ИЗОЛАЙТ-Л.Плиты ИЗОЛАЙТ-Л.Плиты минераловатные ISOLIGHT-L.Утеплитель ИЗОЛАЙТ-Л.
На главную > Теплоизоляционные материалы > ИЗОРОК > Плиты ИЗОЛАЙТ-Л
Плиты ИЗОЛАЙТ-Л (ISOLIGHT-L,ISOROC-L)
ИЗОЛАЙТ-Л – это вид минераловатной теплоизоляции ИЗОРОК. Утеплитель ИЗОЛАЙТ-Л представляет собой универсальные негорючие теплоизоляционные гидрофобизированные плиты, которые изготавливаются из природного сырья: минеральной ваты на основе каменных базальтовых пород. Универсальные плиты ИЗОЛАЙТ-Л производятся на современном оборудовании в соответствии с ТУ 5762-001-50077278-02,ТУ 5762-005-53792403-2010 и TC 4160-14,имеют прямоугольную форму и выпускаются с толщиной плиты от 50 мм до 200 мм.
Свойства и преимущества
- Низкая теплопроводность утеплителя
- Высокая степень гидрофобности плит
- Отличная паропроницаемость материала
- Высокая прочность плит на отрыв слоев
- Хорошая звуко-изолирующая способность
- Высокая прочность плиты при деформации
- Пожаробезопасность и огнестойкость
- Широкая область применения
- Экологически чистый материал
Область применения утеплителя ИЗОЛАЙТ-Л
Утеплитель ИЗОЛАЙТ-Л является ненагружаемой теплоизоляцией, и может использоваться для звукоизоляции и теплоизоляции различных строительных вертикальных, горизонтальных и наклонных ограждающих конструкций в зданиях всех типов как гражданского, так и промышленного назначения.
Основными областями применения теплоизоляционных плит ИЗОЛАЙТ-Л являются утепление каркасных стен и перегородок, устройство мансардных и межэтажных перекрытий, устройство покрытий скатных крыш. Также утеплитель ИЗОЛАЙТ-Л может применяться во внутреннем слое вентилируемых фасадов и при устройстве трехслойных конструкций стен, в случае трехслойной облегченной колодцевой и слоистой кладке.
Технические характеристики плит ИЗОЛАЙТ-Л (ISOLIGHT-L,ISOROC-L)
Наименование
| Показатель | Ед.измерения |
Плотность плиты | 40 | кг/м3 |
Толщина плиты | 50-200 | мм |
Ширина плиты | 500/600 | мм |
Длина плиты | 1000 | мм |
Теплопроводность утеплителя -При температуре 10 С -При температуре 25 С -При условиях эксплуатации А -При условиях эксплуатации Б |
0,036 0,038 0,040 0,042 |
Вт/(м.К) |
Сжимаемость | 30 | %, не более |
Водопоглощение при кратковременном и частичном погружении | 1,0 | кг/м2, не более |
Горючесть плиты | НГ | группа |
Содержание органических веществ, по массе | 2,5 | %, не более |
Изолайт цены, характеристики. Материал для звукоизоляции и теплоизоляции в любых видах строительства
Область применения
Плиты ИЗОЛАЙТ предназначены для примения в гражданском и промышленном строительстве в качестве ненагружаемой тепло-, звукоизоляции горизонтальных, вертикальных и наклонных строительных ограждающих конструкций всех типов зданий, в том числе: в трехслойной облегченной кладке (слоистой, колодцевой), каркасных стенах и перегородках, мансардах и межэтажных перекрытиях, во внутреннем слое вентилируемых фасадов.
Реализация строительного объекта требует тщательного подбора теплоизоляционного материала. Сегодня большой популярностью пользуется Isolite (Изолайт), который изготавливается из базальтовых пород. Его химические и физические свойства обеспечивают высокое качество теплоизоляции.
Плиты Изолайт получили широкое применение в промышленном и гражданском строительстве. Они служат теплоизоляционным элементом в ограждающих конструкциях для зданий любого типа, в том числе в слоистой или колодцевой кладке, каркасных перегородках, межэтажных перекрытиях и мансардах. Сюда в основном относятся сооружения, которым требуется обеспечить высокий уровень теплоизоляции без существенного нагружения конструкции. Плиты из этого материала также используются для создания внутреннего слоя в вентилируемых фасадах.
Изолайт обладает всеми свойствами, которые требуются от современных утеплителей. Отсутствие в его составе горючих веществ повышает степень пожаробезопасности объекта. За счет пористой структуры материал обладает низкой способностью проводить тепло. В результате снижаются теплопотери через ограждающие элементы здания и снижаются затраты на энергоносители.
