток рака простаты (Qadan et al., 2000).

    В соответствии со своей регулирующей ролью в организме, 1α, 25 (OH) 2 D 3 способствует физиологическому и гомеостатическому ангиогенезу, но ингибирует ангиогенез при патологических состояниях.Таким образом, 1α, 25 (OH) 2 D 3 способствует миогенной дифференцировке клеток C2C12 за счет увеличения экспрессии двух ключевых ангиогенных факторов: фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста фибробластов-1 (Garcia et al., 2013). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 стимулирует проангиогенные свойства эндотелиальных клеток-предшественников за счет увеличения уровней VEGF (Grundmann et al., 2012). 1α, 25 (OH) 2 D 3 также усиливает экспрессию VEGF в остеобластоподобных клетках, но не в клетках рака груди (Schlaeppi et al., 1997). Аналогичным образом ED-71, аналог витамина D, усиливает экспрессию VEGF и способствует ангиогенезу в модели абляции костного мозга мышей (Okuda et al., 2007). В самом деле, повышенная продукция VEGF в клетках гладких мышц сосудов является результатом активации VDRE, присутствующего в промоторе гена VEGF (Cardus et al., 2009). Напротив, 1α, 25 (OH) 2 D 3 подавляет экспрессию индуцируемого гипоксией фактора (HIF) -1 и белка VEGF в нескольких линиях клеток рака толстой кишки, простаты и молочной железы человека (Ben-Shoshan et al., 2007), снижает продукцию VEGF клетками поясничного кольца человека (Gruber et al., 2008) и защищает от диабетической ретинопатии у крыс путем ингибирования экспрессии VEGF в сетчатке (Ren et al., 2012).

    1α, 25 (OH) 2 D 3 также модулирует активность сигнальных путей, опосредованных другими типами рецепторов плазматической мембраны, такими как наши рецепторы, связанные с G-белком. Шен и др. обнаружили, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 подавляет экспрессию белка, связанного с паратироидным гормоном (PTHrP), в клетках рака простаты через отрицательный VDRE, локализованный в некодирующей области гена, тем самым препятствуя индукции пролиферации клеток и экспрессии проинвазивного интегрина α 6 β 4 , вызванного передачей сигналов PTHrP (Shen et al., 2007).

    1α, 25 (OH)

    2 D 3 и цитокины

    Противовоспалительное и иммуномодулирующее действие и, следовательно, некоторые из противоопухолевых и антимикробных эффектов 1α, 25 (OH) 2 D 3 опосредуются регуляцией продукции цитокинов и / или контролем их рецепторов. или нижестоящие сигнальные пути. В глобальном масштабе 1α, 25 (OH) 2 D 3 вносит вклад в аутокринный и паракринный контроль врожденных и адаптивных иммунных ответов (Adorini and Penna, 2008).

    1α, 25 (OH) 2 D 3 регулирует функцию антигенпрезентирующих клеток и Т-лимфоцитов. Он подавляет дифференцировку клеток Th2 и, следовательно, секрецию цитокинов Th2-типа, усиливает развитие клеток Th3 и индуцирует толерогенные моноциты и дендритные клетки. ИЛ-4 и ИЛ-10 относятся к числу обычно повышенных цитокинов, в то время как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-17, фактор некроза опухоли (TNF) -α и интерферон (IFN) -γ снижаются (Adorini и Пенна, 2008).

    Механически активированный лигандом VDR напрямую подавляет экспрессию IL-10, IL-2 и IL-12B в обработанных липополисахаридом человеческих моноцитах (THP-1) за счет его связывания с VDRE, расположенными в геномных областях этих генов и рекрутирование корепрессора NCOR / SMRT и гистоновых деацетилаз (Matilainen et al., 2010а, б; Gynther et al., 2011). Примечательно, что IL-10 подавляется короткой обработкой 1α, 25 (OH) 2 D 3 (8 ч), но активируется в более поздние моменты времени (48 ч) (Matilainen et al., 2010a). Кроме того, прямое связывание VDR с одним VDRE опосредует активацию гена IL-8 с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 в недифференцированных и дифференцированных клетках THP-1 (Ryynänen and Carlberg, 2013).

    1α, 25 (OH) 2 D 3 также изменяет экспрессию генов-мишеней в иммунных клетках путем репрессии важных факторов транскрипции, таких как ядерный фактор каппа B (NFkB), и путей передачи сигналов, таких как датчик сигнала киназы Януса. и активатор транскрипции (JAK-STAT) (Yu et al., 1995; Muthian et al., 2006; Geldmeyer-Hilt et al., 2011). 1α, 25 (OH) 2 D 3 также подавляет активность NFκB в фибробластах и ​​адипоцитах (Harant et al., 1998; Mutt et al., 2012), а фибробласты, лишенные VDR, обладают повышенной активностью NFκB (Sun et al. , 2006). Прямые (увеличение экспрессии IκBα и уменьшение ядерной транслокации p65) и непрямые (повышающая регуляция IGFBP3 и кластерина) механизмы вносят вклад в ингибирование активации NFκB (Krishnan and Feldman, 2010).Группа Д. Фельдмана сообщила, что, помимо ингибирования NFκB, противовоспалительные эффекты 1α, 25 (OH) 2 D 3 в клетках рака простаты включают снижение выработки провоспалительных простагландинов (PG) за счет подавление циклооксигеназы-2, подавление рецепторов PG и активация 15-гидроксипростагландин дегидрогеназы, которая инактивирует PG (Krishnan and Feldman, 2010). Более того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 снижает синтез провоспалительного IL-6 за счет инактивации киназы p38 из-за усиления активности митогенкиназы фосфатазы (MKP) 5 и блокады TNF- α (Кришнан, Фельдман, 2010).В клетках Jurkat репрессия гена IL-2 с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 , по крайней мере, частично обусловлена ​​блокадой образования комплекса NFATp / AP-1 при положительном регуляторном NFAT-1. сайт, который связывается гетеродимерами VDR-RXR (Alroy et al., 1995).

    1α, 25 (OH) 2 D 3 снижает секрецию интерлейкина (IL) 1-β в макрофагах THP, блокируя активацию STAT1 (Kaler et al., 2009). Поскольку IL1-β активирует путь Wnt / β-катенин в клетках карциномы толстой кишки посредством ингибирования активности GSK3β и последующей стабилизации и ядерной транслокации β-катенина, этот механизм может способствовать антагонизму передачи сигналов Wnt посредством 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Калер и др., 2009) (рисунок 1). Любопытно, что IL-1α, как полагают, активируется и опосредует антипролиферативные эффекты 1α, 25 (OH) 2 D 3 в клетках-предшественниках / стволовых клетках простаты (Maund et al., 2011).

    В остеобластах человека 1α, 25 (OH) 2 D 3 полностью отменяет ингибирующее действие IFN-β на минерализацию. Этот доминирующий эффект на дифференцировку остеобластов и формирование костей отражается в подавлении IFN-связанных и регулируемых генов с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Woeckel et al., 2012). Одновременно 1α, 25 (OH) 2 D 3 также индуцирует активин A, сильный ингибитор минерализации, и подавляет фоллистатин, естественный антагонист активина A, для обеспечения точной регуляции процесса минерализации (Woeckel et al., 2013b).

    Недавние открытия подчеркнули сложность действия 1α, 25 (OH) 2 D 3 и его роль в противомикробном ответе как части врожденного и адаптивного иммунитета. Таким образом, активация Toll-подобных рецепторов макрофагов (TLR) внутриклеточными бактериями, такими как Mycobacterium tuberculosis , активирует гены VDR и CYP27B1 , которые позволяют индукцию антимикробного пептида кателицидина 1α, 25 (OH) 903 3 (Лю и др., 2006). В моноцитах активация TLR запускает индукцию гена дефенсина β4 ( DEFB4 ), требующего кооперации между IL-1β и 1α, 25 (OH) 2 D 3 , что объясняется наличием одного VDRE и двух IL. -1β-активируемые сайты NFkB в промоторе DEFB4 (Liu et al., 2009). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 необходим для противомикробного действия IFN-γ в макрофагах человека (Fabri et al., 2011). Более того, индуцируя экспрессию рецепторов TLR2 и CD14 и кателицидина, 1α, 25 (OH) 2 D 3 опосредует эффект TGF-β, способствуя ответу кератиноцитами на микробную инфекцию и повреждение раны (Schauber et al., 2007). Эти результаты показывают также неожиданное сотрудничество 1α, 25 (OH) 2 D 3 с агентами (IL-1β, TGF-β, IFN-γ), которые антагонистичны другим типам клеток.

    Взаимодействие 1α, 25 (OH)

    2 D 3 / VDR с факторами транскрипции

    Liganded или unliganded VDR взаимодействует или регулирует экспрессию ряда факторов транскрипции, которые являются нижестоящими эффекторами различных сигнальных путей (Таблица 1). Интересным примером является активация 1α, 25 (OH) 2 D 3 CDKN1B / p27 Kip1 , гена регулятора клеточного цикла, в котором отсутствуют VDRE.1α, 25 (OH) 2 D 3 впервые было показано, что он индуцирует транскрипцию CDKN1B путем стимуляции связывания факторов транскрипции Sp1 и NF-Y с промотором CDKN1B в миеломоноцитарной клеточной линии U937 (Inoue et al. ., 1999). Позже прямое взаимодействие VDR-Sp1 на сайтах промотора Sp1 было описано как ответственное за этот эффект (Huang et al., 2004). Помимо усиления транскрипции, 1α, 25 (OH) 2 D 3 увеличивает стабильность белка p27 Kip1 путем репрессии белка F-бокса p45 Skp2 посредством индукции VDR-Sp1 комплексы, которые вместе с гистондеацетилазой 1 рекрутируются в сайты Sp1 на промоторе гена p45 Skp2 (Lin et al., 2003; Ли и др., 2004; Хуанг и Хунг, 2006).

    Таблица 1. Взаимодействие между VDR и другими факторами транскрипции .

    Ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ( GM-CSF ) является еще одним примером необычной регуляции с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 . Активированный лигандом VDR репрессирует GM-CSF через составной элемент ДНК, распознаваемый гетеродимерами Jun-Fos (AP-1) и ядерным фактором активированных Т-клеток (NFAT) 1 (Towers et al., 1999). В отсутствие RXR VDR связывается с c-Jun и стабилизирует AP-1, связанный с ДНК, который вытесняет NFAT1 и снижает транскрипцию GM-CSF . В клетках Caco-2 1α, 25 (OH) 2 D 3 стимулирует AP-1 посредством активации протеинкиназы C-α, ERK и JNK, что приводит к дифференцировке клеток (Chen et al., 1999).

    В почечных клетках 1α, 25 (OH) 2 D 3 подавляет экспрессию гена ренина, блокируя элемент ответа на циклический AMP (CRE) посредством прямого связывания VDR с CRE-связывающим белком (CREB) и, таким образом, ингибируя связывание CREB с CRE (Yuan et al., 2007). По сложному механизму 1α, 25 (OH) 2 D 3 также регулирует несколько факторов транскрипции Forkhead box (FOX). VDR, активируемый лигандом, связывает FOXO3a и FOXO4 вместе с их регуляторами, сиртуин-1-деацетилазой и протеинфосфатазой 1, вызывая деацетилирование и дефосфорилирование белков FOXO, тем самым активируя их (An et al., 2010). В случае белка-супрессора опухоли p53 имеет место взаимная регуляция: в то время как мутированный p53 физически взаимодействует с VDR и изменяет гены-мишени VDR, превращая 1α, 25 (OH) 2 D 3 из проапоптотического в ген антиапоптотический агент (Стамболский и соавт., 2010), 1α, 25 (OH) 2 D 3 активирует промотор Mdm2 p53-зависимым образом, способствуя экспрессии этого негативного регулятора стабильности и функции белка p53 (Chen et al., 2013).

    Описаны множественные взаимодействия между 1α, 25 (OH) 2 D 3 / VDR и другими лигандами ядерных рецепторов. Среди них перекрестные помехи между лигандом VDR и рецептором, активируемым пролифератором пероксисом (PPAR) -α / δ в клетках меланомы (Sertznig et al., 2009a, b), которые могут включать стимуляцию экспрессии PPAR-δ с помощью 1α, 25 (OH) 2 D 3 (Dunlop et al., 2005). Синергическое действие 1α, 25 (OH) 2 D 3 и розиглитазона, лиганда PPAR-γ, было показано во время опосредованной остеобластами минерализации (Woeckel et al., 2013a), тогда как в клетках рака молочной железы T47D человека PPAR-γ связывает VDR и репрессирует его транскрипционную активность, возможно, также за счет конкуренции за гетеродимеризацию RXR (Alimirah et al., 2012). Титрование общих коактиваторов, но не RXR, может быть механизмом, с помощью которого связанный с лигандом VDR репрессирует трансактивацию рецептора ретиноевой кислоты (RAR) в клетках гипофиза Gh5C1 (Jiménez-Lara and Aranda, 1999).Связь между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и ретиноевой кислотой, однако, сложна, поскольку кооперативные эффекты на гены-мишени и клеточный результат (ингибирование пролиферации и дифференцировка) были описаны в других системах (Tavera-Mendoza et al. ., 2006; Ананд и др., 2008; Нг и др., 2010). Что касается рецептора эстрогена (ER), группа Д. Фельдмана показала, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 оказывает многоуровневый защитный эффект против рака груди, который включает ингибирование синтеза эстрогена посредством прямого и косвенного подавления ароматазы (CYP19) и подавление экспрессии ER-α посредством двух VDRE в его промоторной области (Krishnan et al., 2010; Свами и др., 2013). Точно так же существует сложная и нерешенная взаимосвязь между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и синтезом и передачей сигналов рецептора андрогенов (AR). 1α, 25 (OH) 2 D 3 индуцирует AR в клетках LNCaP (Zhao et al., 1999), в то время как AR снижает транскрипционную активность VDR (Ting et al., 2005), возможно, в некоторых клетках по механизму, опосредованному prohibitin (Mooso et al., 2010). Кроме того, 1α, 25 (OH) 2 D 3 ингибирует глюкуронизацию и, таким образом, инактивацию андрогена в клетках рака простаты посредством репрессии UDP-глюкуронозилтрансфераз (UGT) 2B15 и 2B17, что противоречит здравому смыслу с учетом действия, стимулирующего рост. андрогена и антипролиферативный эффект 1α, 25 (OH) 2 D 3 в клетках рака простаты (Kaeding et al., 2008). В мочевом пузыре человека 1α, 25 (OH) 2 D 3 и аналоги ингибируют пролиферацию клеток, стимулируемую андрогеном и фактором роста кератиноцитов, и индуцируют апоптоз, по крайней мере частично, подавляя экспрессию Bcl-2 (Crescioli et al., 2005) .

    Фактор транскрипции гипофиза (Pit) -1 активирует гены гормона роста и пролактина в передней доле гипофиза, а также в клетках рака груди (Seoane and Pérez-Fernández, 2006). В клетках MCF7 гомодимеры VDR связывают промотор PIT-1 и ингибируют его экспрессию в присутствии 1α, 25 (OH) 2 D 3 без участия RXR (Seoane and Pérez-Fernández, 2006).

    Выводы

    Имеющиеся данные показывают, что классический взгляд на VDR только как на ядерно-действующий лиганд-модулируемый фактор транскрипции, который регулирует скорость транскрипции тех генов, с которыми он связывается, устарел. Вместо этого VDR и его лиганд составляют многоуровневый главный регулятор экспрессии генов в высших клетках, действующий прямо или косвенно и посредством множества различных механизмов на многие пути передачи сигналов. Некоторые из них запускаются из плазматической мембраны паракринными или эндокринными агентами, а 1α, 25 (OH) 2 D 3 взаимодействует на разных уровнях: мембранные рецепторы, цитозольные сигнальные молекулы или эффекторные факторы ядерной транскрипции.В большинстве случаев действие 1α, 25 (OH) 2 D 3 опосредовано ядерным VDR, но в некоторых других случаях это неясно, и были предложены неканонические VDR-независимые или внеядерные эффекты. Доступные исследования показывают, что 1α, 25 (OH) 2 D 3 и эти сигнальные пути взаимодействуют по-разному и с разными исходами специфично для клетки / ткани, а иногда также по-разному между нормальными и злокачественными клетками.

    Перспективы

    Растущее признание важности его не-клеточных автономных действий расширило рамки исследования 1α, 25 (OH) 2 D 3 .С одной стороны, необходимо углубленное изучение взаимодействия между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и другими агентами, которое кажется клеточно-специфичным с точки зрения биологического результата, необходимо для выяснения возможностей комбинированной терапии с использованием соединений витамина D и ингибиторов или активаторов различных сигнальных путей. С другой стороны, некоторые из этих взаимодействий происходят на межклеточном уровне. Используя высокопроизводительные методы и анализ на уровне всего генома, мы ожидаем, что сможем идентифицировать секретируемые паракринные и внутриклеточные медиаторы взаимодействия между 1α, 25 (OH) 2 D 3 и другими сигнальными путями, ответственными за регуляторные действия. 1α, 25 (OH) 2 D 3 в организме.Будущие исследования должны быть направлены на определение того, как соединения витамина D влияют на физиологию тканей и органов и как их можно использовать для лечения патологических процессов, таких как инфекции, аутоиммунные заболевания или рак.

    Авторские взносы

    Рукопись написали Мария Хесус Ларриба, Хосе Мануэль Гонсалес-Санчо, Феликс Бонилья и Альберто Муньос.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Мы благодарим Робина Райкрофта за его ценную помощь в подготовке английской рукописи. Работа в лаборатории авторов поддерживается Министерством экономики и конкуренции Испании (SAF2010-18302, BFU2010-19659), Региональным институтом Fondo Europeo de Desarrollo de Salud Carlos III (RD12 / 0036/0021, RD12 / 0036/0041). ) и Comunidad de Madrid (S2010 / BMD-2344, Colomics2).