Дополнительно Изолайт оснащается пароизоляционной мембраной. Это особенно актуально для помещений с повышенной влажностью. Благодаря хорошей паропроницаемости в помещении происходит циркуляция воздуха. При этом в утеплителе не скапливается влага.
Плиты Изолайт также отличаются хорошей упругостью. Это говорит о том, что размеры и свойства утеплителя не меняются со временем. Изолайт можно резать на части, что существенно облегчает процесс монтажа. Использование такого материала – это доступное и выгодное решение, позволяющее создать теплый и уютный дом.
Минплита ИЗОРОК ИЗОЛАЙТ-Л для перекрытий
Компания КонТРАСТ являясь дилером завода ISOROC, предлагает своим клиентам теплоизоляцию по оптовой цене! Сезонные скидки и скидки от объема. Так же мы осуществляем поставку материала в любую точку региона. Позвони и убедись в этом сам!
Описание изделия: негорючие гидрофобизированные плиты из минеральной ваты на основе каменных пород.
Область применения:
плиты ИЗОЛАЙТ предназначены для примения в гражданском и промышленном строительстве в качестве ненагружаемой тепло-, звукоизоляции горизонтальных, вертикальных и наклонных строительных ограждающих конструкций всех типов зданий, в том числе: в трехслойной облегченной кладке (слоистой, колодцевой), каркасных стенах и перегородках, мансардах и межэтажных перекрытиях, во внутреннем слое вентилируемых фасадов.
ИЗОЛАЙТ-Л
Технические характеристики | Единица измерения | Показатель |
| Плотность | кг/м3 | 40 |
| Длина | мм | 1000* |
| Ширина | мм | 500 (600)* |
| Толщина | мм | 50-200 |
| Теплопроводность | ||
| -При температуре 10 С | Вт/(м.К), | 0,036 |
| -При температуре 25 С | 0,038 | |
| -При условиях эксплуатации А | 0,043 | |
| -При условиях эксплуатации Б | 0,047 | |
| Водопоглощение по объему | %, не более | 1,5 |
| Влажность по массе | 0,5 | |
| Содержание органических веществ, по массе | 2,5 | |
| Сжимаемость | %, не более | 30 |
| Горючесть | группа | НГ |
ЗВОНИТЕ И ЗАКАЗЫВАЙТЕ СЕЙЧАС!
Характеристики штаммов Listeria monocytogenes, выделенных из молока и человека, и возможность передачи штаммов через молоко
Материалы и методы
Материалы. Образцы молока, полученные в Польше от коров без клинических признаков мастита , были собраны в 2015 году. Для каждой коровы 100 мл пробы из всех четырех сосков были собраны в один стерильный контейнер. Из 380 образцов молока 21 (5,5%) были положительными на L. monocytogenes .Десять генетически различных штаммов (генетическое сходство, ранее определенное для диагностических целей), выделенных из крови пациентов доктором. A. Jurasz (Университетская больница № 1 в Быдгоще, Польша) были использованы для оценки их лекарственной чувствительности и способности образовывать биопленки. Эпидемиологической связи между группами изолятов молока и крови не было. В исследование был включен эталонный штамм
Изоляция L. monocytogenes из молока. Анализ проб промежуточных и готовых продуктов проводился в соответствии с ISO 11290-1 (ISO 2017). Для выделения L. monocytogenes 25 мл молока добавляли к 225 мл бульона полуфрейзера (Merck, Польша) и инкубировали в течение 24 ч при 30 ° C. Затем 0,1 мл культуры переносили в 10 мл бульона Фрейзера (Merck, Польша) и проводили вторичное селективное обогащение при 37 ° C в течение 48 ч.Наконец, культуру высевали на агар ALOA (ChromoCult Listeria Selective Agar®, Merck, Польша) и агар OXFORD (Oxoid, Великобритания) и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C.
Идентификация штаммов, выделенных из молока.
Первоначальная видовая идентификация проводилась по морфологическим признакам на агаре ALOA (Merck, Польша). Типичная колония L. monocytogenes – бирюзово-голубая, окруженная зоной мутности.Затем была проведена мультиплексная ПЦР.Для рода Listeria использовались идентификационные праймеры (L1, L2) (Oligo.pl, Польша) на основе последовательности 16S рРНК (Border et al.1990), тогда как праймеры (LM1, LM2) на основе последовательности hly Ген позволил идентифицировать вид (Bansal 1996). ДНК
выделяли с использованием набора Genomic Mini AX Bacteria Spin (A&A Biotechnology, Польша) в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию проводили в смеси по 25 мкл, содержащей: 1 × буфер для ПЦР (Promega, США), 2.0 мМ MgCl 2 (ABO, Польша), 1,25 ммоль dNTP (Promega, США), 0,5 мкМ каждого из праймеров (Oligo.pl, Польша), ДНК-полимераза 1,0 U Taq (Promega, США), сверхчистая вода (Merck, Польша) и 2,0 мкл ДНК. Условия амплификации и последовательности праймеров представлены в таблице.