    Список литературы

    Агилера, О., Пенья, К., Гарсия, Дж.М., Ларриба, М. Дж., Ордоньес-Моран, П., Наварро, Д. и др. (2007). Ген антагониста Wnt DICKKOPF-1 индуцируется 1α, 25-дигидроксивитамином D 3 , связанным с дифференцировкой клеток рака толстой кишки человека. Канцерогенез 28, 1877–1884. DOI: 10.1093 / carcin / bgm094

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Алимира, Ф., Пэн, X., Юань, Л., Мехта, Р. Р., фон Кнетен, А., Чубей, Д., и др. (2012). Перекрестные помехи между рецептором γ, активируемым пролифератором пероксисом (PPARγ) и рецептором витамина D (VDR) в клетках рака молочной железы человека: PPARγ связывается с VDR и ингибирует 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 -опосредованную трансактивацию. Exp. Ячейка Res . 318, 2490–2497. DOI: 10.1016 / j.yexcr.2012.07.020

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Алрой И., Тауэрс Т. Л. и Фридман Л. П. (1995). Репрессия транскрипции гена интерлейкина-2 витамином D 3 : прямое ингибирование образования комплекса NFATp / AP-1 рецептором ядерного гормона. Мол. Клетка. Биол . 15, 5789–5799.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Альварес-Диас, С., Валле, Н., Феррер-Майорга, Г., Ломбардия, Л., Эррера, М., Домингес, О. и др. (2012). МикроРНК-22 индуцируется витамином D и способствует его антипролиферативному, антимиграционному и генному регуляторному действию в клетках рака толстой кишки. Hum. Мол. Genet . 21, 2157–2165. DOI: 10.1093 / hmg / dds031

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ан, Б. С., Тавера-Мендоза, Л. Е., Димитров, В., Ван, X., Кальдерон, М. Р., Ван, Х. Дж. И др. (2010). Стимуляция функции белка FoxO, регулируемой Sirt1, лиганд-связанным рецептором витамина D. Мол. Клетка. Биол . 30, 4890–4900. DOI: 10.1128 / MCB.00180-10

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ананд П. К., Каул Д. и Шарма М. (2008). Синергетическое действие витамина D и ретиноевой кислоты ограничивает вторжение в макрофаги патогенных микобактерий. J. Microbiol. Иммунол. Заразить . 41, 17–25.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Андл, К. Д., Рустги, А. К. (2005). Никакой улицы с односторонним движением: перекрестная связь между E-кадгерином и рецепторной тирозинкиназой (RTK): механизм регулирования активности RTK. Cancer Biol. Ther . 4, 28–31. DOI: 10.4161 / cbt.4.1.1431

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Барбахано, А., Ордоньес-Моран, П., Гарсия, Дж. М., Санчес, А., Перейра, Ф., Ларриба, М. Дж. И др. (2010). SPROUTY-2 и E-кадгерин взаимно регулируют и определяют опухолевость клеток рака толстой кишки. Онкоген 29, 4800–4813. DOI: 10.1038 / onc.2010.225

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Бен-Шошан, М., Амир, С., Данг, Д. Т., Данг, Л. Х., Вейсман, Ю., и Мабджиш, Н. Дж. (2007). 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 (кальцитриол) ингибирует путь индуцируемого гипоксией фактора-1 / фактора роста эндотелия сосудов в раковых клетках человека. Мол. Рак Тер . 6, 1433–1439. DOI: 10.1158 / 1535-7163.MCT-06-0677

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Бийлсма, М. Ф., Спек, К. А., Живкович, Д., ван де Уотер, С., Резаи, Ф., и Пеппеленбош, М. П. (2006).Подавление сглаженной патч-зависимой (про) секрецией витамина D 3 . ПЛоС Биол . 4: e232. DOI: 10.1371 / journal.pbio.0040232

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Бикл, Д. Д., Элали, Х., Уэлш, Дж., О, Д., Кливер, Дж., И Тейхерт, А. (2013). Защитная роль передачи сигналов витамина D в формировании рака кожи. J. Steroid Biochem. Мол. Биол . 136, 271–279. DOI: 10.1016 / j.jsbmb.2012.09.021

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Brosseau, C., Пирианов, Г., Колстон, К. В. (2013). Роль белка-3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, в апоптозе клеток рака молочной железы, индуцированном 1,25-дигидроксивитамином-D 3 . Внутр. J. Cell Biol . 2013, 960378. DOI: 10.1155 / 2013/960378

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Брюггеманн, Л. В., Кейроз, К. К., Замани, К., ван Страатен, А., Спек, К. А., и Бийлсма, М. Ф. (2010). Оценка эффективности витамина D 3 ингибитора пути hedgehog на мышиной модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы. Cancer Biol. Ther . 10, 79–88. DOI: 10.4161 / cbt.10.1.12165

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Брунс, Д. Э., Кришнан, А. В., Фельдман, Д., Грей, Р. В., Кристакос, С., Хирш, Г. Н. и др. (1989). Эпидермальный фактор роста увеличивает кишечные рецепторы кальбиндина-D9k и 1,25-дигидроксивитамина D у новорожденных крыс. Эндокринология 125, 478–485. DOI: 10.1210 / эндо-125-1-478

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Кардус, А., Panizo, S., Encinas, M., Dolcet, X., Gallego, C., Aldea, M., et al. (2009). 1,25-дигидроксивитамин D 3 регулирует продукцию VEGF через элемент ответа на витамин D в промоторе VEGF. Атеросклероз 204, 85–89. DOI: 10.1016 / j.atherosclerosis.2008.08.020

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Карлберг, К., Кэмпбелл, М. Дж. (2013). Механизмы передачи сигналов рецептора витамина D: интегрированные действия четко определенного фактора транскрипции. Стероиды 78, 127–136. DOI: 10.1016 / j.steroids.2012.10.019

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Chattopadhyay, N., MacLeod, R.J., Tfelt-Hansen, J., and Brown, E.M. (2003). 1α, 25 (OH) 2 -витамин D 3 подавляет синтез и секрецию HGF клетками остеосаркомы человека MG-63. г. J. Physiol. Эндокринол. Метаб . 284, E219 – E227. DOI: 10.1152 / ajpendo.00247.2002

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чен, А., Дэвис, Б. Х., Биссоннетт, М., Скаглионе-Сьюэлл, Б., и Бразитус, Т. А. (1999). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 стимулирует дифференцировку клеток Caco-2, зависимую от белка-активатора-1. J. Biol. Chem . 274, 35505–35513. DOI: 10.1074 / jbc.274.50.35505

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чен А., Дэвис Б. Х., Ситрин М. Д., Бразитус Т. А. и Биссоннетт М. (2002). Передача сигнала трансформирующего фактора роста β 1 способствует ингибированию роста клеток Caco-2, индуцированному 1,25 (OH) 2 D 3 . г. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol . 283, G864 – G874. DOI: 10.1152 / ajpgi.00524.2001

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Chen, H., Reed, G., Guardia, J., Lakhan, S., Couture, O., Hays, E., et al. (2013). Витамин D напрямую регулирует экспрессию гена Mdm2 в остеобластах. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 430, 370–374. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2012.11.003

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чен, К., Энлле, К. К., Кертис, К. М., Роос, Б. А., и Ховард, Г. А. (2012). Фактор роста гепатоцитов (HGF) и 1,25-дигидроксивитамин D вместе стимулируют стволовые клетки костного мозга человека в направлении остеогенного фенотипа посредством HGF-индуцированной регуляции VDR. Кость 51, 69–77. DOI: 10.1016 / j.bone.2012.04.002

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чен К., Перес-Стейбл К., Д’Ипполито Г., Шиллер П. К., Роос Б. А. и Ховард Г. А. (2011).Пролиферация стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, ингибируется фактором роста гепатоцитов за счет увеличения ингибиторов клеточного цикла p53, p21 и p27. Кость 49, 1194–1204. DOI: 10.1016 / j.bone.2011.08.023

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Crescioli, C., Morelli, A., Adorini, L., Ferruzzi, P., Luconi, M., Vannelli, G. B., et al. (2005). Мочевой пузырь человека как новая мишень для лигандов рецепторов витамина D. J. Clin. Эндокринол. Метаб .90, 962–972. DOI: 10.1210 / jc.2004-1496

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Cui, J., Ma, C., Qiu, J., Ma, X., Wang, X., Chen, H., et al. (2011). Новое взаимодействие между белком-6, связывающим инсулиноподобный фактор роста, и рецептором витамина D подавляет роль витамина D 3 в дифференцировке остеобластов. Мол. Клетка. Эндокринол . 338, 84–92. DOI: 10.1016 / j.mce.2011.03.011

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Деспре, П.Ю., Пужоль, Д., Фалетт, Н., Лефевр, М. Ф., и Саез, С. (1991). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 увеличивает экспрессию гена рецептора эпидермального фактора роста в клетках карциномы молочной железы BT-20. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 176, 1–6. DOI: 10.1016 / 0006-291X (91) -G

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Динг, Н., Ю, Р. Т., Субраманиам, Н., Шерман, М. Х., Уилсон, К., Рао, Р. и др. (2013). Рецептор витамина D / геномный контур SMAD блокирует фиброзный ответ печени. Cell 153, 601–613. DOI: 10.1016 / j.cell.2013.03.028

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Д’Ипполито, Г., Шиллер, П. К., Перес-Стейбл, К., Балкан, В., Роос, Б. А., и Ховард, Г. А. (2002). Совместное действие фактора роста гепатоцитов и 1,25-дигидроксивитамина D 3 в остеобластической дифференцировке стромальных клеток костного мозга позвоночника человека. Кость 31, 269–275. DOI: 10.1016 / S8756-3282 (02) 00820-7

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Данлоп, Т.В., Вайсанен, С., Франк, К., Мольнар, Ф., Синкконен, Л., и Карлберг, К. (2005). Ген δ-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом человека, является первичной мишенью для 1α, 25-дигидроксивитамина D 3 и его ядерного рецептора. J. Mol. Биол . 349, 248–260. DOI: 10.1016 / j.jmb.2005.03.060

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Фабри, М., Стенгер, С., Шин, Д. М., Юк, Дж. М., Лю, П. Т., Реалегено, С., и др. (2011). Витамин D необходим для опосредованной IFN-γ антимикробной активности макрофагов человека. Sci. Пер. Мед . 3, 104ra102. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3003045

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гарсия, Л. А., Феррини, М. Г., Норрис, К. К., и Артаза, Дж. Н. (2013). 1,25 (OH) 2 витамин D 3 усиливает миогенную дифференцировку, модулируя экспрессию ключевых ангиогенных факторов роста и ангиогенных ингибиторов в клетках скелетных мышц C 2 C 12 . J. Steroid Biochem. Мол. Биол .133, 1–11. DOI: 10.1016 / j.jsbmb.2012.09.004

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гарсия, Л. А., Кинг, К. К., Феррини, М. Г., Норрис, К. К., и Артаза, Дж. Н. (2011). 1,25 (OH) 2 витамин D 3 стимулирует миогенную дифференцировку, подавляя пролиферацию клеток и модулируя экспрессию промиогенных факторов роста и миостатина в клетках скелетных мышц C2C12. Эндокринология 152, 2976–2986. DOI: 10.1210 / en.2011-0159

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гельдмейер-Хилт, К., Гейне, Г., Хартманн, Б., Баумграсс, Р., Радбрух, А., и Ворм, М. (2011). 1,25-дигидроксивитамин D 3 нарушает активацию NF-κB в наивных В-клетках человека. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 407, 699–702. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2011.03.078

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гупиль Д., Этье К., Зарнегар Р. и Гаскон-Барре М. (1997). Экспрессия в печени маркерных генов регенерации после частичной гепатэктомии у крысы. Влияние 1,25-дигидроксивитамина D 3 при гипокальциемии. Дж. Гепатол . 26, 659–668.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Грубер, Х. Э., Хельшер, Г., Ингрэм, Дж. А., Чоу, Ю., Лёффлер, Б., и Хэнли, Э. Н. мл. (2008). 1,25 (OH) 2 -витамин D 3 ингибирует пролиферацию и снижает продукцию хемоаттрактантного белка-1 моноцитов, тромбопоэтина, VEGF и ангиогенина клетками кольца человека in vitro . Позвоночник 33, 755–765. DOI: 10.1097 / BRS.0b013e3181695d59

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Грамблз, Р.М., Хауэлл, Д. С., Венгер, Л., Альтман, Р. Д., Ховард, Г. А., и Роос, Б. А. (1996). Фактор роста гепатоцитов и его действие на хондроциты пластинки роста. Кость 19, 255–261. DOI: 10.1016 / 8756-3282 (96) 00180-9

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Grundmann, M., Haidar, M., Placzko, S., Niendorf, R., Darashchonak, N., Hubel, C.A., et al. (2012). Витамин D улучшает ангиогенные свойства эндотелиальных клеток-предшественников. г. Дж.Physiol. Cell Physiol . 303, C954 – C962. DOI: 10.1152 / ajpcell.00030.2012

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гуань, Х., Лю, К., Чен, З., Ван, Л., Ли, К., Чжао, Дж. И др. (2013). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 усиливает экспрессию hsa-let-7a-2 посредством взаимодействия VDR / VDRE в клетках рака легких человека A549. Ген 522, 142–146. DOI: 10.1016 / j.gene.2013.03.065

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Гюнтер, П., Торопайнен, С., Матилайнен, Дж. М., Сойтер, С., Карлберг, К., и Вяйсянен, С. (2011). Механизм 1α, 25-дигидроксивитамина D 3 -зависимая репрессия интерлейкина-12B. Биохим. Биофиз. Acta 1813, 810–818. DOI: 10.1016 / j.bbamcr.2011.01.037

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Harant, H., Wolff, B., and Lindley, I.J. (1998). 1α, 25-Дигидроксивитамин D 3 снижает связывание ДНК ядерного фактора-κB в фибробластах человека. FEBS Lett . 436, 329–334. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (98) 01153-3

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Huang, Y.-C., Chen, J.-Y., and Hung, W.-C. (2004). Комплекс витамина D 3 рецептор / Sp1 необходим для индукции экспрессии p27 KIP1 витамином D 3 . Онкоген 23, 4856–4861. DOI: 10.1038 / sj.onc.1207621

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Хуанг, Ю.-C., И Hung, W.-C. (2006). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 транскрипционно подавляет экспрессию p45 Skp2 через сайты Sp1 в клетках рака простаты человека. J. Cell. Physiol . 209, 363–369. DOI: 10.1002 / jcp.20741

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Инаба, М., Кояма, Х., Хино, М., Окуно, С., Терада, М., Нисидзава, Ю. и др. (1993). Регулирование высвобождения фактора роста гепатоцитов из клеток промиелоцитарного лейкоза человека, HL-60, 1,25-дигидроксивитамином D 3 , 12-O-тетрадеканоилфорбол 13-ацетатом и дибутирилциклическим аденозинмонофосфатом. Кровь 82, 53–59.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Иноуэ Т., Камияма Дж. И Сакаи Т. (1999). Sp1 и NF-Y синергетически опосредуют действие витамина D 3 на промотор гена p27 KIP1 , в котором отсутствуют ответные элементы витамина D. J. Biol. Chem . 274, 32309–32317. DOI: 10.1074 / jbc.274.45.32309

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Jiang, Y.J., Teichert, A.E., Fong, F., Ода, Ю., Бикл, Д. Д. (2012). 1α, 25 (OH) 2 -Дигидроксивитамин D 3 / VDR защищает кожу от образования опухоли, вызванного УФ-В, путем взаимодействия с путем β-катенина. J. Steroid Biochem. Мол. Биол . 136, 229–232. DOI: 10.1016 / j.jsbmb.2012.09.024

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Хименес-Лара, А. М., и Аранда, А. (1999). Витамин D подавляет зависимую от ретиноевой кислоты трансактивацию промотора β2 рецептора ретиноевой кислоты: домен AF-2 рецептора витамина D необходим для трансрепрессии. Эндокринология 140, 2898–2907. DOI: 10.1210 / endo.140.6.6770

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Kaeding, J., Belanger, J., Caron, P., Verreault, M., Belanger, A., and Barbier, O. (2008). Кальцитрол (1α, 25-дигидроксивитамин D 3 ) подавляет глюкуронирование андрогенов в клетках рака простаты. Мол. Рак Тер . 7, 380–390. DOI: 10.1158 / 1535-7163.MCT-07-0455

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Калер, П., Аугенлихт, Л., и Клампфер, Л. (2009). ИЛ-1β, полученный из макрофагов, стимулирует передачу сигналов Wnt и рост клеток рака толстой кишки: перекрестные помехи прерываются витамином D 3 . Онкоген 28, 3892–3902. DOI: 10.1038 / onc.2009.247

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Kasiappan, R., Shen, Z., Tse, A.K., Jinwal, U., Tang, J., Lungchukiet, P., et al. (2012). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 подавляет экспрессию теломеразы и рост рака человека через микроРНК-498. J. Biol. Chem . 287, 41297–41309. DOI: 10.1074 / jbc.M112.407189

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Костарас, Э., Сфломос, Г., Педерсен, Н. М., Стенмарк, Х., Фоцис, Т., и Мерфи, К. (2013). SARA и RNF11 взаимодействуют друг с другом и коровыми белками ESCRT-0 и регулируют деградационный трафик EGFR. Онкоген 32, 5220–5232. DOI: 10.1038 / onc.2012.554

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Коваленко, П.Л., Чжан, З., Цуй, М., Клинтон, С. К., и Флит, Дж. К. (2010). 1,25-дигидроксивитамин D-опосредованная оркестровка противоопухолевых эффектов на уровне транскрипта в иммортализованной, нетрансформированной эпителиальной клеточной линии простаты, RWPE1. BMC Genomics 11:26. DOI: 10.1186 / 1471-2164-11-26

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Кришнан А. В., Фельдман Д. (2010). Молекулярные пути, опосредующие противовоспалительные эффекты кальцитриола: значение для химиопрофилактики и лечения рака простаты. Endocr. Relat. Рак 17, R19 – R38. DOI: 10.1677 / ERC-09-0139

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Кришнан, А.В., Свами, С., Пэн, Л., Ван, Дж., Морено, Дж., И Фельдман, Д. (2010). Тканевая селективная регуляция экспрессии ароматазы кальцитриолом: значение для терапии рака молочной железы. Эндокринология 151, 32–42. DOI: 10.1210 / en.2009-0855

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ларриба, М.Дж., Гонсалес-Санчо, Дж. М., Барбачано, А., Ниелл, Н., Феррер-Майорга, Г., и Муньос, А. (2013). Витамин D является многоуровневым репрессором передачи сигналов Wnt / β-катенина в раковых клетках. Раки 5, 1242–1260. DOI: 10.3390 / Cancers5041242

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Li, J., Jin, D., Fu, S., Mei, G., Zhou, J., Lei, L., et al. (2013). Белок-3, связывающий инсулиноподобный фактор роста, модулирует дифференцировку остеобластов посредством взаимодействия с рецептором витамина D. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 436, 632–637. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2013.04.111

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ли, П., Ли, К., Чжао, X., Чжан, X., Никосия, С. В., и Бай, В. (2004). p27 Стабилизация Kip1 и задержка G 1 1,25-дигидроксивитамином D 3 в раковых клетках яичников, опосредованная понижающей регуляцией циклина E / циклин-зависимой киназы 2 и белка Skp1-Cullin-F-box / Skp2 убиквитинлигаза. J. Biol. Chem . 279, 25260–25267. DOI: 10.1074 / jbc.M311052200

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ли Ю., Спатаро Б. К., Ян Дж., Дай К. и Лю Ю. (2005). 1,25-дигидроксивитамин D подавляет активацию почечных интерстициальных миофибробластов, индуцируя экспрессию фактора роста гепатоцитов. Почки Инт . 68, 1500–1510. DOI: 10.1111 / j.1523-1755.2005.00562.x

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Линь Р., Ван, Т. Т., Миллер, У. Х. и Уайт, Дж. Х. (2003). Ингибирование экспрессии белка F-Box p45 SKP2 и стабилизация ингибитора циклин-зависимой киназы p27 KIP1 в раковых клетках, обработанных аналогом витамина D. Эндокринология 144, 749–753. DOI: 10.1210 / en.2002-0026

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Лю П. Т., Шенк М., Уокер В. П., Демпси П. В., Канчанапуми М., Уилрайт М. и др. (2009). Конвергенция путей активации IL-1β и VDR в антимикробных ответах человека, индуцированных TLR2 / 1. PLoS ONE 4: e5810. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005810

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Лю П. Т., Стенгер С., Ли Х., Венцель Л., Тан Б. Х., Круцик С. Р. и др. (2006). Запуск Toll-подобным рецептором антимикробного ответа человека, опосредованного витамином D. Наука 311, 1770–1773. DOI: 10.1126 / science.1123933

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Людерер, Х. Ф., Гори, Ф., и Демей, М. Б. (2011). Лимфоидный энхансер-связывающий фактор-1 (LEF1) взаимодействует с ДНК-связывающим доменом рецептора витамина D. J. Biol. Chem . 286, 18444–18451. DOI: 10.1074 / jbc.M110.188219

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Малинен, М., Рюйнянен, Дж., Хейняниеми, М., Вяйсянен, С., и Карлберг, К. (2011). Циклическая регуляция гена белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, в ответ на 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 . Nucleic Acids Res . 39, 502–512. DOI: 10.1093 / nar / gkq820

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Matilainen, J. M., Husso, T., Toropainen, S., Seuter, S., Turunen, M. P., Gynther, P., et al. (2010a). Первичный эффект 1α, 25 (OH) 2 D 3 на экспрессию IL-10 в моноцитах — кратковременное подавление. Биохим. Биофиз. Acta 1803, 1276–1286. DOI: 10.1016 / j.bbamcr.2010.07.009

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Матилайнен, Я.М., Рясянен, А., Гюнтер, П., и Вяйсянен, С. (2010b). Гены, кодирующие цитокины IL-2, IL-10 и IL-12B, представляют собой первичные гены-мишени 1α, 25 (OH) 2 D 3 . J. Steroid Biochem. Мол. Биол . 121, 142–145. DOI: 10.1016 / j.jsbmb.2010.03.020

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Matilainen, M., Malinen, M., Saavalainen, K., and Carlberg, C. (2005). Регулирование генов нескольких белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста, с помощью 1α, 25-дигидроксивитамина D 3 . Nucleic Acids Res . 33, 5521–5532. DOI: 10.1093 / nar / gki872

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Маунд, С. Л., Барклай, В. В., Ховер, Л. Д., Аксанова, Л. С., Суи, Г., Хипп, Дж. Д. и др. (2011). Интерлейкин-1α опосредует антипролиферативные эффекты 1,25-дигидроксивитамина D 3 на клетки-предшественники / стволовые клетки простаты. Cancer Res . 71, 5276–5286. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-10-2160

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Мусо, Б., Мадхав, А., Джонсон, С., Рой, М., Мур, М. Е., Мой, С., и др. (2010). Андрогенная регуляция рецептора витамина D в ответ кастрационно-резистентных клеток рака простаты на 1α-гидроксивитамин D 5 — аналог кальцитриола. Genes Cancer 1, 927–940. DOI: 10.1177 / 19476015450

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Мутиан Г., Райквар Х. П., Раджасинг Дж. И Брайт Дж. Дж. (2006). 1,25 Дигидроксивитамин-D 3 модулирует путь JAK-STAT по оси IL-12 / IFNγ, приводя к ответу Th2 при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите. J. Neurosci. Res . 83, 1299–1309. DOI: 10.1002 / jnr.20826

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Mutt, S.J., Karhu, T., Lehtonen, S., Lehenkari, P., Carlberg, C., Saarnio, J., et al. (2012). Ингибирование секреции цитокинов из адипоцитов 1,25-дигидроксивитамином D 3 через путь NF-κB. FASEB J . 26, 4400–4407. DOI: 10.1096 / fj.12-210880

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Нг, К.Ю., Ма, М. Т., Люнг, К. К., Люн, П. С. (2010). Экспрессия рецепторов витамина D и витамина А и пролиферативные эффекты активации лигандом этих рецепторов на развитие клеток-предшественников поджелудочной железы, происходящих из поджелудочной железы плода человека. Стволовая клетка Ред. . 7, 53–63. DOI: 10.1007 / s12015-010-9146-1

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    О, Ю. С., Ким, Э. Дж., Шаффер, Б. С., Канг, Ю. Х., Биндеруп, Л., Макдональд, Р. Г. и др.(2001). Синтетические низкокальциемические аналоги витамина D 3 ингибируют секрецию инсулиноподобного фактора роста II и стимулируют выработку белка-6, связывающего инсулиноподобный фактор роста, в сочетании с подавлением роста клеток рака толстой кишки HT-29. Мол. Клетка. Эндокринол . 183, 141–149. DOI: 10.1016 / S0303-7207 (01) 00598-6

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Окуда, Н., Такеда, С., Шиномия, К., Мунета, Т., Ито, С., Нода, М., и др.(2007). ED-71, новый аналог витамина D, способствует образованию костей и ангиогенезу, а также подавляет резорбцию костей после абляции костного мозга. Кость 40, 281–292. DOI: 10.1016 / j.bone.2006.08.017

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Палмер, Х. Г., Гонсалес-Санчо, Дж. М., Эспада, Дж., Берчиано, М. Т., Пуиг, И., Баулида, Дж. И др. (2001). Витамин D 3 способствует дифференцировке клеток карциномы толстой кишки за счет индукции E-кадгерина и ингибирования передачи сигналов β-катенина. J. Cell Biol . 154, 369–387. DOI: 10.1083 / jcb.200102028

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Палмер, Х. Г., Санчес-Карбайо, М., Ордоньес-Моран, П., Ларриба, М. Дж., Кордон-Кардо, К., и Муньос, А. (2003). Генетические признаки дифференцировки, индуцированной 1α, 25-дигидроксивитамином D 3 в клетках рака толстой кишки человека. Cancer Res . 63, 7799–7806.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Пан, К., и Симпсон, Р.У. (1999). Белки, связывающие интронный элемент c-Myc, необходимы для 1,25-дигидроксивитамина D 3 регуляции c-myc во время дифференцировки клеток HL-60 и участия HOXB4. J. Biol. Chem . 274, 8437–8444. DOI: 10.1074 / jbc.274.13.8437

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Парих Г., Варадинова М., Суванди П., Араки Т., Розенвакс З., Порецкий Л. и др. (2010). Витамин D регулирует стероидогенез и выработку белка-1, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-1), в клетках яичников человека. Horm. Метаб. Res . 42, 754–757. DOI: 10.1055 / с-0030-1262837

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Кадан, Л. Р., Перес-Стейбл, К. М., Швалл, Р. Х., Бернштейн, К. Л., Остенсон, Р. К., Ховард, Г. А. и др. (2000). Фактор роста гепатоцитов и витамин D совместно ингибируют андроген-нечувствительные клеточные линии рака простаты. Эндокринология 141, 2567–2573. DOI: 10.1210 / endo.141.7.7546

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Райхрат, С.и Райхрат Дж. (2012). Нет доказательств индукции ключевых компонентов сигнального пути Notch (Notch-1, Jagged-1) обработкой UV-B, 1,25 (OH) 2 D 3 и / или эпигенетическими препаратами (TSA, 5-Aza) в кератиноцитах человека in vitro . Дерматоэндокринология 4, 44–52. DOI: 10.4161 / derm.19027

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Рен, З., Ли, В., Чжао, К., Ма, Л., и Чжу, Дж. (2012). Влияние 1,25-дигидроксивитамина D 3 на экспрессию фактора роста эндотелия сосудов и трансформирующего фактора роста β 1 в сетчатке крыс с диабетом. Diabetes Res. Clin. Прак . 98, 474–480. DOI: 10.1016 / j.diabres.2012.09.028

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Родилла В., Вильянуэва А., Обрадор-Хевиа А., Роберт-Морено А., Фернандес-Маджада В., Грилли А. и др. (2009). Jagged1 является патологическим звеном между путями Wnt и Notch при колоректальном раке. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 106, 6315–6320. DOI: 10.1073 / pnas.0813221106

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ryynänen, J., и Карлберг, К. (2013). Первичный 1,25-дигидроксивитамин D 3 ответ кластера генов интерлейкина 8 в человеческих моноцитоподобных и макрофагоподобных клетках. PLoS ONE 8: e78170. DOI: 10.1371 / journal.pone.0078170

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Салехи-Табар, Р., Нгуен-Ямамото, Л., Тавера-Мендоза, Л. Э., Перепел, Т., Димитров, В., Ан, Б. С. и др. (2012). Рецептор витамина D как главный регулятор сети c-MYC / MXD1. Proc.Natl. Акад. Sci. США . 109, 18827–18832. DOI: 10.1073 / pnas.1210037109

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Шаубер, Дж., Доршнер, Р. А., Кода, А. Б., Бухау, А. С., Лю, П. Т., Кикен, Д., и др. (2007). Повреждение усиливает функцию TLR2 и экспрессию антимикробного пептида через витамин D-зависимый механизм. J. Clin. Инвестируйте . 117, 803–811. DOI: 10.1172 / JCI30142

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Schlaeppi, J.М., Гуцвиллер, С., Финкенцеллер, Г., и Фурнье, Б. (1997). 1,25-Дигидроксивитамин D 3 индуцирует экспрессию фактора роста эндотелия сосудов в остеобластических клетках. Endocr. Res . 23, 213–229.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Шнабель, М., Фихтель, И., Гоцен, Л., и Шлегель, Дж. (2002). Дифференциальная экспрессия генов Notch в клетках остеобластов человека. Внутр. J. Mol. Мед . 9, 229–232.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Сеоане, С., и Перес-Фернандес, Р. (2006). Рецептор витамина D подавляет транскрипцию гена фактора транскрипции гипофиза Pit-1 без участия ретиноидного рецептора X. Мол. Эндокринол . 20, 735–748. DOI: 10.1210 / me.2005-0253

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Серцниг П., Данлоп Т., Зейферт М., Тильген В. и Райхрат Дж. (2009a). Перекрестная связь между сигналом рецептора витамина D (VDR) и рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR) в клетках меланомы. Anticancer Res . 29, 3647–3658.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Sertznig, P., Seifert, M., Tilgen, W., and Reichrath, J. (2009b). Активация сигнальных путей рецептора витамина D (VDR) и рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR), через 1,25 (OH) 2 D 3 в линиях клеток меланомы и других линиях клеток кожи. Дерматоэндокринология 1, 232–238. DOI: 10.4161 / derm.1.4.9629

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Шах, С., Islam, M. N., Dakshanamurthy, S., Rizvi, I., Rao, M., Herrell, R., et al. (2006). Молекулярная основа перекрестной регуляции рецептора витамина D и β-катенина. Мол. Cell 21, 799–809. DOI: 10.1016 / j.molcel.2006.01.037

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Shalhoub, V., Shatzen, E.M, Ward, S.C., Young, J. I., Boedigheimer, M., Twehues, L., et al. (2010). Модуляция хондро / остеобластов и сердечно-сосудистых генов в клетках гладких мышц артерий человека, которые кальцифицируются в присутствии фосфата и кальцитриола или парикальцитола. J. Cell. Биохим . 111, 911–921. DOI: 10.1002 / jcb.22779

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Шен, К., и Христакос, С. (2005). Рецептор витамина D, Runx2 и сигнальный путь Notch взаимодействуют в регуляции транскрипции остеопонтина. J. Biol. Chem . 280, 40589–40598. DOI: 10.1074 / jbc.M504166200

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Шен, X., Мула, Р. В. Р., Ли, Дж., Вейгель, Н. Л., и Фальзон, М. (2007). PTHrP способствует антипролиферативным и регулирующим интегрин α6β4 эффектам 1,25-дигидроксивитамина D 3 . Стероиды 72, 930–938. DOI: 10.1016 / j.steroids.2007.08.003

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Стаал, А., Биркенхэгер, Дж. К., Полс, Х. А. П., Буурман, К. Дж., Винк-ван Вейнгаарден, Т., Кляйнекоорт, В. М. и др. (1994). Трансформирующий фактор роста β-индуцированная диссоциация между уровнем рецептора витамина D и действием 1,25-дигидроксивитамина D 3 в остеобластоподобных клетках. Костяной шахтер . 26, 27–42. DOI: 10.1016 / S0169-6009 (08) 80160-2

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Staal, A., Geertsma-Kleinekoort, W. M. C., Van Den Bemd, G. J. C. M., Buurman, C.J., Birkenhäger, J. C., Pols, H. A. P., et al. (1998). Регулирование продукции остеокальцина и резорбции костей 1,25-дигидроксивитамином D 3 в длинных костях мышей: взаимодействие с костными факторами роста TGF-β и IGF-I. J. Bone Miner.Res . 13, 36–43. DOI: 10.1359 / jbmr.1998.13.1.36

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Стаал, А., Ван Вийнен, А. Дж., Десаи, Р. К., Полс, Х. А. П., Биркенхэгер, Дж. К., Делука, Х. Ф. и др. (1996). Антагонистические эффекты трансформирующего фактора роста-β на витамин D 3 усиление транскрипции остеокальцина и остеопонтина: снижение взаимодействия комплексов рецептор витамина D / рецептор ретиноида X с элементами ответа витамина E. Эндокринология 137, 2001–2011.DOI: 10.1210 / endo.137.5.8612541

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Стамболски П., Табач Ю., Фонтемаджи Г., Вайс Л., Маор-Алони Р., Зигфрид З. и др. (2010). Модуляция ответа витамина D 3 ассоциированным с раком мутантом p53. Cancer Cell 17, 273–285. DOI: 10.1016 / j.ccr.2009.11.025

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Сунь, Дж., Конг, Дж., Дуан, Ю., Сзето, Ф. Л., Ляо, А., Мадара, Дж. Л. и др. (2006). Повышенная активность NF-κB в фибробластах, лишенных рецептора витамина D. г. J. Physiol. Эндокринол. Метаб . 291, E315 – E322. DOI: 10.1152 / ajpendo.00590.2005

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Свами, С., Кришнан, А. В., Пэн, Л., Лундквист, Дж., И Фельдман, Д. (2013). Трансрепрессия промотора рецептора эстрогена кальцитриолом в клетках рака груди человека через два отрицательных элемента ответа на витамин D. Endocr. Relat. Рак 20, 565–577. DOI: 10.1530 / ERC-12-0281

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Tang, J. Y., Xiao, T. Z., Oda, Y., Chang, K. S., Shpall, E., Wu, A., et al. (2011). Витамин D 3 подавляет передачу сигналов hedgehog и пролиферацию в базальноклеточных карциномах мышей. Рак Пред. Res . 4, 744–751. DOI: 10.1158 / 1940-6207.CAPR-10-0285

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Тавера-Мендоса, Л., Ван Т. Т., Лаллемант Б., Чжан Р., Нагай Ю., Бурдо В. и др. (2006). Конвергенция передачи сигналов витамина D и ретиноевой кислоты в общем элементе гормонального ответа. EMBO Rep . 7, 180–185. DOI: 10.1038 / sj.embor.7400594

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Торн, Дж. Л., Магуайр, О., Дойг, К. Л., Батталья, С., Фер, Л., Сушестон, Л. Е. и др. (2011). Эпигенетический контроль регулируемой VDR петли прямой связи, которая регулирует экспрессию и функцию p21 waf1 / cip1 в незлокачественных клетках простаты. Nucleic Acids Res . 39, 2045–2056. DOI: 10.1093 / nar / gkq875

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Тинг, Х. Дж., Бао, Б. Ю., Сюй, К. Л., и Ли, Ю. Ф. (2005). Корегуляторы андрогенных рецепторов опосредуют подавляющий эффект андрогенных сигналов на активность рецепторов витамина D. Эндокринная 26, 1–9. DOI: 10.1385 / ENDO: 26: 1: 001

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Тонг, В.-М., Хофер, Х., Эллингер, А., Петерлик, М., и Кросс, Х.С. (1999). Механизм антимитогенного действия витамина D в клетках карциномы толстой кишки человека: актуальность для подавления роста клеток, стимулированного эпидермальным фактором роста. Онкол. Res . 11, 77–84.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Тонг, В.-М., Каллай, Э., Хофер, Х., Хулла, В., Манхардт, Т., Петерлик, М., и др. (1998). Регулирование роста клеток рака толстой кишки человека эпидермальным фактором роста и 1,25-дигидроксивитамином D 3 опосредуется взаимной модуляцией экспрессии рецепторов. евро. J. Cancer 34, 2119–2125. DOI: 10.1016 / S0959-8049 (98) 00267-6

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Торопайнен, С., Вяйсянен, С., Хейккинен, С., и Карлберг, К. (2010). Подавление гена MYC человека ядерным гормоном 1α, 25-дигидроксивитамином D 3 связано с цикличностью корепрессоров и гистондеацетилаз. J. Mol. Биол . 400, 284–294. DOI: 10.1016 / j.jmb.2010.05.031

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Тауэрс, Т.Л., Стаева Т. П., Фридман Л. П. (1999). Механизм с двумя ударами для опосредованной витамином D3 репрессии транскрипции гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора: рецептор витамина D конкурирует за связывание ДНК с NFAT1 и стабилизирует c-Jun. Мол. Клетка. Биол . 19, 4191–4199.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Uhmann, A., Niemann, H., Lammering, B., Henkel, C., Hess, I., Nitzki, F., et al. (2011). Противоопухолевые эффекты кальцитриола при базальноклеточных карциномах включают ингибирование передачи сигналов hedgehog и индукцию передачи сигналов и дифференцировки рецептора витамина D. Мол. Рак Тер . 10, 2179–2188. DOI: 10.1158 / 1535-7163.MCT-11-0422

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Uhmann, A., Niemann, H., Lammering, B., Henkel, C., Hess, I., Rosenberger, A., et al. (2012). Кальцитриол подавляет передачу сигналов Hedgehog и индуцирует передачу сигналов и дифференцировку рецептора витамина D в модели эмбриональной рабдомиосаркомы на мышах с заплатками. Саркома 2012, 357040. DOI: 10.1155 / 2012/357040

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Винк-ван Вейнгаарден, Т., Pols, H.A.P., Buurman, C.J., Birkenhäger, J.C., и van Leeuwen, J.P.T.M. (1996). Ингибирование стимулированного инсулином и инсулиноподобным фактором роста-I роста клеток рака груди человека 1,25-дигидроксивитамином D 3 и аналогом витамина D 3 EB1089. евро. J. Cancer 32A, 842–848. DOI: 10.1016 / 0959-8049 (95) 00647-8

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ван, В. Л., Чаттерджи, Н., Читтур, С. В., Уэлш, Дж.и Теннисвуд М. П. (2011). Влияние 1α, 25 дигидроксивитамина D 3 и тестостерона на экспрессию миРНК и мРНК в клетках LNCaP. Мол. Рак 10, 58. doi: 10.1186 / 1476-4598-10-58

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Вёкель, В. Дж., Брюдигам, К., Коэдам, М., Чиба, Х., ван дер Эрден, Б. К. Дж., И ван Леувен, Дж. П. Т. М. (2013a). 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 и розиглитазон синергетически усиливают опосредованную остеобластами минерализацию. Ген 512, 438–443. DOI: 10.1016 / j.gene.2012.07.051

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Векель, В. Дж., Коэдам, М., ван де Пеппель, Дж., Чиба, Х., ван дер Эрден, Б. К. Дж., И ван Леувен, Дж. П. Т. М. (2012). Доказательства взаимодействия витамина D и интерферона-β в остеобластах человека с преобладанием 1α, 25-дигидроксивитамина D 3 над интерфероном-β в стимуляции минерализации. J. Cell. Physiol . 227, 3258–3266. DOI: 10.1002 / jcp.24020

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Вёкель, В. Дж., Ван дер Эрден, Б. К. Дж., Шрейдерс-Коэдам, М., Эйкен, М., и Ван Леувен, Дж. П. Т. М. (2013b). 1α, 25-дигидроксивитамин D 3 стимулирует выработку активина А для тонкой настройки индуцированной остеобластами минерализации. J. Cell. Physiol . 228, 2167–2174. DOI: 10.1002 / jcp.24388

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Ву, Ф.С., Zheng, S. S., Wu, L. J., Teng, L. S., Ma, Z. M., Zhao, W. H., et al. (2007). Кальцитриол подавляет рост гептоцеллюлярных клеточных линий MHCC97 путем подавления экспрессии c-met и ERK. Печень Инт . 27, 700–707. DOI: 10.1111 / j.1478-3231.2007.01487.x

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Янаги, Ю., Сузава, М., Кавабата, М., Миядзоно, К., Янагисава, Дж., И Като, С. (1999). Положительная и отрицательная модуляция функции рецептора витамина D путем преобразования передачи сигналов фактора роста-β через белки Smad. J. Biol. Chem . 274, 12971–12974.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Янагисава Дж., Янаги Ю., Масухиро Ю., Сузава М., Ватанабэ М., Касиваги К. и др. (1999). Конвергенция сигнальных путей трансформирующего фактора роста-β и витамина D на транскрипционных коактиваторах SMAD. Наука 283, 1317–1321.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Ю., X. П., Беллидо, Т., и Манолагас, С. К. (1995). Подавление уровня белка NF-κB в активированных лимфоцитах человека 1,25-дигидроксивитамином D 3 . Proc. Natl. Акад. Sci. США . 92, 10990–10994.