Таблица I
Праймеры, используемые для идентификации L. monocytogenes .
| Праймер Последовательность праймера (5 ‘- 3’) | Размер продукта ПЦР (п.о.) | Условия амплификации |
|---|---|---|
| L1 CAG CAG CCG CGG TAA TAC | 938 | Начальная денатурация – 94 ° C / 2 мин 30 циклов: денатурация – 94 ° C / 30 с отжиг, – 50 ° C / удлинение 30 с – 72 ° C / 1 мин окончательное удлинение – 72 ° C / 5 мин |
| L2 CTC CAT AAA GGT GAC CCT | ||
| LM1 CCT AAG ACG CCA ATC GAA | 750 | |
| LM2 AAG CAC TTG CAA CTG CTC |
Определение генетического родства л.monocytogenes штаммов, выделенных из молока. Все изоляты L. monocytogenes были генотипированы с использованием случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD) с неспецифическим праймером OPA-11 (5’-CA AT CG CC GT-3 ’) (Ozbey et al. 2006). Реакции проводили в смеси по 25 мкл, содержащей: 1 × буфер для ПЦР с 2,0 мМ MgCl 2 (Promega, США), 1,5 мМ MgCl 2 (ABO, Польша), 200 мкМ dNTP (Promega, США). States), 1,0 мкМ праймер OPA-11 (Oligo.pl, Польша), 1,25 U Taq ДНК-полимеразы (Promega, США), сверхчистой воды (Merck, Польша) и 3,0 мкл ДНК. Реакция состояла из шести циклов начальной стадии: денатурации (94 ° C / 1 мин), отжига (30 ° C / 2 мин) и элонгации (72 ° C / 1 мин), за которыми следовали 35 циклов: денатурации (94 ° C / 1 мин). C / 15 с), отжиг (37 ° C / 1 мин) и удлинение (72 ° C / 45 с) и окончательное удлинение (72 ° C / 10 мин). Продукты ПЦР разделяли на 1,5% агарозном геле в течение 150 мин при напряжении 80 В и окрашивали красителем Midori Green (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, Германия).
Для определения степени генетического родства между изолятами была построена филогенетическая дендрограмма в программе Phoretix 1D Pro (TotalLab). Кластеризация данных проводилась с использованием метода иерархической группировки UPGMA с коэффициентом Дайса.
Частота генов, кодирующих факторы вирулентности, в изолятах молока и крови. L. monocytogenes штаммов молока (18) и крови (10) были исследованы на множественные реакции ПЦР. В исследование были включены следующие гены вирулентности: actA (белок, индуцирующий сборку актина), hlyA (листериолизин O), iap (внеклеточный белок p60), inlA (интерналин A), inlB (интерналин B). ), plcA (фосфатидилинозитол-специфическая фосфолипаза C), plcB (фосфатидилхолин-специфическая фосфолипаза C) и prfA (положительный регуляторный фактор PrfA).
Две реакции мультиплексной ПЦР были оптимизированы для обнаружения этих генов вирулентности. Первый включал в себя обнаружение генов iap , hlyA , inlB и plcB , а второй – actA, inlA, plcA и prfA генов. Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1 × буфер для ПЦР с 2,0 мМ MgCl 2 (Promega, США), 6,0 мМ MgCl 2 (ABO, Польша), 1,0 мМ dNTP (Promega, США), 1,0 мМ. мкМ каждого праймера (Oligo.pl, Польша) (таблица), 3,0 ед. ДНК-полимеразы Taq (Promega, США), сверхчистая вода и 3,0 мкл ДНК. Ход ПЦР был следующим: начальная денатурация (95 ° C / 2 мин), 35 циклов денатурации (95 ° C / 15 с), отжиг (60 ° C / 30 с) и элонгация (72 ° C / 1 , 5 мин) и окончательное удлинение (72 ° C / 10 мин). В качестве эталонного штамма использовали штамм L. monocytogenes IW41. Продукты ПЦР разделяли на 1,5% агарозном геле и окрашивали красителем Midori Green (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, Германия).Использовали ДНК-лестницу Perfect 100 п.н. (EurX, Польша).