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст

    Юань, В., Пан, В., Конг, Дж., Чжэн, В., Сзето, Ф. Л., Вонг, К. Э. и др. (2007). 1,25-дигидроксивитамин D 3 подавляет транскрипцию гена ренина, блокируя активность элемента ответа циклического АМФ в промоторе гена ренина. J. Biol. Chem . 282, 29821–29830. DOI: 10.1074 / jbc.M705495200

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чжан, Г.Y., Cheng, T., Luan, Q., Liao, T., Nie, C.L., Zheng, X., et al. (2011). Витамин D: новый терапевтический подход для лечения келоидов, анализ in vitro . руб. Дж. Дерматол . 164, 729–737. DOI: 10.1111 / j.1365-2133.2010.10130.x

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Чжао, X. Y., Ли, Л. Х., Пил, Д. М., и Фельдман, Д. (1999). Индукция рецептора андрогена с помощью 1α, 25-дигидроксивитамина D 3 и 9-цис-ретиноевой кислоты в клетках рака простаты человека LNCaP. Эндокринология 140, 1205–1212. DOI: 10.1210 / endo.140.3.6561

    Pubmed Реферат | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Характеристика отдельных полинуклеотидных молекул с использованием мембранного канала

    Мы показываем, что электрическое поле может управлять одноцепочечной РНК и Молекулы ДНК через ионный канал диаметром 2,6 нм в липидном бислое. мембрана. Поскольку диаметр канала может вместить только один цепи РНК или ДНК, каждый полимер пересекает мембрану как расширенная цепочка, частично блокирующая канал. Прохождение каждого молекула обнаруживается как кратковременное уменьшение ионного тока, который продолжительность пропорциональна длине полимера.Блокада каналов может поэтому может использоваться для измерения длины полинуклеотида. С дальнейшим улучшения, метод в принципе может обеспечить прямое высокоскоростное обнаружение последовательности оснований в отдельных молекулах ДНК или РНК.

    Измерение ионного тока, проходящего через одиночные ионные каналы в биологических мембранах или плоских липидных бислоях является обычным делом нейробиология и биофизика (1, 2). Хотя большинство таких каналов проходят стробирование, зависимое от напряжения или лиганда (3, 4), несколько относительно больших ионные каналы, в том числе Staphylococcus aureus α-гемолизин (5, 6) и митохондриальный потенциал-зависимый анионный канал (7, 8), могут оставаться открытыми в течение длительных периодов времени, тем самым обеспечивая непрерывный ионный ток, протекающий через липидный бислой (9, 10).Мы рассудили, что трансмембранное напряжение, приложенное к постоянно открытому каналу соответствующий размер должен протягивать молекулы полианионной ДНК или РНК через канал в виде протяженных линейных цепочек, присутствие которых обнаружимо уменьшить или заблокировать нормальный ионный поток. Такие засоры должны сделать это можно использовать одноканальные записи для определения длины и, возможно, другие характеристики полимера.

    Полимеры со случайной спиралью ранее использовались для исследования канала размеры пор (8) и записи одноканального тока показывают, что небольшие полимеры полиэтиленгликоля разделяются на каналы, образованные аламетицин (11) или S.aureus α-гемолизин (12, 13). Недавний Исследования показывают, что белки также могут проходить через липидный бислой, перемещаясь по каналам транслокации белков, предположительно в развернутом виде, удлиненные цепи (14, 15, 16, 17, 18). При перемещении белка такие каналы электрически бесшумны; они восстанавливают свою ионную проницаемость только после транслоцирующий полипептид был удален из канала (18). Ионная проводимость крупных комплексов ядерных пор аналогична снижается при транслокации факторов транскрипции, хотя при этом если предполагается, что макромолекулы движутся через ядерную пору в сложенное состояние (19, 20).

    Чтобы определить, могут ли полимеры нуклеиновых кислот быть обнаружены измерения каналов, S. aureus α-гемолизин был использован для образуют единый канал через липидный бислой, разделяющий два буферные отсеки (21). Мономеры α-гемолизина самопроизвольно вставляются в липидные бислои (9) и собираются, образуя гептамерные трансмембранные каналы (6) диаметром 2,6 нм (L. Сонг, М. Р. Хобо, К. Шустак, С. Чели, Х. Бейли и Дж. Э. Гуо, личное сообщение).Каналы с этим размером должны быть достаточно большой, чтобы вместить диаметр расширенного, одноцепочечный полинуклеотид.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Измерения проводимости.

    Двухслойная мембрана из дифитаноил-ПК (Avanti Polar Lipids) образовался через Отверстие диаметром ≈0,1 мм в тефлоновой перегородке толщиной 25 мкм разделение двух заполненных буфером отсеков (№ 23, рисунок после исх. 21) каждый содержит 1.5 мл 1 М KCl, 5 мМ Hepes (pH 7,5). Каналы α-гемолизина были восстановлены в мембране путем добавления менее 1 мкг α-гемолизина в отсек, который мы обозначили как СНГ. Единичный канал обычно формируется в течение 5 мин. Чтобы предотвратить дальнейшее канала, цис-отсек был тщательно промыт свежий буферный раствор. Ток был преобразован в напряжение и усиливается либо Axopatch 200A (Axon Instruments, Foster City, CA) или усилителя патч-зажимов Dagan 3900A (Dagan Instruments, Миннеаполис).Сигнал был отфильтрован на уровне менее 3/8 дискретизации. скорость, которая обычно составляла 64000 выборок в секунду, с использованием параметра Frequency Устройства (Хаверхилл, Массачусетс) фильтр нижних частот Бесселя. Если не указано иное в противном случае данные были оцифрованы с использованием National Instruments (Austin, TX) 16-разрядная плата AT-MIO-16-X с использованием программ, написанных в лаборатории. windows / CVI (National Instruments). Двухслойный аппарат был экранирован от источников электрического и магнитного шума с помощью металлического бокса из μ-металла (Амунеал, Филадельфия).

    Полинуклеотиды.

    Для большинства наших экспериментов мы использовали полиуридиловая кислота (поли [U]), потому что этот гомополинуклеотид имеет минимальная вторичная структура или пара оснований (24), которые могут мешать с перемещением полимера. Доли поли [U] (сигма), приготовленные с полинуклеотидфосфорилазой, размер был выбран элюирование из агарозы после фракционирования электрофорезом в наличие формальдегида. Вся ДНК была синтезирована с использованием стандартных фосфорамидитовые методы. Хотя последовательность 150-нуклеотидной ДНК (CTCACCTATC CTTCCACTCA TTTTCCTTAA CCATTTCATT CACCCATCTC TTCACTCCAT CTATCACCTC CATACATACC CTCCATATTA CACTCCCATC ACTATCATTA TCTACATCCA TTACATCACT ACTCCTCACA CTACCATACC) был разработан для минимизации спаривания оснований. Ожидается, что в использованных нами неденатурирующих условиях этот полимер показали большую долю долгоживущих блокад, чем гомополимеры.Многие из этих блокад требовали устранения в кратчайшие сроки. изменение полярности. ДНК из 120 нуклеотидов для конкурентной ПЦР содержала та же последовательность, что и молекула из 150 нуклеотидов, но без остатков 97–126. Двухцепочечная ДНК, предназначенная для амплификации с помощью ПЦР с использованием того же праймеры в виде одноцепочечной ДНК длиной 150 нуклеотидов получали путем смешивания и отжиг синтетической 100-нуклеотидной смысловой цепи с ее 100-нуклеотидной антисмысловой прядь. Смысловая цепь из 100 нуклеотидов содержала ту же последовательность, что и Молекула из 150 нуклеотидов, но без остатков 49–98.

    Анализ ПЦР и подсчет блокад.

    Конкурентный анализ ПЦР (25) был проведен после амплификации (26), оптимизированной, чтобы избежать фаза плато. Для предотвращения потери ДНК путем адсорбции в транскамере стенок, 55 мкг / мл носителя поли [U] было добавлено в транс-камеру когда нужно было собрать ДНК для ПЦР-анализа. Продукты ПЦР были растворяется в 15% (общий мономер) акриламидном геле и окрашивается SYBR Green I (молекулярные зонды) для денситометрии.В экспериментах с 1–8 каналов количество блокад в пике 2 + пике 3 определялось подсчет индивидуальных блокад в течение нескольких 5-минутных периодов отбора проб на протяжении всего эксперимента; в эксперименте с 40 каналами количество блокад оценивалось умножением (пик 2 + пик 3 частота наблюдается с одним каналом) × (количество каналов в мембране) × (время подачи экспериментального напряжения).

    РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

    В отсутствие полимера приложение потенциала -120 мВ (цис отрицательная сторона) приводили к одноканальным токам, свободным от переходные процессы (рис.1). После добавления поли [U] в цис-камеру, многочисленные кратковременные токовые блокады произошел. Обычно масштабы блокад были большими ( ток снижен на 85–100%) и, в зависимости от длины полимера, блокады длились от нескольких сотен до нескольких тысяч микросекунд. Для данного размера полимера общее количество переходных блокад составляло прямо пропорциональна молярной концентрации полимера (не показана). В отсутствие поли [U] блокад практически не наблюдалось (рис.1) или если потенциал на бислое был обратным (не показано). Иногда после добавления полимера долгоживущие блокады нескольких секунд или более, которые можно сбросить, кратковременно уменьшив напряжение до 0, или изменив полярность потенциала. Мы предполагаем что эти неопределенно длительные блокировки были произведены, когда полинуклеотид введен, но не может полностью пройти через канал из-за запутывания вторичной структуры. Шкала времени в миллисекундах блокады также наблюдались в аналогичных экспериментах с поли [A], поли [С], поли [dT], поли [dC], а также с одноцепочечными синтетическая ДНК, состоящая из 150 нуклеотидов поли [dA, dT, dC] (см. Материалы и методы ).

    Олигомеры поли [U] вызывают временные блокады в токе одноканального α-гемолизина. У первой стрелки значок потенциал -120 мВ был приложен к мембране (цис-сторона отрицательный). Это напряжение привело к постоянному току -120 пА в поток. По второй стрелке — поли [U] со средней длиной 210 ​​оснований. перемешивают в цис-камеру до конечной концентрации 0,1 мг / мл. Полинуклеотиды вызывали кратковременные блокады тока. В На вставке (увеличенная шкала времени) показаны две типичные блокады. со сроками службы 300 и 1300 мкс.В целях иллюстрации, текущие записи с низким временным разрешением (отображается всего 4 секунды) здесь) были отфильтрованы цифровым способом с использованием экспоненциального сглаживания, перемещающегося средний алгоритм.

    Если блокады были вызваны транспортом протяженного линейного полинуклеотидов через канал, время жизни блокады должно быть пропорциональна длине полимера и обратно пропорциональна прикладной потенциал. Гистограмма текущего времени жизни блокады для поли [U] длиной 210 ​​нт показывает, что блокады группируются в три отчетливые пики (рис.2). Подобные гистограммы для выбранные поли [U] другого размера продемонстрировали, что среднее время жизни для пики 2 и 3 связаны с длиной полимера и обратно пропорциональны приложенный потенциал (рис. 3). С другой стороны, многочисленные быстрые блокады в пике 1 не зависели от полимерной длины (рис. 3 a ) или приложенного потенциала. Мы относим эти быстрая блокада пика 1 полимерам, которые столкнулись с каналом, или частично вошел, но не смог пройти канал. Таким образом, только блокады пиков 2 и 3, время жизни которых было пропорционально длина полимера, по-видимому, является результатом того, что полимеры пересекли канал.

    Характерные времена блокады каналов вызванный поли [U] (0,1 мг / мл; средняя длина 210 нт), подпадал под три четко выраженных пика. Среднее время жизни, соответствующее трем пики были определены путем подгонки суммы трех гауссиан к данные.

    Время жизни блокады каналов, вызванной поли [U], было пропорциональна ( a ) средней длине полимера и ( b ) обратно пропорционально приложенному напряжению. Сюжеты показать время жизни для ( a ) пиков 1 (+), 2 (□) и 3 (•) в экспериментах с использованием В = −120 мВ при выборе 13 различных размеров поли [U] s и ( b ) для пиков 2 (□) и 3 (•) с поли [U] средней длиной 215 н. напряжения.Хотя время жизни пика 1 оказалось не зависящим от приложенное напряжение (данные не показаны), поскольку этот срок службы (≈100 мкс) едва ли вдвое превышало временное разрешение нашего системы не исключена небольшая зависимость от напряжения.

    Хотя зависимость длины пиков 2 и 3 соответствовала представление о том, что полинуклеотид пересек канал как расширенный линейной цепи, мы были удивлены тем, что проход по каналу относительно монодисперсные неразветвленные полимеры могут вызывать блокады чья жизнь попала под два разных пика, которые содержали примерно равное количество событий.Объяснение наличия из этих двух пиков состоит в том, что характерные времена прохождения полимера в направлении от 3 ‘до 5’ может отличаться от такового в направлении от 5 ‘до 3’ направление. Если это правда, то физическая основа такой разницы остается быть объясненным.

    Диаметр канала α-гемолизина 2,6 нм, по-видимому, слишком велик. узкий, чтобы позволить прохождение двухцепочечных полинуклеотидов, потому что двухцепочечная ДНК с тупым концом вырабатывала только быстрые блокады аналогично событиям пика 1.Мы также испытали смеси, содержащие равные концентрации поли [A] различной длины с поли [U] или разнообразными длина поли [dC] с поли [dG]. Такие препараты будут содержать много основные парные области, окруженные непарными одноцепочечными концами, которые могут входить в каналы, но останавливаться в области парных баз. В виде Ожидается, что эти приготовления произвели неопределенно длительные блокады, которые необходимо сбросить полярность напряжения.

    Чтобы продемонстрировать, что блокады были связаны с ДНК, пересекающей каналов, мы провели эксперименты по сравнению количества блокад наблюдается в пиках 2 и 3 с количеством одноцепочечных молекул которые фактически прошли бислой от цис-камеры до транс-камеры.Воспользовавшись нашим наблюдением, что двухцепочечная ДНК не может через канал α-гемолизина, мы использовали двухцепочечную ДНК в качестве внутренний контроль на случай непреднамеренного загрязнения транс-камеры. Результаты (таблица 1 и рис. 4) показал, что количество одноцепочечной ДНК в транс-камере приблизительное количество, которое мы оценили, должно было иметь накоплено. Одноцепочечная ДНК, обнаруженная в транс-камере, могла не быть результатом загрязнения аэрозолем или утечек из цис камеры, потому что такое загрязнение привело бы примерно к такое же соотношение одноцепочечной ДНК длиной 150 нуклеотидов и двухцепочечной ДНК длиной 100 нуклеотидов в транс-камере как в цис-камере.Это явно не было корпус (рис. 4, дорожки 1, 2). Поскольку количество одноцепочечных молекул, которые накапливались в транс-камере, зависели от количества каналов в мембране и была пропорциональна общему количеству пик 2 и пик 3 блокады, значительное движение одноцепочечных ДНК через сам липидный бислой, а не через каналы, можно было исключить.

    Транспортировка ДНК через каналы α-гемолизина

    Одноцепочечная ДНК, пересекающая α-гемолизин поры.ПЦР-амплифицированный продукт (дорожка 1) 40 мкл образца транс-камеры по сравнению с (дорожка 2) аналогичным образом усиленным продуктом 10 9 -кратно разбавленный образец цис-камеры. Все образцы были взяты после 8-канального эксперимента, в котором смесь 150-нуклеотидная однониточная ДНК (см. Материалы и методы ) и 100-нуклеотидная двухцепочечная ДНК была добавлена ​​в цис-камеру. Материал в транскамерном образце отражает накопление при нанесении -120 мВ (отрицательная цис-камера) в течение 42 мин.Дорожки 3-7: пример конкурентный ПЦР-анализ (25), чтобы показать накопление одноцепочечных молекулы в транс-камере. Результаты показывают, что 40 мкл использованный здесь образец содержал ≈400 однонитевых цепей длиной 150 н. молекулы. К каждому из пяти 40 мкл проб транскамеры помещали смешанные (дорожки 3–7) 0, 100, 200, 400 или 800 молекул конкурирующего 120-нуклеотидная ДНК, которая была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием тех же праймеров, что и 150-нуклеотидная ДНК. ДНК. Положение амплифицированных 150-, 120- и 100-нуклеотидных полимеров следующее: показано слева.Дорожки 1 и 3 показывают независимо усиленные 40 мкл образцы той же транскамеры.

    Пока мы еще не установили количественное соотношение между молярная концентрация полимера и скорость блокады для широкого диапазона размеров полимера, мы заметили, что количество блокад в минуту из коротких (≈200 нт) полимеров значительно превышала количество произведенных эквимолярных концентраций более длинных (≈1000 нт) полимеры. Эти наблюдения предполагают, что частота блокады может быть используется как особо чувствительный монитор гидролиза полинуклеотидов.Например, гидролиз длинных полимеров рибонуклеазой увеличил бы скорость блокады за счет одновременного увеличения молярного концентрирование и уменьшение размеров полимеров. Действительно, на добавление рибонуклеазы А в цис-компартмент, содержащий поли [U] произошло резкое увеличение скорости блокады до тех пор, пока полимер размеры фрагментов упали ниже временного разрешения приборов, после чего частота обнаруженных блокад снижалась до тех пор, пока дальнейших блокад не наблюдалось (рис.5). При добавлении свежего поли [U] в цис-камеру произошел выброс снова наблюдались блокады (не показаны), демонстрирующие, что канал все еще был способен обнаруживать индуцированные полимером блокады и эта активная рибонуклеаза осталась в цис-камере. Рибонуклеаза имела не действует, когда poly [U] был заменен на poly [A], который не является субстрат для рибонуклеазы А. Таким образом, начальное усиление блокады скорость нельзя отнести к действию РНКазы на бислой или канал. Мы пришли к выводу, что анализ частоты блокад может дать новый и быстрое измерение ферментативной активности.