Таблица II
| Праймер | Последовательность праймера (5 ‘- 3’) | Размер продукта ПЦР (п.о.) | |
|---|---|---|---|
| actA – F | CGC CGC GGA AAT TAA AAA AAG A | 839 | |
| actA – R | ACG AAG GAA CCG GGC TGC TAG | ||
| hlyA – F | GCA GTT GCA AGC GCT TGG | hlyA – R | GCA ACG TAT CCT CCA GAG TGA TCG |
| iap – F | ACA AGC TGC ACC TGT TGC AG | 131 | |
| iap – R 900AG63G GTG TAG TAG CA | |||
| INLA – F | CAG GCA GCT ACA ATT ACA CA | 2 341 | |
| INLA – R | ATA TAG TCC GAA AAC CAC ATC T | ||
| дюймы – F | AGG AGA GGA TAG TGT GAA | 1905 | |
| дюймы – R | TTA TTT CTG TGC CCT PLA | ||
| CTG CTT GAG CGT TCA TGT CTC ATC CCC C | 1484 | ||
| plcA – R | ATG GGT TTC ACT CTC CTT CTA C | ||
| plcB – F | GTT63 CA GTC TTT CCG G794 | ||
| plcB – R | ACC TGC CAA AGT TTG CTG TGA | ||
| prfA – F | CAT GAA CGC TCA AGC AGA AG | 706 | 706 | prfA – RAAT TTT CCC AAG TAG CAG GA |
Оценка лекарственной чувствительности л.monocytogenes штаммов. Чувствительность к лекарствам 18 изолятов молока и десяти изолятов крови определяли методом дисковой диффузии на агаре Мюллера-Хинтона с 5% дефибринированной лошадиной кровью и β-НАД в концентрации 20 мг / л (MH-F, bioMérieux, Франция). . Для каждого штамма готовили суспензию 0,5 по шкале МакФарланда (7,6 × 10 7 КОЕ / мл ± 9,4 × 10 6 КОЕ / мл) в стерильном физиологическом растворе. Диски с пенициллином (1 ЕД), ампициллином (2 мкг), меропе – нем (10 мкг), эритромицином (15 мкг) и котримоксазолом (1.25–23,75 мкг) (Becton Dickinson, США). Инкубацию антибиотиков проводили в атмосфере, обогащенной 5% CO 2 , при 35 ° C в течение 18 часов. Результаты интерпретировали в соответствии с рекомендациями EUCAST v. 8.0.
Оценка способности к образованию биопленок L. monocytogenes штаммов. Количественная оценка образования биопленок штаммами L. monocytogenes была проведена на облученных фрагментах силиконовых доильных стаканов доильных аппаратов.В исследовании использовались фрагменты размером 1 × 1 см.
Интенсивность образования биопленок определялась количественным методом Kwiecińska-Piró (g et al. 2011) с некоторыми модификациями. Исследование проводилось на одном клиническом штамме, одном штамме, выделенном из молока, и эталонном штамме ATCC 19111. Стерильные фрагменты каучука (3 повтора для каждого штамма) помещали в пробирки, содержащие 3 мл бактериальных суспензий в Brain Heart Infusion. Бульон (BHI) (Merck, Польша) (0.5 шкалы Макфарланда). Инкубацию проводили в аэробной атмосфере при 37 ° C в течение 72 ч, среду заменяли стерильной каждые 24 ч. При каждой замене среды фрагменты каучука промывали стерильным PBS (фосфатно-солевым буфером) (BTL, Польша). В качестве отрицательного контроля использовали фрагменты каучуков, инкубированные в стерильной среде BHI (Merck, Польша). После инкубации образцы промывали PBS, помещали в пробирку, содержащую 3 мл PBS, и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут (30 кГц, 150 Вт) с ультразвуковым устройством Ultrasonic DU-4 (Nickel-Electro Ltd.). Затем образцы встряхивали в течение 10 минут (400 об / мин), готовили серийные 10-кратные разведения и инокулировали на среду Columbia Agar с 5% овечьей кровью (Becton Dickinson, США). После 24-часовой инкубации при 37 ° C было рассчитано количество колоний на 1 см 2 поверхности фрагмента (КОЕ / см-2).
Интенсивность образования биопленок L. monocytogenes наблюдали под конфокальным микроскопом. Для этого были приготовлены очень тонкие резиновые слайды и выращены биопленки, как описано выше.Затем образующие биопленку клетки на резиновых предметных стеклах окрашивали с помощью набора LIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (ThermoFisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Спред L. monocytogenes из-за загрязненной резины сосков. Передача L. monocytogenes через кожу вымени и в молоко. В эксперименте использовали лучистые стерилизованные, очищенные от жира кусочки кожи вымени коровы (1 × 1 см).Образование биопленки на стерильных резинах сосков оценивали, как описано выше (раздел «Оценка способности штаммов L. monocytogenes к образованию биопленок»). Для исследования были отобраны два из самых сильных и самых слабых штаммов, образующих биопленку L. monocytogenes , полученных как из молока, так и из крови, а также эталонный штамм.
Для оценки передачи бактерий из биопленки, образовавшейся на резине сосков, на кожу вымени (в соответствии с нашим методом), кусок кожи натирали загрязненной резиной в двух направлениях.Это имитировало вставку и извлечение соски в доильную чашку. Для каждого штамма использовали восемь фрагментов кожи в шести повторностях. После мазка каждый кусочек кожи (1–3 повтора) помещали в стерильный PBS (BTL, Польша) и подвергали 10-минутной обработке ультразвуком. Впоследствии были сделаны серийные 10-кратные разведения и посеяны на колумбийский агар с 5% овечьей кровью (Becton Dickinson, США). Через 24 часа при 37 ° C было подсчитано количество бактерий на 1 см 2 кожи вымени.Кроме того, для проверки пролиферации L. monocytogenes на коже фрагменты (повторы 4–6) оставляли при 25 ° C на 12 часов. Затем образцы помещали в стерильный PBS, обрабатывали ультразвуком и высевали на колумбийский агар с 5% овечьей крови (Becton Dickinson, США).
Для оценки передачи L. monocytogenes из биопленки, образованной на резинах сосков, в молоко, каждый каучук промывали 100 мл молока для ультрапастеризации. Затем 0,1 мл молока высевали на среду Columbia Agar с 5% овечьей кровью (Becton Dickinson, США), инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов и определяли количество бактерий в 1 мл молока.
Передача L. monocytogenes в вымя – резина соска – модель вымени. Для исследования были выбраны два самых сильных и самых слабых штамма, образующих биопленку, из L. monocytogenes , полученных из молока и крови, и эталонный штамм.
Были приготовлены бактериальные суспензии в стерильном PBS (BTL, Польша) (0,5 McF), и 50 мкл суспензии (шесть повторов) вылили на стерильные фрагменты кожи. После сушки при комнатной температуре стерильный резиновый кусок соска натирали в двух направлениях загрязненной кожей.Затем кусочки резины помещали (повторения 1–3) в стерильный PBS (BTL, Польша) и обрабатывали ультразвуком. Количество бактерий на 1 см 2 каучука определяли, помещая образец в колумбийский агар с 5% овечьей крови (Becton Dickinson, США) и инкубируя при 37 ° C в течение 24 часов. Оставшиеся загрязненные фрагменты резины сосков (повторы 4–6) использовали для протирания шести стерильных фрагментов кожи вымени. Количество перенесенных им бактерий, а также их размножение на коже вымени определяли, как описано ранее (« Transmission of L.monocytogenes на коже вымени и в молоко ”).
Статистический анализ. Статистический анализ результатов проводился с использованием программного обеспечения Statistica 12 PL (StatSoft).
Установлена частота генов факторов вирулентности у штаммов L. monocytogenes , выделенных из молока и крови. Статистический анализ результатов проводился с использованием критерия хи-квадрат и точного критерия Фишера при уровне значимости α = 0.05. Также были определены профили вирулентности тестируемых штаммов из обеих групп.
Число бактерий, повторно выделенных из биопленки, усредняли отдельно для обеих групп штаммов и сравнивали друг с другом и с эталонным штаммом с использованием дисперсионного анализа ANOVA и апостериорного критерия Бонферрони при уровне значимости α = 0,05.
Были протестированы множественные корреляции между устойчивостью к антибиотикам, генами вирулентности и интенсивностью образования биопленок среди клинических штаммов и молочных изолятов.Также были оценены отдельные корреляции между устойчивостью к антибиотикам и распространенностью генов вирулентности, устойчивостью к антибиотикам и интенсивностью образования биопленок, а также частотой генов вирулентности и интенсивностью образования биопленок. Коэффициенты корреляции оценивались по шкале Гилфорда.
Выделение и характеристика молочнокислых бактерий, выделенных из спелой шелковицы на Тайване
Braz J Microbiol. Октябрь-декабрь 2010 г .; 41 (4): 916–921.
И-шэн Чен
Кафедра биотехнологии, Университет Мин Чуань, No.5, De-Ming Rd., Gui-Shan Township, Taoyuan County 333, Taiwan
Hui-chung Wu
Кафедра биотехнологии, Ming Chuan University, No. 5, De-Ming Rd., Gui-Shan Township, Taoyuan Графство 333, Тайвань
Fujitoshi Yanagida
Институт энологии и виноградарства Университета Яманаси, 1–13–1 Киташин, Кофу, Яманаси 400–0005, Япония
Кафедра биотехнологии, Университет Мин Чуань, № 5, De-Ming Rd., Поселок Гуй-Шань, уезд Таоюань 333, Тайвань
Институт энологии и виноградарства, Университет Яманаси, 1–13–1 Киташин, Кофу, Яманаси 400–0005, Япония
* Соответствующий Автор.Почтовый адрес: Департамент биотехнологии, Университет Мин Чуань, № 5, Дорога Де-Мин, поселок Гуй-Шань, округ Таоюань 333, Тайвань; Тел: + 886–3–3507001 # 3540 Факс: + 886–3–3507001 # 3540 .; Эл. Почта: wt.ude.ucm.liam@gnehsiyΔ Первые два автора внесли равный вклад в эту работу.
Поступила 9 декабря 2009 г .; Пересмотрено 9 февраля 2010 г .; Принята 26 апреля 2010 г.
Abstract
Целью этого исследования было выделить, охарактеризовать и идентифицировать молочнокислые бактерии (LAB) из спелых ягод шелковицы, собранных на Тайване. Образцы спелой шелковицы были собраны на пяти фермах по выращиванию шелковицы, расположенных в разных уездах Тайваня. Из этих образцов было выделено 88 культур, продуцирующих кислоту, и изоляты были разделены на классы сначала по фенотипу, затем на группы с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и секвенирования рибосомной ДНК 16S (рДНК).Фенотипические и биохимические характеристики позволили идентифицировать четыре группы бактерий (от A до D). Weissella cibaria был наиболее распространенным типом LAB, распространенным на четырех фермах тутового дерева, а Lactobacillus plantarum был наиболее распространенным LAB, обнаруженным на оставшейся ферме. Десять W. cibaria и один Lactococcus lactis subsp. Изолят lactis продуцировал бактериоцины против индикаторного штамма Lactobacillus sakei JCM 1157 T .Эти результаты позволяют предположить, что различные LAB распространены в спелых ягодах шелковицы, и W. cibaria была самой распространенной LAB, обнаруженной в этом исследовании.
Ключевые слова: молочнокислых бактерий, шелковица, Weissella cibaria , бактериоцин, Тайвань
ВВЕДЕНИЕ
Шелковица ( Morus australis ) широко культивировалась в Китае и Юго-Восточной Азии на протяжении тысячелетий. Листья тутовых деревьев представляют собой незаменимую пищу для шелкопряда, а спелые плоды съедобны и широко используются в соках, винах и джемах (23).На Тайване широко распространены тутовые деревья, а спелые плоды всегда собирают в начале апреля. Спелые фрукты сладкие с очень мягким вкусом и поэтому популярны на Тайване. Хотя шелковица очень популярна, она не изучена подробно.
Часто сообщалось о выделении молочнокислых бактерий (LAB) из фруктов и овощей (2,3,7,14,18). Однако исследований LAB, связанных со спелой шелковицей, пока мало.
Бактериоцины, производимые LAB, вызвали особый интерес как потенциальные альтернативные безопасные коммерческие пищевые консерванты.ЛАБ использовались в качестве консервантов пищевых продуктов и кормов на протяжении веков, а ЛАБ, продуцирующие бактериоцин, могут заменить химические консерванты для предотвращения бактериальной порчи и роста патогенных бактерий в пищевых продуктах (6).
Цели этого исследования заключались в выделении LAB из спелых ягод шелковицы, идентификации изолятов на уровне видов и скрининге их на антибактериальную активность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Отбор проб
Образцы для выделения LAB были собраны на пяти фермах шелковицы (от M1 до M5), которые были соответственно расположены в следующих пяти округах Тайваня: Тайнань, Цзяи, Тайчжун, Мяоли и Таоюань.Фермы в этих округах перечислены с юга на север на расстоянии 40–70 км друг от друга. На каждой тутовой ферме случайным образом были собраны три отдельных образца спелых фруктов. Образцы были взяты в асептических условиях и упакованы в чистые пакеты, а затем сохранены при 4 ° C. Образцы были проанализированы в течение 24 часов после сбора на тутовых фермах.
Выделение LAB
ПланшетыMRS (de Man, Rogosa и Sharpe) -агар использовали для выделения LAB. Чтобы отличить бактерии, продуцирующие кислоту, от других бактерий, в чашки с MRS-агаром добавляли 1% CaCO 3 .Каждый образец шелковицы измельчали и смешивали с 0,75% -ным раствором NaCl. Разведения смешанного раствора (от 10 до 1000 раз) наносили непосредственно на поверхность чашек с MRS-агаром. Образцы инкубировали в анаэробных условиях (Mitsubishi AnaeroPak System, Pack-Anaero, Mitsubishi Gas Chemicals, Токио, Япония) при 30 ° C в течение 3-5 дней. Колонии бактерий-продуцентов кислоты, идентифицированные по чистой зоне вокруг каждой колонии, были случайным образом выбраны из чашек с MRS-агаром и очищены путем повторного высева на чашки с MRS-агаром.Колонии повторно отбирали и первоначально окрашивали по Граму и тестировали на продукцию каталазы. Были отобраны только грамположительные и отрицательные по каталазе штаммы. Отобранные штаммы хранили при –80 ° C в 10% обезжиренном молочном бульоне.
Идентификация изолятов
Анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ) и анализ последовательности 16S рибосомной ДНК (рДНК) были использованы для классификации и идентификации бактериальных изолятов. ДНК выделяли с использованием методов, описанных Kozaki et al .(12). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием набора для ПЦР для амплификации гена Takara Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) для приготовления реакционных смесей и проводили в системе Gene Amp PCR System 9700 (PerkinElmer Corp., Бостон, Массачусетс, США, США). USA) в соответствии с методами, описанными Chen et al . (4). ПДРФ-анализ 16S рДНК проводили методами, описанными Chen et al . (4). В этом исследовании для группировки использовались три рестрикционных фермента: Acc II (CG / CG), Hae, III (GG / CC) (16) и Alu, I (AG / CT) (22).
Для анализа последовательности 16S рДНК продукты ПЦР очищали с помощью набора Clean / Gel Extraction Kit (BioKit, Miaoli, Taiwan), а затем секвенировали с помощью следующего праймера: 5´-CTGCTGCCTCCCGTAG-3´ (27F). Секвенирование ДНК проводили с использованием анализатора ДНК ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Частичная последовательность, прибл. Опережая 1000 п.н., и последовательность вручную выровняли с помощью программного обеспечения Genetyx-Win версии 5.1. Гомологию последовательностей проверяли путем сравнения последовательностей, полученных с последовательностями в банке данных ДНК Японии (DDBJ; http: // www.ddbj.nig.ac.jp/) с помощью FASTA. Во время сравнения последовательностей исходный порог гомологии 99% требовался при сравнении необработанного результата секвенирования, в то время как 100% гомология требовалась для данных секвенирования с высоким отношением сигнал / шум.
Обнаружение антибактериальной активности
Метод диффузии в лунки агара, как описано Onda et al . (15) был использован для обнаружения и определения антибактериальной активности изолятов. В качестве индикаторных штаммов использовали Lactobacillus sakei JCM 1157 T , Listeria monocytogenes ATCC 19111 и Helicobacter pylori ATCC 43504 T . L. monocytogenes размножали в бульоне PBN (pH 7,3) со следующими компонентами: 0,5% пептон, 0,3% говяжий экстракт и 0,8% NaCl. H. pylori размножали в триптическом соевом агаре (Difco, Sparks, MD, USA) с добавлением 5% дефибринированной овечьей крови. Чтобы исключить действие молочной кислоты, антибактериальная активность была позже подтверждена корректировкой pH (21).
Влияние ферментов на антимикробную активность
Влияние различных ферментов на антимикробную активность определяли путем инкубации 500 мкл нейтрализованного и стерилизованного фильтрацией бесклеточного супернатанта с 20 мкл следующих растворов ферментов в конечной концентрации 3 мг. / мл соответственно: протеиназа К (pH 7.0), трипсин (pH 7,0) и каталаза (pH 7,0). Ферменты были приобретены у Sigma Chemicals, Сент-Луис, Миссури, США. После 5 ч инкубации при 37 ° C антимикробную активность определяли с помощью диффузионного анализа в лунках агара. Необработанные образцы использовали в качестве контроля, а L. sakei JCM 1157 T использовали в качестве индикаторного штамма.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Всего из образцов, собранных на тутовых фермах Тайваня, было выделено 88 штаммов бактерий-продуцентов кислоты. Из них 13 штаммов были выделены с фермы M1, 18 – с фермы M2, 20 – с фермы M3, 18 – с фермы M4 и 19 – с фермы M5 ().88 изолятов были разделены на четыре группы (от A до D) на основе морфологии клеток и результатов анализа RFLP 16S рДНК (). Из этих выделенных короткостержневых штаммов 54 были помещены в группу A, 14 – в группу B и 18 – в группу D, поскольку расщепление их ДНК с помощью Acc II, Hae III и Alu I дало такие же результаты. Шаблоны RFLP. Остальные кокковые изоляты были помещены в группу C.
Таблица 1
Изоляты спелой шелковицы
| Mulberry farm | Штамм No. | Вид | Mulberry farm | Номер штамма | Вид | Mulberry farm | Штамм № | Вид | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| M1 | H041703 | W. cibaria | 9057 9057 W. cibaria 9057L. pseudomesenteroides | I042210 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041706 | W. cibaria | M3 | L. I0plantarum | I042211 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041710 | W. cibaria | I041702 | L. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041711 | W. cibaria | I041703 | L. plantarum | I042213 | W.Cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041713 | W. cibaria | I041704 | W. W. cibaria | I041705 | W. cibaria | I042215 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041716 | W.cibaria | I041706 | L. plantarum | I042217 | W. plantarum | I042218 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041718 | W. cibaria | I041708 | L.plantarum | I042219 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041719 | W. cibaria | I0417011 | L. plantar pseudomesenteroides | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041720 | W. cibaria | I041710 | L. plantarum | I042502 | W.cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H041721 | W. cibaria | I041711 | L. plantarum | I042503 | 1 9057 9057 W W. cibaria | I041712 | L. plantarum | I042504 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M2 | H042001 | W.cibaria | I041713 | L. plantarum | I042505 | W. plantarum | I042506 | L. pseudomesenteroides | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042003 | W. cibaria | I0417000 | L.plantarum | I042507 | L. pseudomesenteroides | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042004 | L. pseudomesenteroides | I0417160 W. cibaria | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042005 | L. pseudomesenteroides | I041717 | L.plantarum | I042509 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042006 | W. cibaria | I0417118 | L. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042007 | L. pseudomesenteroides | I041719 | L. plantarum | I042511 | lactis subsp. lactis | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042008 | W. cibaria | I041720 | L. plantarum | I042512 | 9000senter | L | 1 | 9000senter 9000senter | L 9007 W. cibaria | M4 | I042201 | W. cibaria | I042513 | L.lactis subsp. lactis | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042010 | W. cibaria | I042202 | L. pseudomesenteroides | W I0425149 | W. L. pseudomesenteroides | I042203 | W. cibaria | I042516 | W.сибария | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042014 | L. pseudomesenteroides | I042204 | W. W. cibaria | I042205 | W. cibaria | I042518 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042016 | W.Cibaria | I042206 | W. cibaria | I042519 | W. cibaria | I042520 | W. cibaria | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042018 | W. cibaria | I042208 | L.pseudomesenteroides | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| H042021 | L. pseudomesenteroides | I042209 | 4 4 W. Acc II, Hae III и Alu I переваривают группы от A до D. Дорожка M, маркер размера; A, Acc II модели пищеварения; H, Hae III паттерны пищеварения; U, Alu I. Модели пищеварения. Для идентификации изолятов из каждой группы случайным образом были отобраны репрезентативные штаммы, и был проведен анализ секвенирования 16S рДНК. Результаты идентифицировали изоляты группы A как W. cibaria , группы B как Leuconostoc pseudomesenteroides , группы C как Lactococcus lactis subsp. lactis , а группа D – Lactobacillus plantarum. Последовательности, определенные в этом исследовании, были депонированы в базе данных DDBJ с последовательными номерами доступа {“type”: “entrez-nucleotide-range”, “attrs”: {“text”: “AB510744 to AB510757”, “start_term”: «AB510744», «end_term»: «AB510757», «start_term_id»: «244539476», «end_term_id»: «244539489»}} AB510744 – AB510757. При оценке ингибирующей активности в отношении индикаторного штамма L. sakei JCM 1157 T , четкие зоны ингибирования наблюдались для 10 W. cibaria и 1 L. lactis subsp. lactis изолятов. Однако только тот же L. lactis subsp. Штамм lactis , I042513, проявил ингибирующую активность против L. monocytogenes ATCC 19111, и ни один из изолятов не показал ингибирующей активности против H.pylori ATCC 43504 T (). Таблица 2Спектры ингибирования и действие ферментов на бактериоцин, продуцируемый молочнокислыми бактериями из спелой шелковицы.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||