    Ферментативный гидролиз поли [U] вызвал временное увеличение скорости олигонуклеотид-индуцированного канала блокады. В двух отдельных экспериментах в момент времени 0 рибонуклеаза А (бычья панкреатическая РНКаза типа XII-A; Sigma или Worthington) была добавлена ​​к цис-камера, содержащая 0,13 мг / мл поли [U] (•) (средняя длина, 1100 нуклеотидов) или 0,27 мг / мл поли [A] (□) (среднее длина — 20000 нт; Флука). Конечные концентрации рибонуклеазы были 0,04 мг / мл (поли [U] эксперимент) или 0,13 мг / мл (поли [A] эксперимент).Показатели блокады рассчитывались по одному каналу. записи. На вставке показаны (пустые) / 1; 3-секундные образцы трассы. для эксперимента поли [U] до ( Верхний ) и ≈30 сек после ( Нижний ) добавления рибонуклеазы. Похожий эксперименты с образцом поли [U] большей длины (3000 нт) дали результаты сопоставимы с результатами, полученными для 1100-нт поли [U]. В ток был оцифрован с помощью рекордера SONY / Dagan DAT на уровне 48000 точек / сек.

    Открытие того, что полинуклеотид можно легко провести через один четко определенный канал обеспечивает простую систему измерения управляемое движение полимеров через ограничения, основная проблема лежащие в основе многих биологических процессов, а также гель-электрофорез (27).Недавние теории транслокации полимера через один мембранные поры (28) и множественные поры (22) могут быть легко протестировано в этой системе.

    Осознание того, что одноканальные измерения могут использоваться для определение длины отдельных цепочек РНК или ДНК предполагает, что другие характеристики полинуклеотида также могут быть измерены как молекула пересекает канал. В принципе, единственный пурин или пиримидиновый нуклеотид, проходящий через ограничивающую апертуру канал должен блокировать ионный ток таким образом, чтобы отражать размер молекулы и химические свойства каждого нуклеотида в полинуклеотид.Если это так, возможно, можно будет использовать один канал. записи для прямого определения последовательности полинуклеотида. За Для того, чтобы это было возможно, должны быть выполнены как минимум пять условий: каждое нуклеотид должен производить характерный переходный ток засорение, ¶ ограничивающее отверстие канал должен иметь соответствующие размеры, чтобы отражать наличие только один нуклеотид за раз, временное разрешение ионного потока измерение должно превышать скорость движения нуклеотидов через канал, обратное движение полинуклеотида должно быть минимальным, и канал и мембрана должны быть достаточно прочными, чтобы выдерживать любые температурные и химические процедуры, необходимые для устранения вмешательство со стороны вторичной структуры полинуклеотида.

    Благодарности

    Мы благодарим Х. Бейли за щедрый дар α-гемолизина и H. Бергу, Дж. Головченко и Д. Нельсону за их поддержку и предложения. Мы также благодарим А. Шредера, Р. Ли и С. Ли за техническую помощь. Работа поддержана грантами Национальной Управление по аэронавтике и исследованию космического пространства (D.W.D.), Национальная наука Foundation (D.B.), Национальных институтов здравоохранения (D.W.D.) и Национальная академия наук / Национальный исследовательский совет по исследованиям Товарищество (Дж.J.K.).

    Сноски

    • ↵ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку. электронное письмо: dbranton {at} harvard.edu.

    • Дэниел Брантон

    • Стоимость публикации этого статьи были частично обработаны по страницам взимать оплату. эта статья поэтому должен быть отмечен настоящим « реклама » в соответствии с 18 U.S.C. §1734 исключительно для указания этого факта.

    • ↵ В близких экспериментах Ф. Рот, Р. Балдарелли и Г. М. Черч смоделировал движение ДНК через образовавшуюся пору. рецептором LamB. Их модель показывает, что ДНК может вызывать проводимость. изменения, которые должны быть чувствительны к структуре различных основы (личное общение).

    • Принято 5 сентября 1996 г.
    • Авторские права © 1996, Национальная академия наук США

    Подмножество PP2C, локализованного на плазматической мембране.D-фосфатазы негативно регулируют SAUR-опосредованную экспансию клеток Arabidopsis

    Цитирование: Ren H, Park MY, Spartz AK, Wong JH, Gray WM (2018) Подмножество локализованных в плазматической мембране фосфатаз PP2C.D негативно регулируют SAUR-опосредованные экспансия клеток у Arabidopsis. PLoS Genet 14 (6): e1007455. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455

    Редактор: Глория К. Мудай, Университет Уэйк Форест, США

    Поступила: 9 января 2018 г .; Одобрена: 30 мая 2018 г .; Опубликован: 13 июня 2018 г.

    Авторские права: © 2018 Ren et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (https://www.nih.gov, GM067203 для WMG) и Национальным научным фондом (https: // www.nsf.gov, MCB-1613809 в WMG). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Растительный гормон ауксин регулирует почти все аспекты роста и развития, включая эмбриогенез [1], развитие корней [2], гравитропизм [3], развитие листьев [4], развитие сосудов [5], фототропизм [6] ], избегание тени [6], развитие апикальной меристемы побега [7], формирование цветочного зачатка [5], развитие тычинок [8] и развитие гинецея [9].На клеточном уровне ауксин регулирует эти процессы посредством контроля клеточного деления, размножения и дифференцировки [10, 11]. Ауксин воспринимается корецепторным комплексом, который состоит из репрессоров транскрипции AUXIN / INDOLE-3-ACETIC ACID 1 / AUXIN SIGNALING F-BOX PROTEINSE 1 / AUXIN SIGNALING F-BOX и AUXIN / INDOLE-3-ACETIC ACID (AUX / IAA) в ядре. Связывание ауксином комплекса TIR1 / AFB и AUX / IAA приводит к деградации белков AUX / IAA протеасомой 26S [12]. Затем деградация AUX / IAA снимает репрессию факторов транскрипции AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF), чтобы активировать экспрессию ауксин-чувствительных генов [13].Эти ауксин-чувствительные гены, включая SMALL AUXIN UP RNAs, ( SAURs, ) [14], затем регулируют опосредованные ауксином клеточные, физиологические процессы и процессы развития.

    Основная функция ауксина в росте и развитии растений — регулирование размножения клеток. Было высказано предположение, что индуцированная ауксином клеточная экспансия происходит посредством кислотного механизма роста, который был впервые предложен в 1970-х годах [15, 16]. Согласно этой теории, ауксин активирует H + -АТФазы плазматической мембраны (PM) (известные как AHA / ARABIDOPSIS H + -ATPases у Arabidopsis), которые перекачивают протоны через плазматическую мембрану, тем самым подкисляя апопласт и повышая мембранный потенциал.Более кислый апопластный pH активирует экспансины и другие ферменты ремоделирования клеточной стенки, что приводит к увеличению растяжимости клеточной стенки. Кроме того, гиперполяризация плазматической мембраны способствует увеличению поглощения растворенных веществ и воды, обеспечивая повышенный тургор для ускорения роста клеток. В последние годы несколько исследований предоставили молекулярную поддержку опосредованной ауксином активации PM H + -АТФазы во время роста гипокотилей у Arabidopsis. Ауксин индуцирует фосфорилирование предпоследнего треонина (Thr 947 в AHA2), ключевого регуляторного сайта PM H + -АТФаз без изменения содержания белка AHA [17].Это увеличение фосфорилирования AHA Thr 947 , вероятно, является результатом индуцированной ауксином экспрессии SAUR , поскольку сверхэкспрессия GFP-SAUR19 способствует фосфорилированию AHA-Thr 947 , удлинению гипокотилей и растяжимости клеточной стенки [18, 19] . Более того, в соответствии с гипотезой о том, что кислотный рост требует ауксин-опосредованной экспрессии генов, недавно было показано, что канонический ядерный сигнальный путь TIR1 / AFB-AUX / IAA необходим для индуцированного ауксином удлинения гипокотиля и закисления клеточной стенки [20, 21].Вместе эти результаты предоставляют убедительные генетические и биохимические доказательства в поддержку теории кислотного роста.

    Белки

    SAUR способствуют активации PM H + -АТФазы и, как следствие, размножению клеток, ингибируя активность протеинфосфатаз типа 2C, принадлежащих к подсемейству D (PP2C.D) [18, 19]. PP2C представляют собой Mg 2+ / Mn 2+ -зависимые ферменты, которые эволюционно консервативны от прокариот до эукариот [22, 23]. Геном Arabidopsis кодирует восемьдесят PP2C, девять из которых относятся к D-субкладу [22].Недавние исследования показали участие членов семейства PP2C.D в регуляции развития апикальных крючков [18, 24], индуцированного ауксином размножения клеток [18], старения листьев [25] и иммунного ответа [26]. В нашей предыдущей работе [18] мы обнаружили, что растения, несущие искусственную микроРНК (амиРНК), нацеленную на пять членов семейства D-клады, обладали фенотипами, аналогичными, хотя и намного более слабыми, чем у линий сверхэкспрессии GFP-SAUR19 , включая увеличенную длину гипокотиля, гиперчувствительность. до LiCl, и повышенное подкисление среды.Хотя это открытие предоставило первоначальную генетическую поддержку антагонистической роли белков SAUR и PP2C.D в регуляции активности PM H + -АТФазы и размножения клеток, идентичность и функциональные отношения участвующих конкретных членов семейства PP2C.D оставались неопределенными. Более того, обратный генетический подход амиРНК не устраняет полностью функцию генов и может быть подвержен эффектам нецелевого действия. Здесь мы расширяем наши исследования функций этих фосфатаз, проводя генетическую характеристику pp2c . d Мутанты с потерей функции семейства . Мы обнаружили, что члены семейства PP2C.D демонстрируют различные паттерны субклеточной локализации, а локализованная на плазматической мембране субпопуляция, фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6, играют важную роль в противодействии SAUR-опосредованной регуляции PM H + — Активность АТФазы, рост клеток, рост и развитие растений.

    Результаты

    ПП2С . D гены экспрессируются широко

    Для исследования роли PP2C .Гены семейства D в росте и развитии растений, мы исследовали PP2C . Экспрессия гена D с использованием репортерного гена GUS (β-глюкуронидаза), управляемого природным PP2C . D промоторы. Мы создали трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PP2C . D1pro : EGFP-GUS транскрипция или PP2C . D (2–9) pro : PP2C . Конструкции трансляционного репортера D (2–9) -GUS .Все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7 были экспрессированы в семядолях и гипокотилях выращенных на свету проростков (рис. 1А). В корнях световых проростков всего PP2C . D гены, кроме PP2C . D1 и PP2C . D7 экспрессировались повсеместно (рис. 1B). ПП2С . D1 слабо экспрессируется специфически в зоне растяжения корня, а PP2C . D7 слабо экспрессируется по всему корню, за исключением области кончика корня (рис. 1B). Все PP2C . Гены D также экспрессировались в семядолях и гипокотилях этиолированных проростков, за исключением PP2C . D7 , который экспрессировался только в гипокотилях (рис. 1C). Интересно, что PP2C . D1 обнаруживает более сильную экспрессию на внутренней стороне апикального крючка (рис. 1C и 1D), что согласуется с предыдущими открытиями, касающимися PP2C . D1 в виде апикального крючка [18, 24]. Все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7, экспрессировались в черешках и розеточных листьях двухнедельных растений, а PP2C . D7 очень слабо экспрессировался на черешках (S1A фиг.). В цветах и ​​кремнеземах все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7, экспрессировались во множестве органов и стручков цветков, а PP2C . D7 слабо экспрессируется в лепестках (S1B и S1C фиг.). В частности, PP2C . D1 , D2 , D5 и D6 сильно экспрессировались в филаментах тычинок. ПП2С . Экспрессия D8 была высоко обогащена в пестиках, а PP2C . D4 и D6 показали сильную экспрессию в пыльниках. Отсутствие или низкий уровень PP2C . Экспрессия D7 почти во всех исследованных органах согласуется с результатами многочисленных транскриптомных исследований, собранных в базе данных браузера Arabidopsis eFP (S2 Рис) [27].

    Рис. 1. Образцы экспрессии PP2C . D-GUS репортеров.

    ( A) Всходы пятидневных светлых проростков. (B) Корни 5-дневных проросших на свету сеянцев. (C) Побеги 3-дневных этиолированных сеянцев. (D) Апикальный крючок двухдневного этиолированного сеянца. Окрашивание GUS проводили при 37 o ° C в течение 24 (A-C) или 4 часов (D). Масштабные линейки = 1 мм (A-C) или 0,5 мм (D).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g001

    В совокупности наши данные по экспрессии GUS демонстрируют, что все PP2C . D гены, кроме PP2C . D7 широко экспрессируются в большинстве органов и тканей в течение жизненного цикла растений, особенно в растущих органах и тканях, включая гипокотили, молодые корни и листья, а также волокна тычинок. Эти результаты показывают, что модель PP2C . Гены семейства D могут играть важную роль в различных процессах роста и развития растений.

    Белки PP2C.D обнаруживают четкую субклеточную локализацию

    Субклеточная локализация PP2C.Фосфатазы семейства D были ранее исследованы с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера в трансгенных растениях Arabidopsis, несущих репортерные конструкции, управляемые промотором вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S [28]. Однако, поскольку сверхэкспрессия, управляемая промотором 35S , может вызывать неправильную локализацию флуоресцентного слитого белка, мы дополнительно исследовали субклеточную локализацию фосфатаз семейства PP2C.D с использованием нативного PP2C . Промоторы D для экспрессии PP2C.Слитые белки D-GFP. Мы сгенерировали PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP Трансгенные растения Arabidopsis. Поскольку наш анализ репортера GUS показал, что все члены семейства PP2C.D, кроме PP2C . D1 и D7 сильно экспрессировались в кончиках корней (рис. 1В), мы первоначально исследовали локализацию PP2C.D-GFP в клетках корневой меристемы и зоны элонгации.

    Предыдущие исследования показали, что PP2C.D1, также известный как APD7 (Arabidopsis PP2C clade D 7) [28] или SSPP (SENESCENCE-SUPPRESSED PROTEIN PHOSPHATASE) [25], находится в ядре и цитоплазме клеток корня [28] или только в цитоплазме протопластов мезофилла [25].Соответствует нашему PP2C . D1pro : Результаты репортера EGFP-GUS , флуоресценция PP2C.D1-GFP в кончиках корней была ниже нашего предела обнаружения. Однако, начиная с PP2C . D1 индуцируется ауксином [29], когда PP2C . D1pro : PP2C . проростки D1-GFP обрабатывали ИУК, наблюдали устойчивую экспрессию с флуоресценцией GFP, очевидной как в ядрах, так и в цитозоле (рис. 2А). Чтобы лучше изучить локализацию PP2C.D1 без осложнений со стороны экзогенной ИУК, мы исследовали апикальные крючки этиолированных проростков.В соответствии с паттерном экспрессии GUS (фиг. 1C и 1D), флуоресценция GFP специфически наблюдалась в эпидермальном слое внутренней стороны крючка (фиг. 2B). Подобно корням, обработанным ауксином, PP2C.D1, по-видимому, локализуется как в ядрах, так и в цитоплазме.

    Рис. 2. Дифференциальная локализация слитых белков PP2C.D-GFP.

    (A) Локализация слитых белков PP2C.D-GFP в кончиках корней 5-дневных проростков. ПП2С . проростки D1-GFP обрабатывали 10 мкМ ИУК в течение 4 часов для увеличения экспрессии до детектируемых уровней.(B) Локализация слитого белка PP2C.D1-GFP в апикальных крючках 2-дневных этиолированных проростков, окрашенных 10 мкг / мл йодида пропидия (PI) в течение 30 мин. (C) Локализация слитого белка PP2C.D8-GFP в кончиках корней 5-дневных проростков. Проростки контрастно окрашивали 0,5 мкМ MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) в течение 20 мин. (A – C) Кончики корней и апикальные крючки наблюдались под спектральным конфокальным микроскопом Nikon A1. Масштабные линейки = 50 мкм (A), 25 мкм (B) или 10 мкм (C).

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1007455.g002

    В соответствии с предыдущими выводами с использованием 35S -управляемых репортеров GFP [28], PP2C.D2 / APD2, PP2C.D5 / APD6 и PP2C.D6 / APD3, локализованных исключительно для периферия клеток корневых клеток, в соответствии с локализацией плазматической мембраны (рис. 2А). Недавно сообщалось, что PP2C.D3 / PP2C38 находится на плазматической мембране и во внутриклеточных точках эпидермальных клеток листа Arabidopsis, сверхэкспрессирующих PP2C . D3-GFP , управляемый промотором 35S [26].В отличие от этих результатов, хотя мы действительно обнаружили некоторый сигнал PP2C.D3-GFP вблизи периферии клетки, значительная флуоресценция также наблюдалась во внутриклеточных точках и ядрах (рис. 2А). Сходным образом PP2C.D4 / APD4 обнаруживает как ядерную, так и цитозольную локализацию (рис. 2A). PP2C.D7 / APD9 ассоциируется с плазматической мембраной и эндомембранами [28]. Хотя мы исследовали много независимых PP2C . D7pro : PP2C . D7-GFP строк, нам не удалось обнаружить PP2C.Экспрессия белка D7-GFP в любых исследованных органах, что согласуется с низкой экспрессией, наблюдаемой с репортером GUS (фиг. 1B) и транскриптомными исследованиями (S2 фиг.). Сигналы PP2C.D8-GFP и MitoTracker совместно локализуются в клетках корня (Рис. 2C), подтверждая предыдущие открытия, что PP2C.D8 / APD5 локализуется в митохондриях [28]. Наконец, Tovar-Mendez et al. (2014) сообщили, что PP2C.D9 / APD8 локализуется в цитоплазме, но не в ядре [28]. Наши результаты подтверждают этот вывод, хотя и похожи на PP2C.D3, цитозольная флуоресценция часто была точечной, а не равномерной (рис. 2А). Хотя мы не можем быть уверены в том, что все белки PP2C.D-GFP функциональны и локализуются точно так же, как эндогенный белок, ниже мы приводим доказательства того, что конструкции PP2C.D2-, D5- и D6-GFP кодируют функциональные белки (фиг. S5C). Учитывая высокую степень сходства последовательностей между членами семейства PP2C.D, кажется вероятным, что добавление C-терминального тега GFP не мешает функции PP2C.D. В совокупности наши результаты показывают, что файл PP2C.Фосфатазы семейства D обнаруживают отчетливую субклеточную локализацию, находясь в различных клеточных компартментах.

    Локализованная в плазматической мембране субпопуляция белков PP2C.D ингибирует рост клеток

    Гипокотиль Arabidopsis — отличная система для изучения удлиненного роста, поскольку его размер в основном контролируется размножением клеток [30]. Наши предыдущие исследования с использованием амиРНК для нокаута нескольких членов ( PP2C , D2 , D5 , D7 , D8 , D9 ) PP2C .Гены семейства D показали, что фосфатазы семейства PP2C.D могут функционировать избыточно, чтобы негативно регулировать рост гипокотилей [18]. Однако полученные в результате фенотипы роста были слабыми по сравнению с растениями со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 . Чтобы окончательно определить вклад отдельных фосфатаз PP2C.D в рост клеток, мы проанализировали фенотип роста гипокотилей всех pp2c . d мутантов со вставкой Т-ДНК (S3 фиг.). Полуколичественный анализ RT-PCR подтвердил, что pp2c .Мутанты со вставкой d1 , d2 , d5 , d6 , d7 , d8 и d9 , вероятно, были нулевыми аллелями (S4 Fig). Аналогично, pp2c . Ранее сообщалось, что инсерционные мутанты d3 и d4 являются нулевыми или мутантами с тяжелым нокдауном [26]. стр. 2c . d5 был единственным одиночным мутантом, который демонстрировал слегка увеличенный рост гипокотилей (S5A фиг.). Модель pp2c . d4 Мутант со вставкой Т-ДНК был недоступен, когда мы начали генерировать различные pp2c . d мутантов высшего порядка. Модель pp2c . d3 / 4 Двойной мутант был недавно опубликован [26], и мутантные проростки не проявляли явного фенотипа роста гипокотилей (S5B Рис).

    Отсутствие сильных одиночных мутантных фенотипов предполагает функциональную избыточность в пределах PP2C . D Семейство генов . Поэтому мы создали множество двойных, тройных и четверных мутантов (S5A Рис.). Учитывая локализацию в плазматической мембране SAUR19 и PM H + -ATPases, мы особенно интересовались линиями, в которых отсутствуют три члена семейства, локализованные в плазматической мембране, PP2C.D2, D5 и D6. Интересно, что мутации в PP2C . D2 или PP2C . D6 усиливал фенотип роста гипокотилей pp2c . d5 (S5A рис.). Аналогично, pp2c . d2 pp2c . d6 Двойной мутант обнаружил фенотип длинного гипокотиля. Однако длина гипокотиля не изменилась во всех других испытанных комбинациях двойных мутантов. Кроме того, файл pp2c . d2 / 5/6 тройные мутантные проростки показали еще более сильный фенотип роста гипокотилей, демонстрируя гипокотили почти такой же длины, как и у проростков со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 (рис. 3A, 3B и S5A).Как и у проростков GFP-SAUR19 , это увеличение длины гипокотиля было результатом увеличения размножения клеток (рис. 3С). Напротив, различные комбинации тройных мутантов для pp2c . d1 , d3 , d8 и d9 не проявляли какого-либо явного фенотипа роста гипокотилей (S5A фиг.). Ранее мы обнаружили, что PP2C . Сверхэкспрессия D1 под контролем промотора 35S вызывала резкое уменьшение длины гипокотиля и роста растений [18].Однако анализ потери функции показывает, что эндогенный PP2C . D1 играет мало, если вообще играет роль в удлинении гипокотиля в наших условиях роста, как pp2c . Мутация d1 не смогла усилить фенотип роста гипокотилей у pp2c . d2 / 5/6 тройной мутант, а также комбинации мутантов более низкого порядка (S5A фиг.).

    Рис. 3. Модель pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант демонстрирует повышенное размножение клеток и рост растений.

    (A) Восьмидневные проросшие на свету саженцы. Масштабная линейка = 2 мм. (B) Длина гипокотиля 8-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 47). (C) Длина эпидермальных клеток 8-дневных световых гипокотилей проростков. Были измерены апикальные 10 клеток из 10 проростков. Планки погрешностей = SD. (D) Анализы ингибирования корня LiCl. Пятидневные проросшие на свету проростки, выращенные на чашках с ATS, переносили на чашки с ATS или ATS + 10 мМ LiCl на 3 дня. После переноса измеряли рост новых корней. Планки погрешностей = SD (n = 25–38).(E) Анализы подкисления среды. Шестидневные выращенные на свету проростки, выращенные на чашках ATS, переносили на чашки, содержащие индикатор pH бромкрезоловый пурпурный (BCP, pH 6,5), и изменение цвета среды наблюдали через 6 дней. ( F) Уровни Thr 947 -фосфорилированных белков AHA по данным связывания GST-14-3-3. Загружали пять микрограммов микросомальных фракций, полученных из 6-дневных проростков, выращенных на свету. Связанные с AHA и GST-14-3-3 белки AHA детектировались антителами против AHA и против GST, соответственно.(G) Побеги 3-недельных растений. Масштабная линейка = 1 см. (H) Участки розеточных листьев трехнедельных растений. Общую площадь листьев растений измеряли с помощью Photoshop. Планки погрешностей = SEM (n = 23–28). (I) Цветы. Шкала шкалы = 0,5 мм. (J) Апикальные крючки трехдневных этиолированных проростков. Масштабная линейка = 0,5 мм. (K) Апикальные углы крючков трехдневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 29–35). (L) Уменьшение фототропного роста pp2c . d2 / 5/6 саженцы. Четырехдневные этиолированные проростки фотостимулировали односторонним синим светом в течение 2, 4, 6 и 8 часов и измеряли углы изгиба гипокотилей с помощью ImageJ.Планки погрешностей = SEM (n = 14–16). (B, C, H и K) Различные буквы над полосами указывают на существенные различия (P <0,05).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g003

    Чтобы подтвердить, что pp2c . d2 / 5/6 Фенотип длинного гипокотиля на самом деле был связан с потерей трех фосфатаз, локализованных в PM, мы трансформировали тройной мутант с PP2C . D (2 , 5 , 6) pro : PP2C .Репортерные конструкции D (2 , 5, , 6) -GFP , используемые для оценки локализации (рис. 2). Все три слитые конструкции GFP восстанавливали длину гипокотиля по крайней мере до соответствующего двойного мутанта (фиг. S5C). В линиях D2- и D5-GFP наблюдалась избыточная комплементация, при этом длины гипокотилей возвращали длину дикого типа. Предположительно, это связано с позиционными эффектами, которые могут привести к скромному PP2C . D сверхэкспрессия. Вместе вышеуказанные генетические находки указывают на то, что PP2C локализуется в плазматической мембране.Белки D2, D5 и D6 являются основными фосфатазами PP2C.D, которые негативно регулируют рост клеток во время роста гипокотилей.

    Начиная с pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант обнаружил длинный гипокотильный фенотип, мы приступили к оценке этого мутанта на предмет других фенотипов, связанных со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 . Как GFP-SAUR19 саженцы, pp2c . d2 / 5/6 проростки проявляли резкую гиперчувствительность к 10 мМ LiCl (рис. 3D) и повышенное закисление среды (рис. 3Е), фенотипы, указывающие на повышенную активность PM H + -АТФазы [18, 31].Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали статус фосфорилирования AHA-Thr 947 косвенно, используя метод дальнего вестерн-блоттинга GST-14-3-3. Несколько предыдущих исследований продемонстрировали, что этот анализ точно отражает статус фосфорилирования AHA-Thr 947 и соответствующие изменения в активности PM H + -АТФазы [17, 18, 32, 33]. Поразительное увеличение фосфорилирования AHA-Thr 947 наблюдалось как в GFP-SAUR19 , так и в pp2c . d2 / 5/6 саженцы (рис. 3F).Напротив, уровни фосфорилирования AHA-Thr 947 в pp2c . d1 / 3/8 Тройной мутант заметно не отличался от дикого типа (фиг. 3F). Сильное генетическое взаимодействие, наблюдаемое в анализах роста гипокотилей, предполагает, что PP2C.D2, D5 и D6 действуют избыточным образом (S5A, рис.). В соответствии с этим понятием, в то время как pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант продемонстрировал повышенные уровни фосфорилирования AHA-Thr 947 , фосфорилирование у одиночных мутантов было сравнимо с фосфорилированием дикого типа (фиг. 3F).В совокупности наши генетические и биохимические данные демонстрируют, что эти локализованные в PM члены семейства PP2C.D действуют избыточно, регулируя активность PM H + -АТФазы для контроля размножения клеток.

    Хотя pp2c . d2 / 5/6 Растения не проявляли серьезных аномалий развития, несколько фенотипов роста были очевидны у более старых растений. Трехнедельный возраст pp2c . d2 / 5/6 Растения имели немного более крупные розеточные листья, чем у растений дикого типа, но, как и в случае роста гипокотилей, этот фенотип был немного более драматичным у растений GFP-SAUR19 (фиг. 3G и 3H).В цветах, pp2c . d2 / 5/6 Цветки имели более длинные тычинки и пестики, чем у цветков дикого типа (рис. 3I). В то время как цветы GFP-SAUR19 не обнаруживают фенотипов длинных тычинок и пестиков (Рис. 3I), увеличенная длина тычинок была обнаружена для растений, экспрессирующих слитые белки SAUR63-GFP или GUS [34]. Высота и длина стебля зрелых растений pp2c . d2 / 5/6 растений также были немного крупнее растений дикого типа (S5D и S5E фиг.).В то время как растения GFP-SAUR19 не проявляли явного фенотипа роста кремнезема (S5E Fig), недавно сообщалось о повышенном росте кремния у трансгенных растений Arabidopsis, сверхэкспрессирующих SAUR8 , SAUR10 и SAUR16 [35].

    ПП2С . D1 по-разному экспрессируется в апикальном крючке этиолированных проростков (рис. 1D и 2B) и этиолированных pp2c . Мутанты d1 , а также проростки GFP-SAUR19 обнаруживают дефектное развитие апикальных крючков [18, 24].Хотя файл pp2c . d2 , d5 и d6 одиночные мутанты развивают апикальные крючки, сопоставимые с диким типом [18], учитывая функциональную избыточность, которую мы наблюдали в других анализах этих членов семейства, мы исследовали фенотип апикального крючка у pp2c . d2 / 5/6 тройной мутант. Действительно, как и этиолированные проростки GFP-SAUR19 , pp2c . d2 / 5/6 проростки показали частично открытые апикальные крючки и расширенные семядоли (рис. 3J и 3K).В нашей предыдущей работе [36] было показано, что проростки GFP-SAUR19 демонстрируют сниженный фототропизм, что предполагает участие белков SAUR в ответах на тропический рост. В соответствии с этим представлением, транскриптов SAUR , как было обнаружено, преимущественно накапливаются на удлиненной стороне изгибающихся органов [37-39]. Поэтому мы исследовали, могут ли PP2C.D2, D5 и D6 действовать в фототропном ответе. При воздействии одностороннего синего света этиолированный pp2c . d2 / 5/6 проростки демонстрировали резко сниженную фототропную кривизну (фиг. 3L), предполагая, что SAUR-опосредованное ингибирование PP2C.Активность D2 / 5/6 на светлой дистальной стороне гипокотиля может лежать в основе фототропного изгиба. На основании фенотипов повышенного роста pp2c . d2 / 5/6 растений и их сильное фенотипическое сходство с SAUR растениями с повышенной функциональностью, а также аналогичные эффекты на фосфорилирование PM H + -АТФазы Thr 947 , наши результаты предполагают, что PP2C.D2 , D5 и D6 фосфатазы являются первичными эффекторами белков SAUR, локализованных на плазматической мембране, которые регулируют рост растений.

    Фосфатазы PP2C.D взаимодействуют с SAUR19 и PM H

    + -ATPases

    Вышеупомянутые генетические исследования показали, что PP2C.D2, D5 и D6 являются основными фосфатазами D-клады, которые негативно регулируют SAUR-опосредованное размножение клеток. Наша предыдущая работа выделила PP2C.D1, D5 и D6 как белки, взаимодействующие с SAUR19, при скрининге дрожжевой двугибридной библиотеки [18]. Мы подтвердили, что PP2C.D2 также взаимодействует с SAUR19 в этой системе (рис. 4A). Мы также протестировали остальных членов семейства PP2C.D и обнаружили, что PP2C.D3, D4 и D8 также могут взаимодействовать с SAUR19 (S6A фиг.). Положительные взаимодействия не были обнаружены для PP2C.D7 или PP2C.D9 (S6A фиг.), Однако PP2C.D7, по-видимому, не экспрессировался в дрожжах, а экспрессия PP2C.D9 была довольно низкой по сравнению с PP2C.D1 (S6B фиг.).

    Рис. 4. Фосфатазы PP2C.D взаимодействуют с SAUR19 и H + -АТФаз плазматической мембраны.

    ( A) Дрожжевой двугибридный анализ, демонстрирующий взаимодействие белков PP2C.D2 и SAUR19. Клетки высевали на подходящую среду для селекции и выращивали при комнатной температуре от 3 до 6 дней.(B) Анализ Co-IP, выявляющий взаимодействие белков PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19. Микросомальные белки получали из этиолированных проростков 6-дневного возраста. Для анализов совместного IP использовали преиммунную сыворотку крови (пре) или антитела против GFP. PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19 детектировались антителами против HA и против GFP соответственно. (C) Анализ Co-IP, выявляющий взаимодействия белка PP2C.D и PM H + -АТФазы. Микросомальные белки получали из 8-дневных проростков, выращенных на свету. Для анализов совместного IP использовали преиммунную сыворотку крови (пре) или антитела против AHA.Белки PP2C.D2-GFP, PP2C.D5-GFP, PP2C.D8-GFP и PP2C.D6-HA детектировались антителами против GFP и против HA соответственно. (D) Экспрессия PP2C.D устраняет AHA2-комплементацию активности PM H + -АТФазы в дрожжах. Гал, галактоза; Глюкоза, глюкоза; Vec, пустой вектор. (E). In vitro Анализы дефосфорилирования AHA2, исследующие дефосфорилирование AHA2-Thr 947P , экспрессированного в дрожжах. (B и C) 300–400 мкг и 10–20 мкг микросомальных белков использовали для ко-IP и вестерн-блоттинга соответственно.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g004

    Чтобы изучить взаимодействия белков в planta , мы создали трансгенные растения Arabidopsis, коэкспрессирующие PP2C.D2-HA, D5-HA или D6-HA. под управлением родной PP2C . Промоторы D и GFP-SAUR19, управляемые промотором 35S , и исследовали их взаимодействия путем коиммунопреципитации (co-IP) с использованием солюбилизированных микросомальных фракций. Коиммунопреципитировались PP2C.D5-HA и GFP-SAUR19, что подтверждает их взаимодействие в Arabidopsis (рис. 4B).Однако нам не удалось успешно коиммунопреципитировать GFP-SAUR19 с PP2C.D2-HA и PP2C.D6-HA. Хотя это может быть связано с техническими ограничениями этого анализа, мы не можем исключить возможность того, что SAUR19 не взаимодействует с этими фосфатазами in planta . Скорее, учитывая большое количество белков SAUR, кажется вполне возможным, что PP2C.D2 и D6 могут предпочтительно взаимодействовать с др. Белками SAUR, ассоциированными с плазматической мембраной.

    Выраженное увеличение фосфорилирования AHA-Thr 947 наблюдается в pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант (рис. 3F) идентифицировал этот фосфозит как предполагаемый субстрат фосфатаз PP2C.D2, D5 и D6. Поэтому мы исследовали потенциальные взаимодействия между этими белками и PM H + -АТФаз с помощью тестов co-IP и бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC). PP2C.D2-GFP, D5-GFP и D6-HA коиммунопреципитируются с белками AHA (рис. 4C). Напротив, не наблюдалось заметного взаимодействия между AHA и PP2C.D8-GFP (рис. 4C), что позволяет предположить, по крайней мере, некоторую степень субстратной специфичности среди PP2C.D члены семьи. Кроме того, желтые флуоресцентные сигналы наблюдались на плазматической мембране эпидермальных клеток листа, когда AHA2-YFP N временно коэкспрессировался с PP2C. D2-YFP C , D5-YFP C и D6-YFP C в Nicotiana benthamiana листьев (S7 Рис). Эти результаты показывают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 физически связываются с белками AHA in planta . Чтобы дополнительно проверить регуляторную природу этих взаимодействий, мы совместно экспрессировали фосфатазы PP2C с AHA2 в дрожжевом штамме RS-72 для анализов комплементации.В этом штамме клетки жизнеспособны только при выращивании на галактозной среде, поскольку ген эндогенной дрожжевой PM H + -АТФазы PMA1 управляется промотором GAL1 . Экспрессия AHA2 дополняет GAL1pro : PMA1 для восстановления роста на среде с глюкозой [33, 40]. Когда мы совместно экспрессировали PP2C.D2, D5 или D6 с AHA2, дрожжевые клетки RS-72 не могли расти на среде с глюкозой (рис. 4D), что указывает на то, что эти фосфатазы ингибируют функцию AHA2. Фактически, все члены семейства PP2C.D, за исключением PP2C.D8 были способны противодействовать функции AHA2 у дрожжей. Напротив, не-D-клады Arabidopsis PP2C фосфатазы PP2C.I1 (At2g25070, PP2C I-клады) и PP2C.F9 (At1g43900, F-клады PP2C) [41] не смогли ингибировать функцию AHA2 в этой системе (рис. 4D), предполагая, что PP2C с D-кладой могут быть уникальными по своей способности ингибировать активность PM H + -АТФазы. Предположительно, PP2C.D1, D3, D4 и D9, все из которых обнаруживают некоторую степень цитозольной локализации у Arabidopsis, могут получать доступ к цитозольному C-концу AHA2 при сверхэкспрессии в дрожжах.Наши генетические (S5 рис.) И биохимические (рис. 3F) данные, однако, предполагают, что эти члены семейства не являются первичными регуляторами активности AHA in planta .

    Мы ранее разработали анализ дефосфорилирования in vitro AHA2 с использованием плазматических мембран, полученных из дрожжевых клеток RS-72, экспрессирующих AHA2, для изучения регуляции SAUR PP2C.D1-опосредованного дефосфорилирования AHA2-Thr 947P [18]. Этот же анализ использовали для оценки способности фосфатаз PP2C.D2, D5 и D6 дефосфорилировать AHA2-Thr 947P и ингибирования любой такой активности белками SAUR.Как ранее было показано для PP2C.D1 [18], рекомбинантные PP2C.D2 и PP2C.D5 катализируют дефосфорилирование AHA2-Thr 947 , и эта активность сильно ингибируется добавлением очищенного белка SAUR9 (рис. 4E). Мы не смогли продемонстрировать активность фосфатазы для рекомбинантного PP2C.D6 в этой системе или в анализах с использованием химического субстрата p -нитрофенилфосфат (pNPP), предполагая, что для этой фосфатазы могут потребоваться альтернативные условия реакции, кофакторы или посттрансляционные модификации. .Тем не менее, мы не можем исключить возможность того, что PP2C.D6 не является функциональной фосфатазой, а скорее может играть особую роль, такую ​​как обеспечение функции каркаса для комплексов PP2C.D-субстрат. Однако, учитывая, что PP2C.D6 содержит высококонсервативный каталитический домен, вместе с нашими данными о взаимодействии и генетическими данными, демонстрирующими, что D6 действует избыточно с D2 и D5, кажется вероятным, что PP2C.D6 также дефосфорилирует AHA2-Thr 947P и эту активность ингибируется белками SAUR.

    ПП2С . Сверхэкспрессия D5 снижает рост клеток и рост растений

    Для исследования эффектов PP2C . D увеличения функции на рост и развитие растений, мы попытались создать 35Spro : PP2C . D5-EYFP линий сверхэкспрессии. Хотя несколько первичных трансформантов Arabidopsis проявляли карликовый фенотип, мы не смогли получить никаких стабильных гомозиготных линий сверхэкспрессии, что позволяет предположить, что PP2C.Дозировка D5 может иметь решающее значение. Поэтому мы создали трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие PP2C . D5-HA с приводом от PP2C . Промотор D5 в pp2c . d5 мутантный фон. Экспрессия белка PP2C.D5-HA спасала слегка увеличенный фенотип роста гипокотилей pp2c . d5 проростков (S8A фиг.), Демонстрируя, что PP2C.D5-HA является функциональным белком. Мы заметили, что некоторые трансгенные линии демонстрируют дефекты роста, включая снижение роста и фертильности.Серьезность дефектов роста зависела от уровней экспрессии белка PP2C.D5-HA. стр. 2c . d5 PP2C . D5-HA линии 6 и 7, которые не проявляли явных дефектов роста, экспрессировали более низкие уровни белка PP2C.D5-HA, в то время как линии 1 и 4, которые демонстрировали серьезные дефекты роста, выражали более высокие уровни белка PP2C.D5-HA (S8B, рис. ). Поэтому мы выбрали pp2c . d5 PP2C . D5-HA линий 1 и 4 (в дальнейшем обозначаемых как D5-HA-OX для сверхэкспрессии) для дальнейшего фенотипического анализа для оценки эффектов PP2C . D5 Увеличение функции на рост и развитие растений.

    по сравнению с диким типом и pp2c . d5 проростков, выращенных на свету D5-HA-OX проростков продемонстрировали сниженный рост гипокотилей (фиг. 5A и 5B), более короткие эпидермальные клетки гипокотиля (фиг. 5C) и снижение роста корней (фиг. 5D). Этиолированные проростки D5-HA-OX также демонстрировали сильно сниженный рост гипокотилей (фиг. 5E и 5F). D5-HA-OX Растения демонстрировали более мелкие розеточные листья (фиг. 5G), замедленное старение листьев (фиг. 5H) и более мелкие цветы с более короткими тычинками (фиг. 5J).Вскоре после закрепления у растений D5-HA-OX наблюдались дефекты фертильности (рис. 5I). Однако ручное опыление пестиков D5-HA-OX пыльцевыми зернами D5-HA-OX привело к полному завязыванию семян (рис. 5K), что указывает на то, что дефекты фертильности вызваны уменьшенным удлинением тычинок, а не дефектной пыльцой. или оплодотворение. Любопытно, что при продолжающемся росте старые растения D5-HA-OX оправились от ранних дефектов мужской фертильности и смогли успешно завязать семена.Зрелые растения D5-HA-OX были меньше, чем у растений дикого типа, и составляли pp2c . d5 (рис. 5L) и имел более короткие силикаты (рис. 5M).

    Рис. 5. PP2C . Сверхэкспрессия D5 вызывает уменьшение размножения клеток и роста растений.

    ( A) Всходы 7-дневных световых проростков. Масштабная линейка = 2 мм. (B) Длина гипокотиля 7-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 33–43). (C) Длина эпидермальных клеток 8-дневных световых гипокотилей проростков.Были измерены апикальные 10 клеток из 10 проростков. Планки погрешностей = SD. (D) Длина первичного корня 7-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 37–51). (E) Побеги 7-дневных этиолированных сеянцев. Масштабная линейка = 5 мм. (F) Длина гипокотиля 7-дневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 40–49). (G) 24-дневные растения. Масштабная линейка = 1 см. (H) 44-дневные растения. Первичные болты были удалены, чтобы лучше видеть листья розетки. Масштабная линейка = 1 см. (I) Побеги 44- или 51-дневных растений. Шкала шкалы = 4 см (вверху) или 1 см (внизу).(J) Цветы. Чашелистики и лепестки удаляли, чтобы лучше видеть волокна тычинок. Масштабная линейка = 1 мм. (K) Siliques. Пестики цветов D5-HA-OX линий 1 и 4 опыляли вручную их собственными пыльцевыми зернами. Масштабная линейка = 2 мм. (L) 73-дневные растения. Масштабная линейка = 4 см. (M) Siliques. Масштабная линейка = 4 мм. (N) Уровни Thr 947 -фосфорилированных белков AHA, отслеживаемые по связыванию GST-14-3-3. Загружали пять микрограммов микросомальных фракций, приготовленных из 6-дневных этиолированных проростков.Связанные с AHA и GST-14-3-3 белки AHA-Thr 947P детектировались антителами против AHA и против GST, соответственно. (O) Анализ ингибирования корня LiCl. Шестидневные выращенные на свету проростки, выращенные на чашках с ATS, переносили на чашки с ATS или ATS + 10 мМ LiCl на 3 дня. После переноса измеряли рост новых корней. Планки погрешностей = SD (n = 49–73). (P) Анализы подкисления среды. Восьмидневные проросшие на свету проростки, выращенные на чашках ATS, переносили в чашки, содержащие индикатор pH бромкрезоловый пурпурный (BCP, pH 6.5), а среднее изменение цвета наблюдали через 9 ( D5-HA-OX 1) или 12 ( D5-HA-OX 4) дней спустя. (B, C, D и F) Различные буквы над полосами указывают на значительные различия (P <0,05).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g005

    Чтобы оценить, соответствует ли PP2C . Сверхэкспрессия D5 вызывает снижение активности PM H + -АТФазы, мы исследовали статус фосфорилирования AHA-Thr 947 в проростках D5-HA-OX .Четкое снижение фосфорилирования AHA-Thr 947 наблюдалось в этиолированных проростках D5-HA-OX (фиг. 5N). В соответствии со снижением активности PM H + -АТФазы и последующим мембранным потенциалом, проростки D5-HA-OX проявили устойчивость к 10 мМ LiCl (фиг. 5O) и уменьшили подкисление среды (фиг. 5P). В совокупности наши результаты показывают, что PP2C . Сверхэкспрессия D5 вызывает снижение размножения клеток и роста растений, что, по крайней мере частично, вызвано сниженным фосфорилированием PM H + -АТФазы Thr 947 и соответствующим снижением активности фермента.

    Сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляет дефекты роста PP2C . D5 растения со сверхэкспрессией

    Геном Arabidopsis содержит 79 генов SAUR . Из-за обширной функциональной избыточности сложно изучить функции белков SAUR в росте и развитии растений с использованием подхода потери функции [14]. Наши предыдущие биохимические исследования показали, что белки SAUR ингибируют активность фосфатазы PP2C.D (рис. 4E) [18].Чтобы проверить эту гипотезу генетически, мы создали растения арабидопсиса, коэкспрессирующие белки GFP-SAUR19 и PP2C.D5-HA, путем скрещивания трансгена 35Spro : GFP-SAUR19 с линией 1 D5-HA-OX и исследовали эффекты сверхэкспрессии GFP-SAUR19 на дефекты роста PP2C . D5-HA растений со сверхэкспрессией. Вестерн-блоттинг подтвердил, что двойные трансгенные растения экспрессировали оба слитых белка на уровнях, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в родительских линиях (фиг. 6A).Поразительно, что сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляла практически все аспекты фенотипов D5-HA-OX , включая дефекты роста гипокотиля, корня и розетки листа (Рис. 6B-6E). Кроме того, мужская стерильность растений D5-HA-OX , вызванная дефектным ростом удлинения тычинок, также подавлялась сверхэкспрессией GFP-SAUR19 (рис. 6F и 6G), как и дефекты D5-HA-OX в растении. высота и длина силикона (рис. 6H и 6I). Вместе эти результаты обеспечивают сильную генетическую поддержку гипотезы о том, что белки SAUR и PP2C локализованы на плазматической мембране.D-фосфатазы действуют антагонистически, регулируя рост растений.

    Рис. 6. Сверхэкспрессия GFP-SAUR19 подавляет дефекты роста PP2C . D5 растений со сверхэкспрессией.

    (A) Вестерн-блоттинг экспрессии белков GFP-SAUR19 и PP2C.D5-HA. Загружали двадцать микрограммов микросомальных белков из 8-дневных растений, выращенных на свету. GFP-SAUR19, PP2C.D5-HA и контроль загрузки SEC12 детектировались антителами против GFP, против HA и против SEC12 соответственно.(B) Длина гипокотиля 8-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 33–53). (C) Длина первичного корня 8-дневных проросших на свету проростков. Планки погрешностей = SD (n = 41–51). (D) Длина гипокотиля 7-дневных этиолированных проростков. Планки погрешностей = SD (n = 68–78). (E) 30-дневные растения. Первичные болты были удалены, чтобы лучше видеть листья розетки. Масштабная линейка = 1 см. (F) Верхушка 53-дневных растений. Масштабная линейка = 1 см. (G) Цветы. Масштабная линейка = 2 мм. Чашелистики и лепестки удаляли, чтобы лучше видеть волокна тычинок.(H) 66-дневные растения. Масштабная линейка = 4 см. (I) Siliques. Масштабная линейка = 2 мм. (B-D) Различные буквы над полосами указывают на значительные различия (P <0,05).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g006

    Ауксин индуцирует экспрессию подмножества

    PP2C . Гены D и высокая температура повышают уровень белка PP2C.D2

    Предыдущие транскриптомные анализы гипокотилей ауксин-чувствительных генов показали, что PP2C . D1 и PP2C . D7 могут быть ауксин-индуцированными генами, поскольку их экспрессия была повышена в результате 120-минутной обработки синтетическим пиклорамом ауксина [42]. Кроме того, используя наш репортер PP2C.D1-GFP, мы продемонстрировали индуцируемую ауксином экспрессию PP2C . D1 в кончиках корней (рис. 2А). Изучить потенциальную ауксин-опосредованную регуляцию PP2C . Гены семейства D , мы исследовали PP2C . Экспрессия D-GUS у 5-дневных выращенных на свету PP2C . D1pro : EGFP-GUS и PP2C . D (2–9) pro : PP2C . D (2–9) -GUS проростки, обработанные 10 мкМ ИУК. В соответствии с предыдущими данными [42], ауксин индуцировал PP2C . Экспрессия D7-GUS в гипокотилях (фиг. 7A). В наших условиях индукция ауксином PP2C . D1pro : Экспрессия EGFP-GUS не была очевидна в гипокотилях. Однако ауксин сильно индуцировал PP2C . D1pro : Экспрессия EGFP-GUS в зоне растяжения корня (фиг. 7B). Мы не наблюдали явной индуцированной ауксином экспрессии репортеров PP2C.D2-, D3-, D4-, D5-, D6-, D8- или D9-GUS.

    Рис. 7. Ауксин индуцирует PP2C . D, экспрессия гена и высокая температура повышают уровень белка PP2C.D2.

    (A) GUS-окрашенные побеги 5-дневных проросших на свету проростков, обработанных 10 мкМ ИУК в течение 4 часов. Масштабная линейка = 1 мм. (B) GUS-окрашенные корни 5-дневных проросших на свету проростков, обработанных 10 мкМ ИУК в течение 4 часов.Масштабная линейка = 1 мм. (C) QRT-PCR анализы SAUR и PP2C . D экспрессия гена. РНК получали из 3-дневных проросших на свету проростков, обработанных 5 мкМ NAA или контрольным растворителем в течение различных периодов времени. Относительное выражение представляет собой значение выражения NAA / значение выражения mock. Результаты qRT-PCR были основаны на трех биологических повторностях. S19 , SAUR19 ; S23 , SAUR23 ; S9 , SAUR9 . Планки погрешностей = SD.(D) GUS-окрашенные побеги выращенных на свету проростков. Двух- или четырехдневный PP2C . Саженцы D2-GUS , выращенные при температуре 20 ° ° C, были перемещены на температуру 28 ° ° C на 6 часов, 24 часа или 5 дней. Окрашивание GUS проводили при 37 o ° C в течение 2 часов (6 часов, 24 часов) или 1 часа (5 дней). (E) Вестерн-блоттинг экспрессии белка PP2C.D2-GFP. Двухдневный PP2C . D2-GFP проростков, выращенных при температуре 20 ° ° C, были перенесены на температуру 28 ° ° C на 5 дней. 25 микрограммов общих белков из побегов загружали для вестерн-блоттинга с использованием антител против GFP и против SEC12.(F) QRT-PCR анализы SAUR и PP2C . D экспрессия гена. РНК получали из проросших на свету проростков, которые выращивали при 20 o ° C и сдвигали до 28 o ° C в течение разного времени. Относительная экспрессия представляет значение экспрессии 28 o C / значение экспрессии 20 o C. Результаты qRT-PCR были основаны на трех биологических повторностях. Планки погрешностей = SD. (G) Относительная длина гипокотилей 7-дневных проростков, выращенных на свету. Относительная длина гипокотиля представляет собой значение длины 28 o C / значение длины 20 o C.Планки погрешностей = SEM (n ≥ 22).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007455.g007

    Для более точного изучения кинетики индукции ауксином SAUR и PP2C . Экспрессия гена D , мы исследовали уровни транскриптов SAUR9 , 19 , 23 и PP2C . D1-9 гены в 3-дневных выращенных на свету проростках дикого типа, обработанных 5 мкМ NAA в течение 2 часов с помощью qRT-PCR. Индукция ауксином экспрессии гена SAUR наблюдалась в течение 10 минут, а пик индукции приходился на 20-30 минут (фиг. 7C).В то время как ауксин также индуцировал PP2C . D1 и PP2C . Экспрессия гена D7 , кинетика была заметно задержана по сравнению с исследованными генами SAUR . ПП2С . D1 был слегка повышен через 30 минут, и экспрессия продолжала увеличиваться в течение 2 часов, тогда как PP2C . Экспрессия D7 не повышалась до 2 часов обработки ауксином (фиг. 7C). Эти результаты показывают, что по сравнению с генами SAUR , PP2C . D1 и PP2C . D7 демонстрируют отсроченный транскрипционный ответ на лечение ауксином.

    Высокая температура индуцирует экспрессию генов семейства SAUR19 , что способствует росту гипокотилей [43]. Нам было любопытно, может ли высокая температура также повлиять на PP2C . D экспрессия гена. ПП2С . D1pro : EGFP-GUS и PP2C . D (2–9) pro : PP2C . D (2–9) -GUS проростки были перемещены с 20 o ° C на 28 ° ° C на 24 часа или 5 дней, а затем окрашены вместе с контрольными проростками, поддерживаемыми при 20 ° ° C.Только PP2C . D2pro : PP2C . проростки D2-GUS показали повышенное окрашивание GUS в гипокотилях (фиг. 7D и S9). Поэтому мы провели временной курс, чтобы более тщательно изучить экспрессию PP2C.D2 в PP2C . D2pro : PP2C . D2-GUS проростков сместилось с 20 o ° C на 28 ° ° C. Хотя в ранние временные точки (6 ч) разницы не наблюдалось, сильное окрашивание GUS в гипокотилях и черешках проростков сместилось до 28 ° . C был замечен в более поздние моменты времени (рис. 7D).Чтобы получить дополнительные доказательства того, что высокая температура активирует уровни белка PP2C.D2, мы исследовали уровни белка PP2C.D2-GFP в PP2C . D2pro : PP2C . D2-GFP проростков сместились с 20 ° ° C на 28 ° ° C. Повышенные уровни белка PP2C.D2-GFP были обнаружены в побегах проростков, сдвинутых до 28 ° ° C в течение 5 дней (фиг. 7E). Вместе эти результаты показывают, что высокая температура повышает уровень белка PP2C.D2.Поскольку оба репортера GUS и GFP являются трансляционными слияниями, это зависимое от температуры повышение может быть результатом транскрипционной или посттранскрипционной регуляции. Чтобы определить, был ли этот эффект результатом повышенной транскрипции, мы исследовали PP2C . Уровни транскрипта D2 в выращенных на свету проростках дикого типа сдвинуты до 28 o ° C в течение 120 часов с помощью qRT-PCR. Как сообщалось ранее [43], высокая температура индуцировала экспрессию SAUR19 и SAUR22 в течение 3 часов, и уровни транскриптов оставались повышенными на протяжении всего времени (рис. 7F).Однако высокая температура не привела к повышению PP2C . D2 уровней транскрипта, предполагая, что наблюдаемое температурно-зависимое повышение уровней белка PP2C.D2-GUS и PP2C.D2-GFP должно происходить посттранскрипционно. Эти результаты предполагают, что в отличие от генов семейства SAUR19 , которые обнаруживают быстрый транскрипционный ответ на высокую температуру, PP2C.D2 обнаруживает замедленное посттранскрипционное увеличение содержания белка.

    Антагонистическая регуляция роста клеток белками SAUR и PP2C.Фосфатаза D2 привела нас к предположению, что высокотемпературная активация изобилия белка PP2C.D2 может представлять собой дополнительный уровень контроля для предотвращения чрезмерного расширения клеток, вызванного повышенной экспрессией гена SAUR , что может вызвать чрезмерный рост растений. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали реакции роста гипокотилей pp2c . d2-1 и pp2c . d2-2 мутанты с потерей функции к высокой температуре. Двухдневные проростки дикого типа, выращенные при температуре 20 o ° C, переносили на температуру 28 o ° C на 5 дней и оценивали рост гипокотилей.Действительно, оба pp2c . d2 Мутантные линии показали усиленный ответ на высокую температуру по сравнению с контролями дикого типа (фиг. 7G). Напротив, pp2c . d5 и pp2c . d6 Одиночные мутанты демонстрировали зависящее от температуры увеличение длины гипокотиля, которое было сопоставимо с диким типом. Кроме того, хотя файл pp2c . d2 / 5/6 Тройной мутант также демонстрировал повышенное удлинение при высокой температуре, это увеличение было не более серьезным, чем наблюдаемое с pp2c . d2 одиночных мутантов. Эти данные свидетельствуют о том, что высокая температура специфически активирует изобилие белка PP2C.D2 для предотвращения чрезмерного роста гипокотилей.

    Обсуждение

    Размножение клеток — это фундаментальный клеточный процесс, необходимый для роста и развития растений. Наша предыдущая работа предположила, что белки SAUR, локализованные на плазматической мембране, ингибируют активность фосфатазы PP2C.D, чтобы активировать PM H + -ATPases, тем самым способствуя размножению клеток [18]. Используя систему гипокотилей Arabidopsis в качестве модели, мы демонстрируем, что PP2C локализуется исключительно на плазматической мембране.Фосфатазы D2, D5 и D6 отрицательно регулируют рост гипокотилей (рис. 2A и S5A). Эти белки физически связываются с PM H + -АТФазами и негативно контролируют рост клеток за счет дефосфорилирования предпоследнего остатка треонина PM H + -ATPases (фиг. 4). Кроме того, мы демонстрируем, что все три фосфатазы могут взаимодействовать с SAUR19 в дрожжевых 2-гибридных анализах, что D5 коиммунопреципитируется с SAUR19 из растительных экстрактов и что ферментативная активность PP2C.D2 и D5 ингибируется связыванием SAUR.Хотя файл pp2c . d2 / 5/6 тройной мутант в значительной степени фенокопирует растения со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 , примечательно, что гипокотили выращенных на свету pp2c . Саженцы d2 / 5/6 все еще были немного короче, чем саженцы GFP-SAUR19 (рис. 3A и 3B). Это указывает на то, что помимо фосфатаз PP2C.D2, D5 и D6, дополнительные члены семейства PP2C.D могут вносить незначительный вклад в контроль длины гипокотиля. Согласуется с этой возможностью, все члены семьи, кроме PP2C . D7 сильно экспрессировались в гипокотилях (рис. 1A), и мы обнаружили, что все, кроме PP2C . D8 может противодействовать функции AHA2 в гетерологичной системе экспрессии дрожжей (фиг. 4D). Альтернативно, также возможно, что SAUR19 имеет регуляторные мишени в дополнение к фосфатазам PP2C.D, которые могут вносить вклад в SAUR19-опосредованную экспансию клеток. За исключением PP2C.D2, D5 и D6, оставшиеся члены семейства PP2C.D, по-видимому, не влияют на рост клеток при росте гипокотилей (S5A фиг.).Однако эти белки могут регулировать рост клеток, чтобы контролировать рост других конкретных органов или процессы развития. Подтверждая эту гипотезу, было обнаружено, что PP2C.D1 регулирует дифференциальный рост на апикальном крючке у этиолированных проростков [18, 24]. Наши результаты проясняют вклад отдельных фосфатаз PP2C.D в рост клеток и дают представление об увеличении клеток, индуцированном ауксином, через механизм кислотного роста.

    Предварительный компьютерный анализ белков PP2C.D идентифицировал предполагаемые сигналы двудольной ядерной локализации во всех 9 членах семейства и потенциальные трансмембранные области в PP2C.D1, D3, D4, D6, D7 и D9 [41]. Наш анализ PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP репортеров, а также предыдущее исследование с использованием 35Spro : PP2C . D-GFP репортеров [28] относительно плохо коррелируют с этими прогнозами. В то время как PP2C.D2, D5 и D6 локализованы исключительно на плазматической мембране, остальные члены семейства PP2C.D локализованы в различных клеточных компартментах, причем D8 демонстрирует митохондриальную локализацию, а D1, D3 и D4 проявляют как ядерную, так и цитозольную локализацию (рис. 2).В случае PP2C.D2, D5 и D6, два из которых лишены предсказанного трансмембранного размаха, неясно, как они ассоциируются с плазматической мембраной. Однако, поскольку все три физически взаимодействуют с PM H + -ATPases (фиг. 4C и S7), привлекательная гипотеза состоит в том, что они рекрутируются на плазматическую мембрану через свое взаимодействие с этими насосами H + . Что касается членов семейства, не относящихся к плазматической мембране, интересно отметить, что некоторые белки SAUR, как было показано, находятся в ядре (SAUR32 [44] и SAUR36 [45]) и цитозоле (SAUR32 [44], SAUR40 [ 46], SAUR41 [47], SAUR55 [45] и SAUR71 [46]).Однако функции белков SAUR в этих клеточных компартментах еще предстоит выяснить. Мы предполагаем, что эти белки SAUR могут регулировать сходным образом локализованные белки PP2C.D, чтобы контролировать статус фосфорилирования их соответствующих субстратов. Идентификация не локализованных в плазматической мембране регуляторных модулей SAUR-PP2C.D и их субстратов является захватывающей областью для будущих исследований.

    Наши исследования потери и увеличения функции демонстрируют, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 действуют как негативные регуляторы и контролируют различные процессы роста растений, включая рост корней, гипокотилей, листьев, цветов и стручков.Эти белки играют решающую роль в росте удлинения, таком как рост гипокотилей и тычинок (рис. 3 и 5). Рост удлинения тычинок на поздних стадиях развития тычинок имеет решающее значение для достижения зрелой пыльцой рыльца для успешного опыления. Мутанты yuc1 / 2/6 , tir1 afb1 / 2/3 и arf6 arf8 обнаруживают короткие тычинки [48-50], что указывает на важную функцию ауксина в росте удлинения тычинок. Было показано, что индуцированные ауксином гены семейства SAUR63 ( SAUR61-68 и SAUR75 ), вероятные нижестоящие мишени для факторов ответа на ауксин ARF6 и ARF8 [50], положительно регулируют рост удлинения тычинок [34], предполагая, что эти белки SAUR могут вносить вклад в опосредованный ауксином рост удлинения тычинок.Модель PP2C . Все гены D2 , D5 и D6 были высоко экспрессированы в тычинках (фиг. S1B) и pp2c . d2 / 5/6 и PP2C . D5 Цветки со сверхэкспрессией демонстрировали более длинные и более короткие тычинки, соответственно, чем у цветков дикого типа (фиг. 3I и 5J). Эти результаты убедительно показывают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 негативно регулируют рост удлинения тычинок и, следовательно, могут быть важны для репродуктивного успеха растений.Было бы интересно определить, взаимодействуют ли эти три фосфатазы физически с белками семейства SAUR63, чтобы регулировать рост удлинения тычинок. Наш подробный фенотипический анализ pp2c . d2 / 5/6 и GFP-SAUR19 растений показывают, что pp2c . d2 / 5/6 растений фенокопируют почти все известные фенотипы растений со сверхэкспрессией GFP-SAUR19 , включая повышенное размножение клеток, рост гипокотиля и листьев, дефектное развитие апикальных крючков и фототропный ответ, а также повышенное фосфорилирование PM H + -ATPase и активность (рис. 3).Эти находки предполагают, что фосфатазы PP2C.D2, D5 и D6 являются первичными эффекторами белков SAUR, локализованных в плазматической мембране, которые регулируют рост клеток.

    Дифференциальный рост имеет решающее значение для развития растений и их реакции на внешние раздражители, такие как свет и сила тяжести. Наши исследования вовлекают PP2C.D2, D5 и D6 как важные регуляторы дифференциального роста, т.к. тройной мутант обнаруживает дефекты как в фототропном изгибе, так и в развитии апикальных крючков. Ранее мы сообщали, что в то время как файл pp2c . d1 мутант обнаруживает дефекты развития апикального крючка, pp2c . Одинарные мутанты d2 , d5 и d6 демонстрировали апикальные крючки, сравнимые с контролем дикого типа [18]. Однако, в соответствии с нашей гипотезой, что эти фосфатазы действуют избыточно, этиолированный pp2c . d2 / 5/6 проростки демонстрировали явные дефекты в формировании апикальных крючков (рис. 3J и 3K). Интересно, что тогда как PP2C . D1 специфически экспрессируется на внутренней стороне апикальных крючков (рис. 1C, 1D и 2B), PP2C .Выражение D2 , D5 и D6 кажется равномерным по всей длине крючка (рис. 1C). Вместе с наблюдаемыми различиями в субклеточной локализации (Рис. 2) эти находки подтверждают, что PP2C.D1 и три PM-локализованные фосфатазы, вероятно, играют разные роли в модулировании развития апикальных крючков. Кроме того, в отличие от PP2C . D1 , единообразная экспрессия членов семейства, локализованных в PM через апикальный крючок, предполагает, что регуляторные белки д. Экспрессироваться по-разному для достижения PP2C.Дифференциальный рост, опосредованный D2 / D5 / D6. Так как ауксин играет важную роль в развитии крючка, и известно, что ауксиновый ответ варьирует в зависимости от апикального крючка [51], кажется вероятным, что регулируемые ауксином белки SAUR выполняют эту функцию. Подтверждение этому утверждению можно найти в предыдущих исследованиях экспрессии генов в органах, стимулированных тропами, которые показали, что несколько генов SAUR по-разному экспрессируются в стеблях и гипокотилях, стимулированных тропами, причем экспрессия выше на удлиненной стороне органа [ 37–39, 52–55].Поскольку белки SAUR ингибируют активность PP2C.D, можно ожидать, что этот дифференциальный паттерн экспрессии SAUR приведет к дифференциальной активности PP2C.D (и, следовательно, PM H + -АТФазы) по всему органу, что приведет к тропическому изгибу. Действительно, недавно сообщалось о дифференциальном закислении апопласта у гипокотилей Arabidopsis, стимулированных гравистимуляцией [20]. В pp2c . d2 / 5/6 мутант , однако, первичные эффекторы функции SAUR отсутствуют, и, следовательно, возникают дефекты развития апикальных крючков и тропического изгиба.

    В то время как гены SAUR быстро активируются в ответ на ауксин, мы не наблюдали опосредованную ауксином регуляцию большинства PP2C . D членов семейства в анализах репортера qRT-PCR или GUS (рис. 7C). ПП2С . D1 и PP2C . Однако D7 были заметными исключениями, поскольку оба гена были индуцируемыми ауксином, хотя и с замедленной кинетикой по сравнению с генами SAUR (рис. 7C). Хотя ни PP2C.D1 и PP2C. D7, по-видимому, играют важную роль в удлинении гипокотиля в стандартных условиях роста, возможно, что задержанная, индуцированная ауксином экспрессия потенциально может ослаблять SAUR-опосредованную регуляцию роста других органов или процессов, таких как развитие апикальных крючков. .

    Более убедительные доказательства функционирования повышенной экспрессии PP2C.D для ослабления SAUR-опосредованного роста наблюдались в наших исследованиях индуцированного высокой температурой удлинения гипокотиля. У проростков арабидопсиса, выращенных в условиях высоких температур, наблюдаются удлиненные гипокотили [56, 57].Наши предыдущие исследования показали, что высокая температура индуцирует экспрессию генов семейства SAUR19 , что способствует росту гипокотилей [43]. В этом исследовании мы обнаружили, что высокая температура также специфически повышает уровень белка PP2C.D2 (рис. 7D, 7E и S9). Это увеличение, по-видимому, происходит после транскрипции, поскольку температура не влияет на PP2C . D2 уровней мРНК. По сравнению с высокотемпературной индукцией генов SAUR , увеличение содержания белка PP2C.D2 показало замедленный ответ на высокую температуру (рис. 7D и 7F).Мы демонстрируем, что это увеличение экспрессии PP2C.D2 является биологически значимым, поскольку два независимых pp2c . d2 Мутантные проростки продемонстрировали усиленный рост гипокотилей в условиях высоких температур (фиг. 7G). Эти результаты являются убедительным подтверждением гипотезы о том, что высокотемпературная активация изобилия белка PP2C.D2 ослабляет рост гипокотилей, обеспечиваемый белками SAUR, предотвращая чрезмерный рост гипокотилей. Наши результаты предполагают новый уровень регуляции удлиненного роста, индуцированного высокой температурой.Определение основного механизма (ов), посредством которого температура влияет на изобилие белка PP2C.D2, такого как усиленная трансляция или повышенная стабильность белка, является захватывающей темой для будущих исследований, которые дополнительно прояснят наше понимание регуляции роста, индуцированного высокой температурой.

    Материалы и методы

    Растительный материал и условия роста

    Идентификаторы локуса Arabidopsis Genome Initiative для генов, использованных в этом исследовании, следующие: SAUR19, (At5g18010), SAUR9, (At4g36110), SAUR22 (At5g18050), SAUR23 (At5g18060), PP2C . D1 (At5g02760), PP2C . D2 (At3g17090), PP2C . D3 (At3g12620), PP2C . D4 (At3g55050), PP2C . D5 (At4g38520), PP2C . D6 (At3g51370), PP2C . D7 (At5g66080), PP2C . D8 (At4g33920), PP2C . D9 (At5g06750), PP2C . I1 (At2g25070), PP2C . F9 (At1g43900), AHA2 (4g31090) и AUX1 (At2g38120).

    Arabidopsis thaliana растений выращивали в условиях длинного дня (16 часов света / 8 часов темноты) при ~ 80 мкЭм -2 с -1 флуоресцентное освещение при 20–22 o C, если на рисунке не указано иное. легенды. Все трансгенные линии и мутанты относились к экотипу Columbia (Col). Поверхность семян стерилизовали в растворе, содержащем 30% отбеливателя и 0,04% тритона Х-100, и промывали стерильной водой. Семена обрабатывали холодом в течение 2-3 дней при температуре 4 o ° C для синхронизации прорастания.Проростки выращивали на чашках ATS, содержащих 1% сахарозы и 0,5% агаргеля (Sigma-Aldrich). Питательный раствор ATS содержал 5 мМ KNO 3 , 2,5 мМ KPO 4 , 2 мМ MgSO 4 , 2 мМ Ca (NO 3 ) 2 , 50 мкМ Fe-EDTA, 70 мкМ H 3 BO 3 , 14 мкМ MnCI 2 , 0,5 мкМ CuSO 4 , 1 мкМ ZnSO 4 , 0,2 мкМ Na 2 MoO 4 , 10 мкМ NaCI и 0,01 мкМ CoCI18 2 2 2 2 Для анализа подкисления среды 6-8-дневные проростки, выросшие на свету, переносили из среды ATS в чашки, содержащие 0.04 мг / мл бромкрезола пурпурного (BCP, Sigma) и 0,5% агаргеля с pH, доведенным до 6,5 с помощью КОН, и инкубировали при освещении в течение длительного дня, как описано выше. После того, как изменения цвета среды стали видны, планшеты отображали на планшетном сканере.

    Статистический анализ

    Все статистические анализы были выполнены с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с программным пакетом JMP Pro 13.1 (SAS Institute). Результаты теста HSD Тьюки (честно значимая разница) были сгруппированы по буквам, причем разные буквы указывали на значимые различия (P <0.05).

    Анализ фототропизма

    Стерилизованные семена обрабатывали холодом в течение 3 дней при 4 ° C в темноте, подвергали воздействию белого света в течение 2 часов при 20 o C, чтобы вызвать прорастание семян, а затем инкубировали в течение 4 дней при 20 o C в темноте. . Этиолированные проростки фотостимулировали односторонним синим светом в течение различного времени, а углы изгиба гипокотиля измеряли с помощью ImageJ. Синий свет (470 нм) обеспечивался световой системой SNAP LITE (Quantum Devices).

    Линии трансгенных растений

    ПП2С . D1-D9 геномных ДНК, содержащих промоторы и кодирующие последовательности без стоп-кодонов, амплифицировали с помощью ПЦР (таблица S1) и клонировали в pENTR / D-TOPO с использованием набора для клонирования pENTR directional TOPO (Invitrogen). В большинстве случаев вся межгенная область между и PP2C . D стартовый кодон и предыдущий ген были включены. Длина вышележащей промоторной последовательности для каждого гена указана в таблице S1.Эти PP2C . Вставки D рекомбинировали в pGWB203 (GUS) [58], pGWB204 (GFP) [58] и pEarleyGate 301 (HA) [59], используя смесь ферментов клоназы II Gateway LR (Invitrogen), чтобы получить PP2C . D (2–9) pro : PP2C . Д (2–9) -GUS , PP2C . D (1–9) pro : PP2C . D (1–9) -GFP и PP2C . D (2 , 5 , 6) pro : PP2C . D (2 , 5 , 6) -HA соответственно.Аналогично 4426 п.н. из PP2C . Последовательность промотора D1 была клонирована в pBGWFS7 (EGFP-GUS) [60] с получением PP2C . D1pro : EGFP-GUS конструкция. Все бинарные векторы вводили в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (вспомогательная плазмида pMP90) путем электропорации. Для трансформации Arabidopsis использовали метод окунания цветков [61]. Трансгенные растения отбирали на чашках ATS, содержащих 0,01% гербицида Баста (Bayer CropScience) или гигромицина (25 мкг / мл).

    Анализы GUS

    Окрашивание тканей растений GUS проводили при 37 o C в растворе, содержащем 100 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 10 мМ ЭДТА, 0,5 мМ K 4 Fe [CN] 6 , 0,5 мМ K 3 Fe [CN] 6 , 0,1% тритона X-100 и 1 мМ X-Gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-бета-D-глюкуронида, Gold Biotechnology). После удаления хлорофилла 70% этанолом ткани, окрашенные GUS, очищали в растворе, содержащем 20% молочной кислоты и 20% глицерина.Картины экспрессии GUS получали с помощью препаровального микроскопа Olympus SZX12 с использованием программного обеспечения SPOT Advanced imaging software.

    Коиммунопреципитация (ко-IP) и вестерн / дальний вестерн-блоттинг

    Микросомальные белки растений получали, как описано ранее [62]. Анализ Co-IP и вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее, за исключением того, что для вестерн-блоттинга использовали трис-буферный солевой буфер (TBST, 0,05% твин 20, pH 7,6) [18]. Фар-вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [32].Слитые белки GST-14-3-3 обнаруживали с помощью конъюгированного с HRP антитела против GST (GE Healthcare Life Sciences). Белки определяли с использованием субстратов максимальной чувствительности SuperSignal West Pico или West Femto (Thermo Scientific).

    Дрожжевые двугибридные тесты и анализы комплементации

    Дрожжевую двугибридную систему на основе lexA с использованием плазмиды-приманки pBTM116 и плазмиды-жертвы pACT2 [63] использовали для исследования взаимодействий фосфатаз SAUR19 и PP2C.D. pBTM116-SAUR19 и pACT2-PP2C.Плазмиды D котрансформировали в штамм дрожжей L40ccU3 [ MATa , his3-200 , trp1-901 , leu2-3 , 112ade2 LYS2 :: (lexAop) 4-HIS3 , :: (lexAop) 8-lacZ , GAL4 , gal80 ] [63], высевали на подходящую среду для селекции и выращивали при комнатной температуре в течение 3–6 дней.

    Saccharomyces cerevisiae штамм RS-72 ( MATa , ade1-100 , his4-519 , leu2-3 , 312 , GAL1pro : PMApro : PMApro ) AHA2 Конструкция в экспрессионной плазмиде pMP1745 была описана ранее [40]. ПП2С . Д1-9 , ПП2С . I1 и PP2C . F9 полноразмерных кДНК были клонированы в сайт Not I вектора экспрессии pMP1612 [40]. Все плазмиды были введены в дрожжевой штамм RS-72 путем трансформации ацетатом лития. PMA1 тесты комплементации были выполнены, как описано ранее [18].

    In vitro Анализы дефосфорилирования AHA2

    6xHis-SAUR9 и 6xHis-PP2C . D1 Конструкции в векторе экспрессии pET32 были описаны ранее [18]. Полноразмерные кДНК PP2C . D2 и PP2C . D5 в pENTR / D-TOPO были рекомбинированы в pET32-GW с использованием смеси ферментов Gateway LR clonase II для получения 6xHis-PP2C . D2 и 6xHis-PP2C . D5 бактериальных экспрессионных конструкций. Экспрессию и очистку His-меченых рекомбинантных белков и анализы дефосфорилирования AHA2 проводили, как описано ранее [18].

    Количественная RT-PCR

    РНК получали из проростков с использованием набора RNeasy Plant Mini (Qiagen) или Nucleospin RNA Plant (Macherey-Nagel), и была включена обработка ДНКазой на колонке для удаления загрязняющей ДНК. Два микрограмма РНК использовали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV) (Promega). Реакции qRT-PCR проводили на системе LightCycler (Roche Applied Sciences) с использованием SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix (Sigma-Aldrich) или StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с использованием Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master. Смесь (Agilent Genomics).Праймеры для qRT-PCR были описаны ранее [18, 36], и результаты были основаны на трех биологических повторностях.

    Анализы бимолекулярной флуоресценции (BiFC)

    Полноразмерные последовательности кДНК без стоп-кодонов PP2C . D2 , D5 и D6 были клонированы в pENTR / D-TOPO. Эти вставки были впоследствии рекомбинированы в векторы-получатели pSPYNE и pSPYCE [64] с использованием смеси ферментов Gateway LR Clonase II Enzyme Mix для создания экспрессионных конструкций BiFC.Экспрессионные конструкции AHA2 и AUX1 BiFC были описаны ранее [18]. Все бинарные векторы вводили в штамм Agrobacterium GV3101 (с вспомогательной плазмидой pMP90) путем электропорации. Анализы BiFC проводили в системе временной экспрессии Nicotiana benthamiana , как описано ранее [65]. Для инфильтрации использовали листья растений Nicotiana benthamiana возрастом ~ 5 недель. Раствор для инфильтрации содержал 10 мМ MgCl 2 , 10 мМ MES-KOH (pH 5.6) и 150 мкМ ацетосирингона. Флуоресцентные сигналы в эпидермальных клетках листа наблюдались через три дня после инфильтрации.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *