Мембрана наружная – это… Что такое Мембрана наружная?
- Мембрана наружная
- Мембрана наружная
внешний слой клеточной стенки (см.) грам- бактерий. Основой М. н. являются липополисахаридный и липопротеидный слои, формирующие матрицу, в которой заключены специфические (матричные) белки. Молекулы 2 матричных белков (поринов) в соединении с липопротеином проникают через оба слоя, соединяются нековалентно с пептидогликаном и образуют канальцы с проходящими по ним в цитоплазму небольшими гидрофильными молекулами. Наружная поверхность М. н мозаична: в поля липопротеида вкраплены молекулы белков и липополисахарида. М. н. выполняет функции каркаса, барьера, специфического транспорта и простой диффузии веществ; протеины служат рецепторами для фагов, участвуют в конъюгации и контролируют деление клетки
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
.
- Мелиоидоз
- Мембрана ундулирующая
Смотреть что такое “Мембрана наружная” в других словарях:
Наружная запирательная мышца — Наружная запирательная мышца … Википедия
Мембрана клеточная — (лат. мембрана кожица) биологическая «кожица», окружающая протоплазму живой клетки (см. Клетка). Участвует в регуляции обмена веществ между клеткой и окружающей её средой. У некоторых клеток клеточная мембрана единственная структура, служащая… … Концепции современного естествознания. Словарь основных терминов
Ядерная оболочка я мембрана — Ядерная оболочка, я. мембрана * ядзерная абалонка, я. мембрана * nuclear envelope or n. membrane or karyotheca or karyolemma двойная липопротеидная мембрана, которая окружает ядра эукариотических клеток, отделяя их от цитоплазмы. Внешняя… … Генетика. Энциклопедический словарь
пограничная мембрана глиальная наружная
— (m. l. glialis externa, LNH) П. м., образованная нейроглией, отделяющая слой палочек и колбочек сетчатки от наружного зернистого слоя … Большой медицинский словарьМитохондрия — Электронномикроскопическая фотография, показывающая митохондрии млекопитающего в поперечном сечении Митохондрия (от … Википедия
Клеточная стенка (оболочка) бактерий — структура бактерий и грибов, располагающаяся между цитоплазматической мембраной и капсулой (если таковая имеется) или ионизированным слоем внешней среды. Защищает бактерии от осмотического шока (10 25 атм и более) и др. факторов, определяет форму … Словарь микробиологии
плазмалемма — наружная цитоплазматическая мембрана, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Участвует в обмене веществ между цитоплазмой и внешней средой и в построении клеточной стенки … Анатомия и морфология растений
Куртка штормовая
Кровено́сные сосу́ды — (vasa sanguifera, vaea sanguinea) образуют замкнутую систему, по которой осуществляется транспорт крови от сердца на периферию ко всем органам и тканям и обратно к сердцу. Артерии несут кровь от сердца, а по венам кровь возвращается к сердцу.… … Медицинская энциклопедия
Поверхностный слой — Длинный лучевой разгибатель запястья (m. extensor carpi radialis longus) (рис. 90, 113, 114, 116, 118, 122, 123, 125) сгибает пред плечье в локтевом суставе, разгибает кисть и принимает участие в ее отведении. Мышца имеет веретенообразную форму и … Атлас анатомии человека
|
Внешняя наружная мембрана – Справочник химика 21
Предполагается, что ионы Н -остаются связанными с внешней поверхностью мембраны, сообщая ей положительный заряд, а электроны, перенесенные на внутреннюю поверхность, заряжают ес отрицательно. В результате между двумя поверхностями мембраны возникает разность потенциалов. Передвижение протонов водорода (рнс. 44) с наружной стороны мембраны к внутренней рассматривается как процесс, сопряженный с присоединением остатков неорганического фосфата к АДФ и образованием АТФ. [c.264]Функции клеточной стенки прокариот. Клеточная стенка прокариот выполняет разнообразные функции механически заш иш ает клетку от воздействий окружаюш,ей среды, обеспечивает поддержание ее внешней формы, дает возможность клетке суш,ествовать в гипотонических растворах. В первую очередь, в этом заслуга пептидогликана. Структурная дифференцировка клеточной стенки у грамотрицательных прокариот, приведшая к формированию дополнительного слоя в виде наружной мембраны, значительно расширила круг функций клеточной стенки. Прежде всего это связано с проблемами проницаемости и избирательного транспорта веществ в клетку. Наружная мембрана имеет специфические и неспецифические каналы (диффузионные поры) для пассивного транспорта веществ и ионов, необходимых клетке, т. е. осуществляет функции дополнительного клеточного барьера (основной — ЦПМ). Она препятствует проникновению в клетку токсических веществ, что находит отражение в большей устойчивости грамотрицательных прокариот (сравнительно с грамположительными) к действию некоторых ядов, химических веществ, ферментов и антибиотиков. Появление у грамотрицательных прокариот дополнительной мембраны в составе клеточной стенки фактически привело к созданию обособленной полости (периплазматического пространства), отграниченной от цитоплазмы и внешней среды специфическими мембранами и несущей важную
Периплазматическое пространство, куда погружен пептидогликановый слой, заполнено раствором, в состав которого входят специфические белки, олигосахариды и неорганические молекулы. Периплазматические белки представлены двумя типами транспортными белками и гидролитическими ферментами. Транспортные белки — это переносчики, связывающиеся с соответствующими субстратами внешней среды и транспортирующие их от наружной мембраны к цитоплазматической. [c.37]
Клетки тканей животных не имеют обычно клеточной стенки. У клеток растений и многих микроорганизмов, напротив, имеется развитая многослойная клеточная стенка, находящаяся с наружной стороны от клеточной мембраны. Внутренние слои такой клеточной стенки служат конструкционным материалом, обеспечивающим достаточную жесткость формы клетки и устойчивость ее как к внешним механическим воздействиям, так и к тургорному давлению изнутри. [c.601]
Мембраны — полые волокна — изготовляют наружным диаметром от 40 мкм до 2,5 мм и внутренним диаметром от 20 мкм до 1,5 мм. Толщина стенки полого волокна должна обеспечивать его прочность и устойчивость при действии внешнего или внутреннего давления. Несмотря на сравнительно большую неравномерность пор, полые волокна получили распространение в аппаратах для обратного осмоса и ультрафильтрации, так как обеспечивают огромную поверхность фильтрации в единице объема аппарата. [c.564]
На четвертой стадии в пространстве между двумя мембранами синтезируется материал кортекса эндоспоры – модифицированный пептидогликан. Затем (5 стадия) на внешней стороне наружной мембраны за счет материала и ферментов цитоплазмы материнской клетки начинают синтезироваться белковые споровые покровы. На [c.96]
В растительных клетках мембраны составляют значительно меньшую часть клетки, чем в животных клетках. В животных клетках мембрана обычно служит наружной границей клетки и составляет единственную защиту от действия факторов внешней среды. Растительная клетка, напротив, снабжена относительно массивной клеточной стенкой, которая определяет форму клетки в силу своей жесткости и составляет значительную долю от общего веса клетки. Однако стенка растительной клетки не может осуществлять регуляцию передвижения жизненно важных веществ внутрь и наружу для этой цели служит выстилающая ее изнутри мембрана — такая же, какая окружает животную клетку. Внутри этой наружной мембраны размещаются другие мембраны различных типов. [c.44]
Под электронным микроскопом клеточная стенка грамположительных прокариот выглядит как гомогенный электронно-плотный слой,, толщина которого колеблется для разных видов от 20 до 80 нм. У грамотрицательных прокариот обнаружена многослойная клеточная стенка. Внутренний электронно-плотный слой толщиной порядка 2—3 нм состоит из пептидогликана. Снаружи к нему прилегает, как правило,, волнистый слой (8—10 нм), имеющий характерное строение две электронно-плотные полосы, разделенные электронно-прозрачным промежутком. Такой вид характерен для элементарных мембран. Поэтому трехконтурный внешний компонент клеточной стенки грамотрицательных прокариот получил название наружной мембраны. [c.26]
Помимо слоев клеточной стенки, типичных для большинства грамотрицательных эубактерий, у некоторых представителей этой группы обнаружены дополнительные слои разной электронной плотности, располагающиеся с внешней стороны от наружной клеточной мембраны. Однако до настоящего времени не ясно, относятся ли они к клеточной стенке, являясь результатом ее последующего усложнения, или же представляют собой структурные элементы многослойного чехла. [c.35]
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет многослойную структуру, где внутренний слой – пептидогликан, затем идут неплотно упакованные молекулы белка (глобулярный слой) внешний слой – липополисахарид и белок. О-специфические боковые цепи ЛПС формируют наружный липопротеиновый слой и проникают наружу от внешней мембраны на 1500 А. Структура ЛПС хорошо изучена. [c.369]
Это тонкостенная стеклянная мембрана, отделяющая раствор с постоянным значением pH (внутренний раствор) от раствора с измеряемым pH (внешний раствор). На внешней и внутренней поверхности стеклянной мембраны происходят процессы ионного обмена, приводящие к возникновению мембранного потенциала. Во внутренний и во внешний- растворы погружены два электрода, в большинстве случаев хлорсеребряных. Пренебрегая незначительными диффузионными потенциалами, в идеальном случае разность потенциалов ф между внутренним и наружным раствором можно выразить так [c.491]
Простейшим механизмом, обеспечивающим перемещение в пространстве нашей схематизированной клетки, представляется изменение поверхностного натяжения на границе раздела наружная мембрана — внешняя среда (вода). Причиной увеличения или уменьшения поверхностного натяжения может быть изменение соотношения гидрофобных и гидрофильных групп в липопротеидных комплексах, образующих мембрану. Если расстояние, на которое должны переместиться клетка, превышает ее линейные размеры, аппарат, обеспечивающий движение, должен работать периодически. Поэтому и изменения поверхностного натяжения должны быть периодическими. Периодические, обратимые изменения поверхностного натяжения в разных местах наружной мембраны приведут к беспорядочному, разнонаправленному перетеканию клетки с места на место — образованию псевдоподий и (к) амебоидному движению. Если такие изменения поверхностного натяжения будут происходить лишь в некоторых [c.168]
В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана (рис. 2.2), связанная посредством липо-протеина с подлежащим слоем пептидогликана. Наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, называемой цитоплазматической мембраной. Основной компонент этих мембран — бимолекулярный (двойной) слой липидов. Наружная мембрана является асимметричной мозаичной структурой, представленной липополиса-харидами, фосфолипидами и белками. С внешней стороны ее расположен липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов липида А, базисной части, или ядра (от лат. ore — кор), и 0-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями. Липополисахарид заякорен в наружной мембране липидом А (рис. 2.3), придающим токсичность липополисахариду, отождествляемому поэтому с эндотоксином. От липида А отходит базисная часть липополисахарида. Наиболее постоянной частью ядра липополисахарида является кетодезоксиоктоновая кислота. 0-специфическая цепь, отходящая от ядра липополисахарида, определяет серогруппу, серовар (разновидность бактерий, выявляемая с помощью иммунной сыворотки) определенного штамма бактерий. Таким образом, с понятием липополисахарида связаны представления об 0-антигене, по которому можно дифференцировать бактерии. [c.23]
Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (рис. 10, А). Специфическим компонентом наружной мембраны является липопо-лисахарид сложного молекулярного строения, занимающий около 30—40% ее поверхности и локализованный во внешнем слое (рис. 10, Б). [c.34]
Как видно из рис. 16.3, электроны движутся к внешней стороне мембраны, а протоны концентрируются на внутренней поверхности тилакоидов, т. е. направление протонного градиента противоположно направлению его в митохондриях. Таким образом, тилакоиды представляют собой как бы вывернутые наизнанку митохондрии, поэтому АТФ образуется с их наружной стороны и беспрегтятственно поступает в строму для участия в темновых стадиях фотосинтеза. [c.215]
Митохондрии — это замкнутые клеточные полиморфные структуры с многочисленными перегородками, возникающие в результате постепенной инвагинации цитоплазматической мембраны. Размеры митохондрий варьируют в широких пределах. Форма митохондрий может быть удлиненной, эллипсовидной или круглой. Эти органоиды ответственны за энергетический обмен клетки и в зависимости от энергонапряженности обмена в клетке внутренняя мембрана может иметь меньше (не напряженный обмен) или больше (энергонапряженный обмен) складок или трубочек (крист). Наружная мембрана митохондрий дрожжей очень прочна и однородна. Внутренняя мембрана неоднородна, к ней в большом количестве прикреплены грибовидные структуры, которые, по-видимому, являются местом сосредоточения ферментов, вероятнее всего, участвующих в процессе окислительного фосфорилирования. Внутренняя мембрана митохондрий, особенно кристы, более лабильна, чем внешняя. [c.28]
Содержимое клеточного ядра (нуклеоплазма) отделено от цитоплазмы ядерной оболочкой. Дцерная оболочка образована двойной мембраной. Сферическая внутренняя ядерная мембрана содержит специфические белки, выступающие в качестве сайтов связывания ядерной ламины, которая поддерживает мембрану и контактирует с хромосомами и ядерными РНК. Эта мембрана окружена внешней ядерной мембраной, очень схожей с мембраной эидоплазматического ретикулума, в которую она переходит (рис. 8-19). Внешнюю (наружную) ядерную мембрану можно рассматривать как особую часть мембраны ЭР. Подобно мембранам шероховатого ЭР (см. разд. 8.6.1), внешняя ядерная мембрана усеяна рибосомами, участвующими в синтезе белка. Белки, образованные на этих рибосомах, переносятся в пространство между внешней и внутренней ядерными мембранами (перинуклеарное пространство), которое в свою очередь связано с просветом ЭР (см. рис. 8-19). [c.24]
Клетку можно представить как систему взаимосвязанных мембран, так как имеются небезосновательные предположения, что наружная мембрана клетки, эндоплазматический ретикулум, митохондриальная, лизосомная, ядернея мембраны и аппарат Гольджи тесно связаны между собой. Одна из функций наружной клеточной мембраны — регуляция обмена веществ между внутриклеточным пространством и внешней средой. Тем не менее еще мало известно о динамике и функции клеточных мембран или о деталях той регулирующей роли, которую они могут играть. Описано несколько случаев, когда облучение влияло на внешние клеточные мембраны. Например, облучение в дозах в диапазоне несколько десятков грей вызывает уменьшение проводимости нервного импульса в изолированных периферических нервах взрослых животных. Как известно, передача нервного импульса — результат избирательной диффузии ионов натрия и калия через мембрану аксона. Такие изменения электрической активности нервов, вызванные облучением, указывают на увеличение у аксона пассивной проницаемости для ионов. Изменения поведения и функции центральной нервной системы взрослых животных обнаруживаются после облучения в такой низкой дозе, как 0,5 Гр. Неизвестно, являются ли эти эффекты результатом первичных радиационных повреждений нервной ткани или же они обусловлены косвенным эффектом токсинов, освобождающихся из других поврежденных облучением тканей органов и систем. [c.44]
При выяснении роли белка 5-100 большинство исследователей придает особое значение взаимосвязи 5Н-групп данного белка с ионами Са2+, поскольку белок 5-100, соединяясь с Са2+, изменяет свою конфигурацию. При этом на наружной поверхности молекулы белка возрастает число гидрофобных групп, белок 5-100 становится более раствор1Имым в липидах и легче проникает внутрь мембраны, где содержится повышенное количество ионов К . Здесь происходит связывание белка 8-100 с К , что приводит к конформационным изменениям белка. Эта новая форма белка плохо растворяется в липидах, ибе-> лок направляется обратно на внешнюю поверхность, мембраны, где происходит отщепление К+ и снова ионы Са + присоединяются к белку 8-100. По мнению Хидена, в постсинаптпче-ских мембранах кроме данного белка участвуют актиногюдоб-ные белки, входящие в состав филаментов. К этим белкам также легко присоединяются ионы Са +. Таким образом, происхо- [c.148]
Наиболее неопределенрюй остается проблема механизма генерации Д лН HAДH-/ oQ-peдyктaзoй. Кажется вероятным, что по крайней мере часть пути здесь проходит протон. В противном случае пришлось бы постулировать, что часть переносчиков электронов этого звена дыхательной цепи находится на внутренней, а часть — на внешней стороне мембраны митохондрий. В действительности, на наружной поверхности таких центров выявить не удается. [c.120]
Несмотря на эти черты сходства между митохондриями и хлоропластами, последние устроены таким образом, что происходящие в них процессы Пфеноса электронов и протонов более доступны для изучения, чем в митохондриях. Разрушив внутреннюю и наружную мембраны хлоропластов, можно выделить неповрежденные тилакоидные диски. Они сходны с суб митохондриальными частицами компоненты электронтранспортной цепи, использующие NADP””, ADP и фосфат, тоже расположены здесь с внешней стороны мембраны. Однако тилакоиды представляют собой интактные естественные структуры и потому гораздо более активны, чем суб митохондриальные частицы, получаемые из митохондрий искусственным путем. Поэтому некоторые из экспериментов, впфвые доказавших ключевую роль хемиосмотического механизма, были проведены на хлоропластах, а не на митохондриях. [c.476]
О группе токсичных для бактерий белков (колицинов) уже шла речь в разд. Г, 7. Они, по-видимому, также связываются со специальными рецепторами на внешней мембране бактерий типа Е. соИ. Нейландс и его сотрудники обнаружили, что у Е. соН рецептор колицина М служит также рецептором и для сидерохромного пептида — феррохрома (дополнение 14-В), и для бактериофага Т5. С этим же участком мембраны связывается антибиотик альбомицин. Существует предположение, что на ранних этапах эволюции у бактерий появились молекулы, обладающие способностью к образованию хелатных комплексов с железом, причем размер этих комплексов постепенно увеличился до такой степени, что они утратили способность диффундировать через наружную мембрану в клетку. В результате возникли специфические системы переноса, которые позднее были использованы фагами к. штаммами, продуцирующими колицин . [c.306]
У грамотрицательных бактерий четко обозначается трехслой-ность клеточной стенки липополисахаридный слой (О-антиген), наружный слой (нередко обозначаемый как “внешняя мембрана”), состоящий из двух фосфолипидных листков, и подлежащий липопротеиновый слой Липополисахарид проявляет свойства эндотоксина, он занимает пограничное положение между внешней средой и подлежащим фосфолипидом (преимущественно — фосфатиди-лэтаноламином) [c.92]
Учитывая все изложенное, можно ожидать, что при смешении жидкого стекла с раствором, например СаСЬ, из-за различия pH растворов на границе двух жидких фаз быстрее всех будет протекать реакция гидролиза [обратная реакция (а), см. 3.1]. Нейтрализация заряда анионов приводит к их моментальной коагуляции на стыке фаз, и если концентрация силикатов достаточно велика, образуется мембрана с отрицательным зарядом со стороны силиката и положительным со стороны раствора хлорида кальция. При высокой вязкости силикатного раствора мембрана превратится постепенно в гелевую оболочку из скоагу-лировавшего кремнезема с небольшим градиентом концентрации по кальцию со стороны раствора СаСЬ и по натрию со стороны силиката. Так происходит, после просушки от внешней влаги, образование гранул из капель жидкого стекла или различных смесей на его основе, обладающих некоторой водостойкостью наружного, частично кальцинированного слоя, но не обладающих влагонепроницаемостью [58, 59]. Подобной технологией можно воспользоваться для обратной задачи — капсулирования кремнеземом водорастворимых соединений различных металлов и мало-Растворимых окислов. [c.115]
Наружная мембрана митохондрий – Справочник химика 21
Эта система участвует не только в синтезе ферментов, которые сек-ретируются клеткой, но и в образовании новых мембран. По-видимому, шероховатый ЭР поставляет мембранный материал гладкому ЭР и аппарату Гольджи, а компоненты мембран Гольджи включаются в состав наружной клеточной мембраны. В растительных клетках наружные мембраны митохондрий и мембраны, окружающие вакуоли, также образуются непосредственно из ЭР [19]. Компоненты наружных клеточных мембран, вероятно, могут использоваться повторно, включаясь в соответствующую структуру в ходе эндоцитоза [20]. [c.33]Наружная мембрана митохондрий [c.118]
A. Внутренняя и наружная мембраны митохондрий разделяют два митохондриальных компартмента внутреннюю область [c.71]
Цитозоль Пероксисомы Наружная мембрана митохондрий [c.172]
Наружные мембраны митохондрий могут быть разорваны путем осмотического шока И отделены от внутренних мембран [64]. Анализ фракции наружных и внутренних мембран показывает, что наружные мембраны имеют меньшую плотность ( 1 1 г/см ), чем внутренние Они легко прО(ннцаемы для большинства веществ с мол. весом 10 000 и ниже. Отношение фосфолипид/белок весьМа высокое ( 0,82 по весу), экстракция фосфолипидов ацетоном разрушает мембрану. Для этих фосфолипидов характерно низкое содержание кардиолипина и высокое содержание фосфоинозита и холестерйна. Убихинона в этих мембранах нет. Внутренняя мембрана (плотность 1,2 г/см ) для многих соединений непроницаема. Фактически, за исключением нейтральных молекул с мол. весом других соединений жестко контролируется. Отношение фосфолипид/белок во внутренней мембране имеет низкое значение (/ 0,27) кардиолипин составляет 20% общего содержания фосфолипидов. Во внутренней мембране присутствуют убихинон и другие компоненты дыхательной цепи. [c.392]
Наружная мембрана не содержит компоненты дыхательной цепи. С ней связаны ферменты, участвующие в удлинении молекул насыщенных жирных кислот, а также ферменты, катализирующие окисление, не связанное с синтезом АТФ, например моноаминоксвдаза и некоторые другие. Моноаминоксида-за может служить маркерным ферментом для идентификации наружной мембраны митохондрий. [c.198]
Двумя мембранами ограничены от цитоплазмы митохондрии. Внутренняя митохондриальная мембрана образует складки – кристы, которые увеличивают ее активную поверхность. Здесь на долю фосфолипидов приходится почти 30% от суммы липидов. Вся ферментативная активность принадлежит именно внутренней мембране, там находятся все ферменты. Наружная мембрана митохондрий более прочная, она не содержит ферментов дыхания и фосфорилиро-вания, но другие ферменты в ней есть. [c.43]
Митохондрии — это замкнутые клеточные полиморфные структуры с многочисленными перегородками, возникающие в результате постепенной инвагинации цитоплазматической мембраны. Размеры митохондрий варьируют в широких пределах. Форма митохондрий может быть удлиненной, эллипсовидной или круглой. Эти органоиды ответственны за энергетический обмен клетки и в зависимости от энергонапряженности обмена в клетке внутренняя мембрана может иметь меньше (не напряженный обмен) или больше (энергонапряженный обмен) складок или трубочек (крист). Наружная мембрана митохондрий дрожжей очень прочна и однородна. Внутренняя мембрана неоднородна, к ней в большом количестве прикреплены грибовидные структуры, которые, по-видимому, являются местом сосредоточения ферментов, вероятнее всего, участвующих в процессе окислительного фосфорилирования. Внутренняя мембрана митохондрий, особенно кристы, более лабильна, чем внешняя. [c.28]
Наружная мембрана митохондрии легко проницаема для большей части малых молекул и ионов. Различные ор1анические молекулы, и в их числе пируват — трехуглеродное соединение, образующееся при распаде шестиуглеродных сахаров в цито [c.48]
Наружная мембрана митохондрий содержит белки, которые образуют неспецифические поры, пропускающие вещества с молекулярной массой менее 10 000 (Zalman et al., 1980). Внутренняя мембрана является сопрягающей. Чем выще дыхательная активность ткани, из которой получены митохондрии, тем больше складок имеет внутренняя мембрана. На той стороне внутренней мембраны, которая обращена в матрикс (М-сторона), при негативном контрастировании фосфовольфраматом можно наблюдать грибовидные выросты, представляющие собой каталитические единицы АТР-синтетазных комплексов. Все ферменты цикла трикарбоновых кислот локализованы в матриксе, за исключением сукцинатдегидрогеназы, которая связана с М-стороной внутренней мембраны. Пулы NAD и NADP в матриксе и в цитозоле отделены друг от друга, в то время как АТР и ADP могут обмениваться между матриксом и цитозолем через обменный переносчик адениновых нуклеотидов, локализованный во внутренней мембране. [c.14]
Химический состав митохондрий. Наружная мембрана митохондрий печени служит в качестве защитного покрова специализированного функционального аппарата — крист. Этот покров напоминает эндоплазматическую сеть гепатоцитов по общему химическому составу, а именно распределению фосфоглицеридов, и содержит несколько (но не все) ферментов из числа связанных с микросомами, приготовленными из клеток гепатоцитов, например NADH-цитохром s-редуктазу (гл. 3) и глюкозо-6-фосфатазу (разд. 14.3.1). Эта мембрана служит в качестве легкопроницаемого барьера для молекул, имеющих молекулярную массу 10 000. [c.420]
Целостность наружной мембраны митохондрий определяют последовательными измерениями активности цитохром с оксидазы в отсутствии и присутствии 0,2% Тритона Х-100. Содержание белка в различных фракциях митохондрий определяют по методу Лоури (Lowry et al., 1951). [c.19]
НАРУЖНАЯ МЕМБРАНА ПАТОГЕННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА LEPTOSPIRA | Ваганова
1. Ананьина Ю.В., Зайцев С.В. Внутривидовая гетерогенность Leptospira interrogans по экологическим признакам // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы конф. — СПб., 1995. — С. 123.
2. Карасева Е.В. Некоторые особенности экологии патогенных лептоспир в естественных условиях природного очага // ЖМЭИ. — 1974. — № 5. — С. 36–40.
3. Куликов В.Н., Токаревич Н.К., Стоянова Н.А., Майорова С.О. Получение родоспецифических рекомбинантных антигенов лептоспир и изучение их активности // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы конф. — СПб., 2008. — С. 95.
4. Amutha R., Chaudhuri P., Garg A.P., Cheema P.S., Srivastava S.K. Immunoreactive outer membrane proteins of Leptospira interrogans serovar Canicola strain Hond Utrecht IV // Indian J. Med. Res. — 2006. — Vol. 124, N 5. — P. 569–574.
5. Artiushin S., Timoney J. F., Nally J., Verma A. Hostinducible immunogenic sphingomyelinase-like protein, Lk73.5, of Leptospira interrogans // Infect. Immun. — 2004. — Vol. 72, N 2. — P. 742–749.
6. Asuthkar S., Velineni S., Stadlmann J., Altmann F., Sritharan M. Expression and characterization of an iron-regulated hemin-binding protein, HbpA, from Leptospira interrogans serovar Lai // Infect. Immun. — 2007. — Vol. 75, N 9. — P. 4582–4591.
7. Atzingen M.V., Barbosa A.S., De Brito T., Vasconcellos S.A., de Morais Z.M., Lima D.M., Abreu P.A., Nascimento A.L. Lsa21, a novel leptospiral protein binding adhesive matrix molecules and present during human infection // BMC Microbiol. — 2008. — Vol. 8. — e70.
8. Barbosa A.S., Abreu P.A.E., Neves F.O., Atzingen M.V., Watanabe M.M., Vieira M.L., Morais Z.M., Vasconcellos S.A., Nascimento A.L. A newly identified leptospiral adhesin mediates attachment to laminin // Infect. Immun. — 2006. — Vol. 74, N 11. — P. 6356–6364.
9. J.K., Barnett D., Bolin C.A., Summers T.A., Wagar E.A., Cheville N.F., Hartskeerl R.A., Haake D.A. Expression and distribution of leptospiral outer membrane components during renal infection of hamsters // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67, N 2. — P. 853–861.
10. J.A., LeFebvre R.B., Pan M.J. Protein and antigen profiles of prevalent serovars of Leptospira interrogans // Infect. Immun. — 1991. — Vol. 59, N 5. — P. 1772–1777.
11. Braun V., Wolff H. The murein-lipoprotein linkage in the cell wall of Escherichia coli // Eur. J. Biochem. — 1970. — Vol. 14, N 2. — P. 387–391.
12. Bulach D.M., Kalambaheti T., de la Pea-Moctezuma A., Adler B. Functional analysis of genes in the rfb locus of Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo subtype Hardjobovis // Infect. Immun. — 2000. — Vol. 68, N 7. — P. 3793–3798.
13. Cachay E.R., Vinetz J.M. A global research agenda for leptospirosis // J. Postgrad. Med. — 2005. — Vol. 51, N 3. — P. 174–178.
14. Carvalho E., Barbosa A.S., Gmez R.M., Cianciarullo A.M., Hauk P., Abreu P.A., Fiorini L.C., Oliveira M.L., Romero E.C., Gon ales A.P., Morais Z.M., Vasconcellos S.A., Ho P.L. Leptospiral TlyC is an extra cellular matrix-binding protein and does not present hemolysin activity // FEBS Lett. — 2009. — Vol. 583, N 8. — P. 1381–1385.
15. Cerqueira G.M., McBride A.J., Picardeau M., Ribeiro S.G., Moreira A.N., Morel V., Reis M.G., Ko A.I., Dellagostin O.A. Distribution of the leptospiral immunoglobulin-like (lig) genes in pathogenic Leptospira species and application of ligB to typing leptospiral isolates // J. Med. Microbiol. — 2009. — Vol. 58, N 9. — P. 1173 –1181.
16. Chapman A.J., Everard C.O., Faine S., Adler B. Antigens recognized by the human immune response to severe leptospirosis in Barbados // Epidemiol. Infect. — 1991. — Vol. 107, N 1. — P. 143–155.
17. Chassin C., Picardeau M., Goujon J.M., Bourhy P., Quellard N., Darche S., Badell E., d’Andon M.F., Winter N., Lacroix-Lamand S., Buzoni-Gatel D., Vandewalle A., Werts C. TLR4- and TLR2-mediated B cell responses control the clearance of the bacterial pathogen, Leptospira interrogans // J. Immunol. — 2009. — Vol. 183, N 4. — P. 2669–2677.
18. Choy H.A. Kelley M.M., Chen T.L., Mller A.K., Matsunaga J., Haake D.A. Physiological osmotic induction of Leptospira interrogans adhesion: LigA and LigB bind extracellular matrix proteins and fibrinogen // Infect. Immun. — 2007. — Vol. 5, N 5. — P. 2441–2450.
19. Cinco M., Banfi E., Panfili E. Heterogeneity of lipopolysaccharide banding patterns in Leptospira spp // J. Gen. Microbiol. — 1986. — Vol. 132, N 4. — P. 1135–1138.
20. Croda J., Ramos J.G., Matsunaga J., Queiroz A., Homma A., Riley L.W., Haake D.A., Reis M.G., Ko A.I. Leptospira immunoglobulin-like proteins as a serodiagnostic marker for acute leptospirosis // J. Clin. Microbiol. — 2007. — Vol. 45, N 5. — P. 1528–1534.
21. Cullen P.A., Cordwell S.J., Bulach D.M., Haake D.A., Adler B. Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar Lai // Infect. Immun. — 2002. — Vol. 70, N 5. — P. 2311–2318.
22. Cullen P.A., Haake D.A., Bulach D.M., Zuerner R.L., Adler B. LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species // Infect. Immun. — 2003. — Vol. 71, N 5. — P. 2414–2421.
23. Dey S., Mohan C.M., Ramadass P., Nachimuthu K. Diagnosis of leptospirosis by recombinant antigen based single serum dilution ELISA // Indian J. Med. Res. — 2008. — Vol. 128, N 2. — P. 172–177.
24. Dong H., Hu Y., Xue F., Sun D., Ojcius D.M., Mao Y., Yan J. Characterization of the ompL1 gene of pathogenic Leptospira species in China and cross-immunogenicity of the OmpL1 protein // BMC Microbiol. — 2008. — Vol. 8. — e223.
25. Eshghi A., Cullen P.A., Cowen L., Zuerner R.L., Cameron C.E. Global proteome analysis of Leptospira interrogans // J. Proteome Res. — 2009. — Vol. 8, N 10. — P. 456 4 – 4578.
26. Faine S., Adler B., Bolin C., Perolat P. Leptospira and Leptospirosis. — Melbourn: MediSci, 1999. — 272 p.
27. Feng C.Y., Li Q.T., Zhang X.Y., Dong K., Hu B.Y., Guo X.K. Immune strategies using single-component LipL32 and multi-component recombinant LipL32–41-OmpL1 vaccines against Leptospira // Braz. J. Med. Biol. Res. — 2009. — Vol. 42, N 9. — P. 796–803.
28. Flannery B., Costa D., Carvalho F.P., Guerreiro H., Matsunaga J., Da Silva E.D., Ferreira A.G., Riley L.W., Reis M.G., Haake D.A., Ko A.I. Evaluation of recombinant Leptospira antigen-based enzyme-linked immunosorbent assays for the serodiagnosis of leptospirosis // J. Clin. Microbiol. — 2001. — Vol. 39, N 9. — P. 3303–3310.
29. Guerreiro H., Croda J., Flannery B., Mazel M., Matsunaga J., Galvão Reis M., Levett P.N., Ko A.I., Haake D.A. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in hu mans // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69, N 8. — P. 4958–4968.
30. Haake D A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis // Microbiology. — 2000. — Vol. 146. — P. 1491–1504.
31. Haake D.A., Champion C.I., Martinich C., Shang E.S., Blanco D.R., Miller J.N., Lovett M.A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. // J. Bacteriol. — 1993. — Vol. 175, N 13. — P. 4225–4234.
32. Haake D.A., Chao G., Zuerner R.L. Barnett J.K., Barnett D., Mazel M., Matsunaga J., Levett P.N., Bolin C.A. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection // Infect. Immun. — 2000. — Vol. 68, N 4. — P. 2276 –2285.
33. Haake D.A., Martinich C., Summers T.A., Shang E.S., Pruetz J.D., McCoy A.M., Mazel M.K., Bolin C.A. Characterization of leptospiral outer membrane lipoprotein LipL36: downregulation associated with late-log-phase growth and mammalian infection // Infect. Immun. — 1998. — Vol. 66, N 4. — P. 1579–1587.
34. Haake D.A., Matsunaga J. Leptospira: a spirochaete with a hybrid outer membrane // Mol. Microbiol. — 2010.
35. Haake D.A., Mazel M.K., McCoy A.M., Milward F., Chao G., Matsunaga J., Wagar E.A. Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection // Infect. Immun. — 1999. — Vol. 67, N 12. — P. 6572–6582.
36. Haake D.A., Suchard M.A., Kelley M.M., Dundoo M., Alt D.P., Zuerner R.L. Molecular evolution and mosaicism of leptospiral outer membrane proteins involves horizontal DNA transfer // J. Bacteriol. — 2004. — Vol. 186, N 9. — P. 2818–2828.
37. Haake D.A., Walker E.M., Blanco D.R., Bolin C.A., Miller M.N., Lovett M.A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation // Infect. Immun. — 1991. — Vol. 59, N 3. — P. 1131–1140.
38. Hoke D.E., Egan S., Cullen P.A., Adler B. LipL32 is an extracellular matrix-interacting protein of Leptospira spp. and Pseudoalteromonas tunicate // Infect. Immun. — 2008. — Vol. 76, N 5. — P. 2063–2069.
39. Hung C.C., Chang C.T., Tian Y.C., Wu M.S., Yu C.C., Pan M.J., Vandewalle A., Yang C.W. Leptospiral membrane proteins stimulate pro-inflammatory chemokines secretion by renal tubule epithelial cells through toll-like receptor 2 and p38 mitogen activated protein kinase // Nephrol. Dial. Transplant. — 2006. — Vol. 21, N 4. — P. 898–910.
40. Isogai E., Isogai H., Kubota T., Fujii N., Hayashi S., Indoh T., Takagi S., Miura H., Kimura K. Apoptosis of lymphocytes in mice administered lipopolysaccharide from Leptospira interrogans // Zentralbl. Veterinarmed B. — 1998. — Vol. 45, N 9. — P. 529–537.
41. Isogai E., Isogai H., Kurebayashi Y., Ito N. Biological activities of leptospiral lipopolysaccharide // Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A. — 1986. — Vol. 261, N 1. — P. 53 – 64.
42. Koizumi N., Watanabe H. Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity // Vaccine. — 2004. — Vol. 22, N 11–12. — P. 1545–1552.
43. Lee S.H., Kim K.A., Park Y.G., Seong I.W., Kim M.J., Lee Y.J. Identification and partial characterization of a novel hemolysin from Leptospira interrogans serovar lai // Gene. — 2000. — Vol. 254. — P. 19–28.
44. Levett P.N. Leptospirosis // Clin. Microbiol. Rev. — 2001. — Vol. 14, N 2. — P. 296–326.
45. Lin X., Chen Y., Lu Y., Yan J., Yan J. Application of loop-mediated isothermal amplification method for the detection of pathogenic Leptospira // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2009. — Vol. 63, N 3. — P. 237–242.
46. Lin X., Chen Y., Yan J., Adler B. Recombinant multiepitope protein for diagnosis of leptospirosis // Clin. Vaccine Immunol. — 2008. — Vol. 15, N 11. — P. 1711–1714.
47. Lo M., Cordwell S.J., Bulach D.M., Adler B. Comparative transcriptional and translational analysis of leptospiral outer membrane protein expression in response to temperature // PLoS Negl Trop Dis. — 2009. — Vol. 3, N 12. — e560.
48. Longhi M.T., Oliveira T.R., Romero E.C., Gonales A.P., de Morais Z.M., Vasconcellos S.A., Nascimento A.L. A newly identified protein of Leptospira interrogans mediates binding to laminin // J. Med. Microbiol. — 2009. — Vol. 58, N 10. — P. 1275–1282.
49. Ludwig W., Euzby J., Whitman W.B. Draft taxonomic outline of the Bacteroidetes, Planctomycetes, Chlamydiae, Spirochaetes, Fibrobacteres, Fusobacteria, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Dictyoglomi, and Gemmatimonadetes. Bergey’s Manual Trust, Bergey’s Taxonomic Outlines. — Vol. 4. — P. 16.
50. Matsunaga J., Sanchez Y., Xu X, Haake D.A. Osmolarity, a key environmental signal controlling expression of leptospiral proteins LigA and LigB and the extracellular release of LigA // Infect. Immun. — 2005. — Vol. 73, N 1. — P. 70–78.
51. Matsunaga J., Young T.A., Barnett J.K., Barnett D., Bolin C.A., Haake D.A. Novel 45-kilodalton leptospiral protein that is processed to a 31-kilodalton growth-phase-regulated peripheral membrane protein // Infect. Immun. — 2002. — Vol. 70, N 1. — P. 323–334.
52. Matsunaga J., Barocchi M.A., Croda J., Young T.A., Sanchez Y., Siqueira I., Bolin C.A., Reis M.G., Riley L.W., Haake D.A., Ko A.I. Pathogenic Leptospira species express surface-exposed proteins belonging to the bacterial immunoglobulin superfamily // Mol. Microbiol. — 2003. — Vol. 49, N 4. — P. 929–945.
53. Matsunaga J., Werneid K., Zuerner R.L., Frank A., Haake D.A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host // Microbiology. — 2006. — Vol. 152, N 12. — P. 3777–3786.
54. Nahori M.A., Fourni-Amazouz E., Que-Gewirth N.S., Balloy V., Chignard M., Raetz C.R., Saint Girons I., Werts C. Differential TLR recognition of leptospiral lipid A and lipopolysaccharide in murine and human cells // J. Immunol. — 2005. — Vol. 175, N 9. — P. 6022–6031.
55. Nally J.E., Chow E., Fishbein M.C., Blanco D.R., Lovett M.A. Changes in lipopolysaccharide O antigen distinguish acute versus chronic Leptospira interrogans infections // Infect. Immun. — 2005. — Vol. 73, N 6. — P. 3251–3260.
56. Nally J.E., Timoney J.F., Stevenson B. Temperature-regulated protein synthesis by Leptospira interrogans // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69, N 1. — P. 400–404.
57. Nally J.E., Whitelegge J.P., Bassilian S., Blanco D.R., Lovett M.A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection // Infect. Immun. — 2007. — Vol. 75, N 2. — P. 766–773.
58. Nascimento A.L., Verjovski-Almeida S., Van Sluys M.A., Monteiro-Vitorello C.B., Camargo L.E., Digiampietri L.A., Harstkeerl R.A., Ho P.L., Marques M.V., Oliveira M.C., Setubal J.C., Haake D.A., Martins E.A. Genome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni // Braz. J. Med. Biol. Res. — 2004. — Vol. 37, N 4. — P. 459–477.
59. Okuda M., Sakai Y., Matsuuchi M., Oikawa T., Watanabe M., Itamoto K., Iwata H., Kano R., Hasegawa A., Onishi T., Inokuma H. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein // J. Vet. Med. Sci. — 2005. — Vol. 67, N 3. — P. 249 –254.
60. Oliveira T.R., Longhi M.T., de Morais Z.M., Romero E.C., Blanco R.M., Kirchgatter K., Vasconcellos S.A., Nascimento A.L. Evaluation of leptospiral recombinant antigens MPL17 and MPL21 for serological diagnosis of leptospirosis by enzyme-linked immunosorbent assays // Clin. Vaccine Immunol. — 2008. — Vol. 15, N 11. — P. 1715–1722.
61. Palaniappan R.U.M., Chang Y.-F., Hassan F., McDonough S.P., Pough M., Barr S.C., Simpson K.W., Mohammed H.O., Shin S., McDonough P., Zuerner R.L., Qu J., Roe B. Expression of leptospiral immunoglobulin-like protein by Leptospira interrogans and evaluation of its diagnostic potential in a kinetic ELISA / J. Med. Microbiol. — 2004. — Vol. 53. – P. 975–984.
62. Palaniappan R.U., Chang Y.F., Jusuf S.S., Artiushin S., Timoney J.F., McDonough S.P., Barr S.C., Divers T.J., Simpson K.W., McDonough P.L., Mohammed H.O. Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans // Infect. Immun. — 2002. — Vol. 70, N 10. — P. 5924–5930.
63. Palaniappan R.U., McDonough S.P., Divers T.J., Chen C.S., Pan M.J., Matsumoto M., Chang Y.F. Immuno protection of recombinant leptospiral immunoglobulin-like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection // Infect. Immun. — 2006. — Vol. 74, N 3. — P. 1745–1750.
64. Paster B.J., Dewhirst F.E., Weisburg W.G., Tordoff L.A., Fraser G.J., Hespell R.B., Stanton T.B., Zablen L., Mandelco L., Woese C.R. Phylogenetic analysis of the spirochetes // J. Bacteriol. — 1991. — Vol. 173, N 19. — P. 6101– 6109.
65. Patarakul K., Lo M., Adler B. Global transcriptomic response of Leptospira interrogans serovar Copenhageni upon exposure to serum // BMC Microbiol. — 2010. — Vol. 10. — e31.
66. Peсa-Moctezuma A. de la, Bulach D.M., Kalambaheti T., Adler B. Comparative analysis of the LPS biosynthetic loci of the genetic subtypes of serovar Hardjo: Leptospira interrogans subtype Hardjoprajitno and Leptospira borgpetersenii subtype Hardjobovis // FEMS Microbiol Lett. — 1999. — Vol. 177, N 2. — P. 319–326.
67. Picardeau M., Bulach D.M., Bouchier C., Zuerner R.L., Zidane N., Wilson P.J., Creno S., Kuczek E.S., Bommezzadri S., Davis J.C., McGrath A., Johnson M.J., Boursaux-Eude C., Seemann T., Rouy Z., Coppel R.L., Rood J.I., Lajus A., Davies J.K., M digue C., Adler B. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis // PLoS One. — 2008. — Vol. 3, N 2. — e1607.
68. Pinne M., Haake D.A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans // PLoS One. — 2009. — Vol. 4, N 6. — e6071.
69. Qin J.H., Sheng Y.Y., Zhang Z.M., Shi Y.Z., He P., Hu B.Y., Yang Y., Liu S.G., Zhao G.P., Guo X.K. Genome-wide transcriptional analysis of temperature shift in L. interrogans serovar lai strain 56601 // BMC Microbiol. — 2006. — Vol. 6. — e51.
70. Saengjaruk P., Chaicumpa W., Watt G., Bunyaraksyotin G., Wuthiekanun V., Tapchaisri P., Sittinont C., Panaphut T., Tomanakan K., Sakolvaree Y., Chongsa-Nguan M., Mahakunkijcharoen Y., Kalambaheti T., Naigowit P., Wambangco M.A., Kurazono H., Hayashi H. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine // J. Clin. Microbiol. — 2002. — Vol. 40, N 2.– P. 480–489.
71. Shang E.S., Exner M.M., Summers T.A., Martinich C., Champion C.I., Hancock R.E., Haake D.A. The rare outer membrane protein, OmpL1, of pathogenic Leptos pira species is a heat-modifiable porin // Infect. Immun. — 1995. — Vol. 63, N 8. — P. 3174–3181.
72. Shang E.S., Summers T.A., Haake D.A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species // Infect. Immun. — 1996. — Vol. 64, N 6. — P. 2322–2330.
73. Silva E.F., Medeiros M.A., McBride A.J., Matsunaga J., Esteves G.S., Ramos J.G., Santos C.S., Croda J., Homma A., Dellagostin O.A., Haake D.A., Reis M.G., Ko A.I. The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis // Vaccine. — 2007. — Vol. 25, N 33. — P. 6277–6286.
74. Srivastava S.K., Chaudhuri P., Thangapandian E., Mariya R., Amutha R. Evaluation of recombinant Leptospira interrogans serovar canicola outer membrane proteins as diagnostic antigen // Indian J. Med. Microbiol. — 2006. — Vol. 24, N 4. — P. 346–348.
75. Stevenson B., Choy H.A., Pinne M., Rotondi M.L., Miller M.C., Demoll E., Kraiczy P., Cooley A.E., Creamer T.P., Suchard M.A., Brissette C.A., Verma A., Haake D.A. Leptospira interrogans endostatin-like outer membrane proteins bind host fibronectin, laminin and regulators of complement // PLoS One. — 2007. — Vol. 14, N 11. — e1188.
76. Tahiliani P., Kumar M.M., Chandu D., Kumar A., Nagaraj C., Nandi D. Gel purified lipl32: a prospective antigen for detection of leptospirosis // J. Postgrad. Med. — 2005. — Vol. 51, N 3.– P. 164–168.
77. Verma A., Hellwage J., Artiushin S., Zipfel P.F., Kraiczy P., Timoney J.F., Stevenson B. LfhA, a novel factor h-binding protein of Leptospira interrogans // Infect. Immun. — 2007. — Vol. 74, N 5. — P. 2659–2666.
78. Vieira M.L., Pimenta D.C., de Morais Z.M., Vasconcellos S.A., Nascimento A.L. Proteome analysis of Leptospira interrogans virulent strain // Open Microbiol. J. — 2009. — Vol. 7, N 3. — P. 69–74.
79. Vieira M.L., Atzingen M.V., Oliveira T.R., Oliveira R., Andrade D.M., Vasconcellos S.A., Nascimento A.L. In vitro identification of novel plasminogen-binding receptors of the pathogen Leptospira interrogans // PLoS One. — 2010. — Vol. 5, N 6. — e11259.
80. Vijayachari P., Sugunan A.P., Shriram A.N. Leptospiro sis: an emerging global public health problem // J. Biosci. —2008. — Vol. 33, N 4. — P. 557–569.
81. Vinh T., Adler B., Faine S. Ultrastructure and chemical composition of lipopolysaccharide extracted from Leptospira interrogans serovar copenhageni // J. Gen. Microbiol. — 1986. — Vol. 132, N 1. — P. 103–109.
82. Werts C., Tapping R.I., Mathison J.C., Chuang T.H., Kravchenko V., Saint Girons I., Haake D.A., Godowski P.J., Hayashi F., Ozinsky A., Underhill D.M., Kirschning C.J., Wagner H., Aderem A., Tobias P.S., Ulevitch R.J. Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-dependent mechanism // Nat. Immunol. — 2001. — Vol. 4, N 2. — P. 346–352.
83. Yang C.W., Wu M.S., Pan M.J., Hsieh W.J., Vandewalle A., Huang C.C. The Leptospira outer membrane protein LipL32 induces tubulointerstitial nephritis-mediated gene expression in mouse proximal tubule cells // J. Am. Soc. Nephrol. — 2002. — Vol. 13, N 8. — P. 2037–2045.
84. Yang H.L., Zhu Y.Z., Qin J.H., He P., Jiang X.C., Zhao G.P., Guo X.K. In silico and microarray-based genomic approaches to identifying potential vaccine candidates against Leptospira interrogans // BMC Genomics. — 2006. — Vol. 7. — e293.
85. Zhang X.Y., Yu Y., He P., Zhang Y.X., Hu B.Y., Yang Y., Nie Y.X., Jiang X.G., Zhao G.P., Guo X.K. Expression and comparative analysis of genes encoding outer membrane proteins LipL21, LipL32 and OmpL1 in epidemic leptospires // Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). — 2005. — Vol. 37, N 1. — P. 649–656.
1_1 Строение клеточной мембраны | Кинезиолог
Клеточная мембрана (плазм
алемма или плазмолемма)Определение понятия
Клеточная мембрана (синонимы: плазмалемма, плазмолемма, цитоплазматическая мембрана, биомембрана) – это тройная липопротеиновая (т.е. “жиро-белковая”) оболочка, отделяющая клетку от окружающей среды и осуществлящая управляемый обмен и связь между клеткой и окружающей её средой.
Главное в этом определении – не то, что мембрана отделяет клетку от среды, а как раз то, что она соединяет клетку с окружающей средой. Мембрана – это активная структура клетки, она постоянно работает.
Биологическая мембрана – это ультратонкая бимолекулярная пленка фосфолипидов, инкрустированная белками и полисахаридами. Эта клеточная структура лежит в основе барьерных, механических и матричных свойств живого организма (Антонов В.Ф., 1996).
Образное представление о мембране
Мне клеточная мембрана представляетсся в виде решетчатого забора с множеством дверей в нём, который окружает некую территорию. Всякая мелкая живность может через этот забор свободно перемещаться туда и обратно. Но более крупные посетители могут входить только через двери, да и то не всякие. У разных посетителей ключи только от своих дверей, и через чужие двери они проходить не могут. Так вот через этот забор постоянно идут потоки посетителей туда и обратно, потому что главная функция мембраны-забора двойная: отделять территорию от окружающего пространства и в то же время соединять её с окружающим пространством. Для этого и существует в заборе множество отверстий и дверей – транспортных механизмов мембраны!
Свойства мембраны
1. Проницаемость.
2. Полупроницаемость (частичная проницаемость).
3. Избирательная (синоним: селективная) проницаемость.
4. Активная проницаемость (синоним: активный транспорт).
5. Управляемая проницаемость.
Как видим, основное свойство мембраны – это её проницаемость по отношению к различным веществам.
6. Фагоцитоц и пиноцитоз.
7. Экзоцитоз.
8. Наличие электрических и химических потенциалов, точнее разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами мембраны. Образно можно сказать, что “мембрана превращает клетку в “электрическую батарейку” с помощью управления ионными потоками”. Подробности: смотреть тут.
9. Изменения электрического и химического потенциала.
10. Раздражимость. Специальные молекулярные рецепторы, находящиеся на мембране, могут соединяться с сигнальными (управляющими) веществами, вследствие чего может меняться состояние мембраны и всей клетки. Молекулярные рецепторы запускают биохимические реакции в ответ на соединение с ними лигандов (управляющих веществ). Важно отметить, что сигнальное вещество воздействует на рецептор снаружи, а изменения продолжаются внутри клетки. Получается, что мембрана передала информацию из окружающей среды во внутреннюю среду клетки.
11. Каталитическая ферментативная активность. Ферменты могут быть встроены в мембрану или связаны с её поверхностью (как внутри, так и снаружи клетки), и там они осуществляют свою ферментативную деятельность.
12. Изменение формы поверхности и её площади. Это позволяет мембране образовывать выросты наружу или, наоборот, впячивания внутрь клетки.
13. Способность образовывать контакты с другими клеточными мембранами.
14. Адгезия – способность прилипать к твёрдым поверхностям.
Краткий список свойств мембраны
- Проницаемость.
- Эндоцитоз, экзоцитоз, трансцитоз.
- Потенциалы.
- Раздражимость.
- Ферментная активность.
- Контакты.
- Адгезия.
Функции мембраны
1. Неполная изоляция внутреннего содержимого от внешней среды.
2. Главное в работе клеточной мембраны – это обмен различными веществами между клеткой и межклеточной средой. Этому служит такое свойство мембраны как проницаемость. Кроме того, мембрана регулирует этот обмен за счёт того, что регулирует свою проницаемость.
3. Ещё одна важная функция мембраны – создание разности химических и электрических потенциалов между её внутренней и наружной сторонами. За счёт этого внутри клетка имеет отрицательный электрический потенциал – потенциал покоя.
4. Через мембрану осуществляется также информационный обмен между клеткой и окружающей её средой. Специальные молекулярные рецепторы, расположенные на мембране, могут связываться с управляющими веществами (гормонами, медиаторами, модуляторами) и запускать в клетке биохимические реакции, приводящие к различным изменениям в работе клетки или в её структурах.
Видео: Строение мембраны клетки
Видеолекция: Подробно о строении мембраны и транспорте
Строение мембраны
Клеточная мембрана имеет универсальное трёхслойное строение. Её срединный жировой слой является сплошным, а верхний и нижний белковые слои покрывают его в виде мозаики из отдельных белковых участков. Жировой слой является основой, обеспечивающей обособление клетки от окружающей среды, изолирующей её от окружающей среды. Сам по себе он очень плохо пропускает водорастворимые вещества, но легко пропускает жирорастворимые. Поэтому проницаемость мембраны для водорастворимых веществ (например, ионов), приходится обеспечивать специальными белковыми структурами – транспортёрами и ионными каналами. Зато важнейшие для всего живого газы – кислород и углекислый газ – легко перемещаются через мембрану как внутрь клетки, так и наружу.
Ниже представлены микрофотографии реальных клеточных мембран контактирующих клеток, полученные с помощью электронного микроскопа, а также схематический рисунок, показывающий трёхслойность мембраны и мозаичность её белковых слоёв. Для увеличения изображения кликните на него.
Отдельное изображение внутреннего липидного (жирового) слоя клеточной мембраны, пронизанного интегральными встроенными белками. Верхний и нижний белковые слои удалены, чтобы не мешать рассмотрению липидного двойного слоя
Рисунок выше: Неполное схематичное изображение клеточной мембраны (клеточной оболочки), приведённое в Википедии.
Учтите, что наружный и внутренний слои поверхностных белков здесь с мембраны сняты, чтобы нам лучше был виден центральный жировой двойной липидный слой. В реальной клеточной мембране сверху и снизу по жировой плёночке (мелкие шарики на рисунке) плавают большие белковые “острова”, и мембрана получается более толстой, трёхслойной: белок-жир-белок. Так что она на самом деле похожа на сэндвич из двух белковых “кусков хлеба” с жирным слоем “масла” посередине, т.е. имеет трёхслойное строение, а не двухслойное.
На этом рисунке маленькие голубые и белые шарики соответствуют гидрофильным (смачиваемым) «головкам» липидов, а присоединённые к ним «ниточки» — гидрофобным (несмачиваемым) «хвостам». Из белков показаны только интегральные сквозные мембранные белки (красные глобулы и желтые спирали). Желтые овальные точки внутри мембраны — это молекулы холестерола Желто-зеленые цепочки бусинок на наружной стороне мембраны — цепочки олигосахаридов, формирующие гликокаликс. Гликокаликс – это как бы углеводный (“сахарный”) “пушок” на мембране, образованный торчащими из неё длинными белково-углеводными молекулами.
Модель цитоплазматической мембраны: Перейти для просмотра
Живая клетка — это маленький «белково-жировой мешочек», заполненный полужидким желеобразным содержимым, которое пронизано плёнками и трубочками.
Стенки этого мешочка образованы двойной жировой (липидной) плёночкой, облепленной изнутри и снаружи белками — клеточной мембраной. Поэтому говорят, что мембрана имеет трёхслойное строение: белки-жиры-белки. Внутри клетки также есть множество подобных жировых мембран, которые делят её внутреннее пространство на отсеки (=компартменты). Такими же мембранами окружены клеточные органеллы: ядро, митохондрии, хлоропласты. Так что мембрана – это универсальная молекулярная структура, свойственная всем клеткам и всем живым организмам.
Слева – уже не реальная, а искусственная модель кусочка биологической мембраны: это мгновенный снимок жирового фосфолипидного бислоя (т.е. двойного слоя) в процессе его молекулярно-динамического моделирования. Показана расчётная ячейка модели – 96 молекул ФХ (фосфатидилхолина) и 2304 молекулы воды, всего 20544 атомов.
Справа – наглядная модель одиночной молекулы того самого липида, из которых как раз и собирается мембранный липидный бислой. Вверху у него гидрофильная (водолюбивая) головка, а снизу – два гидрофобных (боящихся воды) хвостика. У этого липида есть простое название: 1-стероил-2-докозагексаеноил-Sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (18:0/22:6(n-3)cis ФХ), но вам нет нужды его запоминать, если вы только не планируете довести своего преподавателя до обморока глубиной своих познаний.
Можно дать и более точное научное определение клетке:
Клетка – это ограниченная активной мембраной, упорядоченная, структурированная неоднородная система биополимеров, участвующих в единой совокупности обменных, энергетических и информационных процессов, и также осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.
Внутри клетка также пронизана мембранами, а между мембранами находится не вода, а вязкий гель/золь изменяемой плотности. Поэтому взаимодействующие молекулы в клетке не плавают свободно, как в пробирке с водным раствором, а в основном сидят (иммобилизованы) на полимерных структурах цитоскелета или внутриклеточных мембранах. И химические реакции поэтому проходят внутри клетки почти как в твердом теле, а не в жидкости. Наружная мембрана, окружающая клетку, также облеплена ферментами и молекулярными рецепторами, что делает её очень активной частью клетки.
Клеточная мембрана (плазмалемма, плазмолемма) – это активная оболочка, отделяющая клетку от окружающей среды и связывающая её с окружающей средой. © Сазонов В.Ф., 2016.
Из этого определения мембраны следует, что она не просто ограничивает клетку, а активно работает, связывая её с окружающей её средой.
Мембранные липиды
Жир, из которого состоят мембраны, – особенный, поэтому его молекулы принято называть не просто жиром, а «липидами», «фосфолипидами», «сфинголипидами».
В состав липидов мембран входят в основном фосфолипиды, сфингомиелины и холестерин, а также в меньших количествах гликолипиды.
С химической точки зрения фосфолипид состоит из четырёх частей: глицерина, двух жирных кислот с длинной углеводородной цепью, фосфорной кислоты и особой для каждого фосфолипида группы, которую принято называть характеристической группой. Трёхатомный спирт глицерин связывает через сложно-эфирную связь две жирные кислоты и остаток фосфорной кислоты, к которой присоединена характеристическая группа (например, этаноламин).
Рис. ___. Структурная формула фосфатидилэтаноламина как пример амфифильной (гидрофобной/гидрофильной) молекулы фосфолипида. Кроме этаноламина характеристической группой фосфолипида может быть также холин, инозитол, серин и некоторые другие молекулы.
Рис. ___. Молекулярная структура фосфатидилхолина (=лецитина). Источник изображения: https://pandia.ru/text/80/650/73429-4.php
Мембранная плёночка является двойной, т. е. она состоит из двух липидных плёночек, слипшихся друг с другом с помощью своих липидных “хвостиков”. Поэтому в учебниках пишут, что основа клеточной мембраны состоит из двух липидных слоёв (или из “бислоя“, т.е. двойного слоя). У каждого отдельно взятого липидного слоя одна сторона может смачиваться водой, а другая — не может. Так вот, эти плёночки слипаются друг с другом именно своими несмачивающимися сторонами. Примерно так можно соединить две щётки, направив их щетиной друг к другу и слегка придавив.
Мембранные белки
Белки мембраны включены в липидный двойной слой двумя способами:
- Гидрофильные радикалы аминокислот поверхностных мембранных белков связаны нековалентными связями с гидрофильной поверхностью липидного бислоя.
- Интегральные мембранные белки погружены в гидрофобную область бислоя.
Интегральные белки различаются по степени погруженности в гидрофобную часть бислоя. Они могут располагаться по обеим сторонам мембраны и при этом либо частично погружаются в мембрану, либо располагаются трансмембранно. Погруженная часть интегральных белков содержит большое количество аминокислот с гидрофобными радикалами, которые обеспечивают гидрофобное взаимодействие с липидами мембран. Гидрофобные взаимодействия поддерживают определенную ориентацию белков в мембране. Гидрофильная выступающая часть белка не может переместиться в гидрофобный слой. Часть мембранных белков ковалентно связана с моносахаридными остатками или олигосахаридными цепями и представляет собой гликопротеины. В отличие от нерастворимых фибриллярных белков растворимые белки имеют почти сферическую (глобулярную) форму. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций (Албертс и соавт., 1994).
Подвижными в мембране являются не только липиды, но и мембранные белки. Если белки не закреплены в мембране, они «плавают» в липидном бислое как в жидкости. Поэтому говорят, что биомембраны имеют жидкостно-мозаичную структуру. При этом «дрейф» белков в плоскости мембраны происходит достаточно легко, переход их с внешней стороны мембраны на внутреннюю («флип-флоп») невозможен, а переход липидов происходит крайне редко. Для «перескока» липидов необходимы специальные белки транслокаторы. Исключение составляет жир холестерин, который может легко переходить с одной стороны мембраны на другую. Интегральные мембранные белки имеют трансмембранные спирализованные участки (домены), которые однократно или многократно пересекают липидный бислой. Такие белки прочно связаны с липидным окружением. Периферические мембранные белки удерживаются на мембране с помощью липидного «якоря» и связаны с другими компонентами мембраны; например, они часто бывают ассоциированы с интегральными мембранными белками. У интегральных мембранных белков фрагмент пептидной цепи, пересекающий липидный бислой, обычно состоит из 21–25 преимущественно гидрофобных аминокислот, которые образуют правую трансмембранную α-спираль с 6 или 7 витками (Фалер, Шилдс, 2004).
Мембрана бактерий
Оболочка прокариотической клетки грамотрицательных бактерий состоит из нескольких слоёв, показанных на рисунке ниже.
Слои оболочки грамотрицательных бактерий:
1. Внутренняя трёхслойная цитоплазматическая мембрана, которая соприкасается с цитоплазмой.
2. Клеточная стенка, которая состоит из муреина.
3. Наружная трёхслойная цитоплазматическая мембрана, которая имеет такую же систему липидов с белковыми комплексами, как и внутренняя мембрана.
Общение грамотрицательных бактериальных клеток с внешним миром через такую сложную трёхступенчатую структуру не даёт им преимущества в выживании в суровых условиях по сравнению с грамположительным бактериями, имеющими менее мощную оболочку. Они точно так же плохо переносят высокие температуры, повышенную кислотность и перепады давления.
Рис. Сложная тройная клеточная оболочка грамотрицательных бактерий. Источник изображения: https://probakterii.ru/prokaryotes/organelles/membrana-bakterij.html
Рис. Сравнение оболочек грамположительных и грамотрицательных бактерий. Источник изображения: https://myslide.ru/presentation/512325_skachat-stroenie-bakterialnoj-kletki
Рис . Рафтовые неоднородности в мембране различного масштаба. а — Нанокластеры холестерола, сфингомиелина, гликосфинголипидов и белков плазматической мембраны различаются по составу. Считается, что в эти кластеры входят ГФИ-заякоренные белки, трансмембранные (ТМ) белки, специфичные для рафтов, и цитоплазматические белки, связанные с актиновыми филаментами. «Обычные» ТМ-белки не входят в состав рафтов. б — В ответ на внешние сигналы нанокластеры могут сливаться с образованием рафтовой платформы, важной для ТМ передачи сигналов и мембранного транспорта. в — Рафтовая фаза, видимая в микроскоп (ø ≈1 мкм), наблюдается исключительно в равновесных мембранных системах, таких как гигантские синтетические или мембранные везикулы. В «нативных» мембранах постоянный обмен веществом и энергией «дробит» рафтовую фазу до субдифракционных размеров…. Читайте дальше на Биомолекуле: https://biomolecula.ru/articles/lipidnyi-fundament-zhizni Источник изображения: https://biomolecula.ru/articles/lipidnyi-fundament-zhizni
Рис. Domain-length scales and the biomembrane as a protein–lipid composite material. (a) Length scales of domains in biomembranes. Shells, complexes and nanoclusters range from 1–10 nm, whereas nanodomains such as caveolae can be as large as 100 nm. (b) A schematic representation of the biomembrane as a composite of lipids and proteins. Estimates of lateral protein concentration are about 30,000 per μm2 based on rhodopsin in the rod outer segment28,29 and transmembrane proteins in the baby hamster kidney (BHK) cell membrane27. Lipids were assumed to occupy a surface area of ∼0.68 nm2 (diameter ∼0.93 nm) and an α-helix ∼1 nm2 (diameter ∼1.1 nm). A 30 × 30 nm2 section of membrane is depicted with 32 lipids on a side, 35 transmembrane proteins with 15 single-span, 12 tetraspan and eight heptaspan α-helical proteins, having assumed crosssectional areas in the plane of the membrane of 1 nm2, 4.5 nm2 and 8 nm2, respectively. Taking into account the area excluded by the proteins, the numerical lipid : protein ratio is ∼50. For a single-span helix with a diameter of ∼1.1 nm, there are about seven lipids in the first boundary layer; for a tetraspan protein with a diameter of ∼2.4 nm, there are about 11 lipids in the first boundary layer; for a heptaspan protein (such as rhodopsin) with a diameter of ∼3.2 nm, there would be about 14 lipids in the first boundary layer. Such first-boundary layer lipids are shown in white, whereas the second layer is shown in red. All other lipids are shown in yellow. Lipid-binding proteins and adaptors linking transmembrane proteins to membrane proximate cytoskeletal filaments are also depicted as different coloured structures beneath the plane of the membrane, but ectodomains of the membrane proteins are omitted for clarity. Источник изображения: https://www.nature.com/articles/ncb0107-7
Видеолекция: Плазматическая мембрана. Е.В. Шеваль, к.б.н.
Видеолекция: Мембрана как клеточная граница. А. Иляскин
Важность ионных каналов мембраны
Легко понять, что через мембранную жировую плёнку могут проникать в клетку только жирорастворимые вещества. Это жиры, спирты, газы. Например, в эритроцитх прямо через мембрану легко проходят внутрь и наружу кислород и углекислый газ. А вот вода и водорастворимые вещества (например, ионы) просто так через мембрану не могут пройти внутрь любой клетки. Это значит, что для них нужны специальные отверстия. Но если просто сделать отверстие в жировой плёнке, то оно тут же затянется обратно. Что же делать? Выход в природе был найден: надо сделать специальные белковые транспортные структуры и протянуть их сквозь мембрану. Именно так и получаются каналы для пропускания не растворимых в жире веществ – ионные каналы мембраны клетки.
Итак, для придания своей мембране дополнительных свойства проницаемости для полярных молекул (ионов и воды) клетка синтезирует в цитоплазме специальные белки, которые затем встраиваются в мембрану. Они бывают двух типов: белки-транспортёры (например, транспортные АТФазы) и белки-каналоформеры (образователи каналов). Эти белки встраиваются в двойной жировой слой мембраны и формируют транспортные структуры в виде транспортёров или в виде ионных каналов. Через эти транспортные структуры теперь могут проходить различные водорастворимые вещества, которые по-другому проходить сквозь жировую мембранную плёнку не могут.
Вообще, встроенные в мембрану белки ещё называются интегральными, именно потому что они как бы включаются в состав мембраны и пронизывают её насквозь. Другие белки, не интегральные, образуют как бы острова, «плавающие» по поверхности мембраны: либо по её наружной поверхности, либо по внутренней. Ведь всем известно, что жир является хорошей смазкой и скользить по нему получается легко!
Выводы
1. В целом, мембрана получается трёхслойной:
1) наружный слой из белковых «островов»,
2) жировое двухслойное «море» (липидный бислой), т.е. двойная липидная плёнка,
3) внутренний слой из белковых «островов».
Но есть ещё рыхлый наружный слой – гликокаликс, который образуют торчащие из мембраны гликопротеины. Они являются молекулярными рецепторами, с которыми связываются сигнальные управляющие вещества.
2. В мембрану встроены специальные белковые структуры, обеспечивающие её протицаемость для ионов или других веществ. Не надо забывать, что в некоторых местах жировое море пронизано интегральными белками насквозь. И именно интегральные белки образуют специальные транспортные структуры клеточной мембраны (смотрите раздел ). Через них вещества попадают внутрь клетки, а также выводятся из клетки наружу.
3. С любой стороны мембраны (наружной и внутренней), а также внутри мембраны могут располагаться белки-ферменты, которые влияют и на состояние самой мембраны и на жизнь всей клетки.
Так что мембрана клетки – это активная изменчивая структура, которая активно работает в интересах всей клетки и связывает её с окружающим миром, а не просто является “защитной оболочкой”. Это – самое важное, что надо знать про клеточную мембрану.
В медицине мембранные белки зачастую используются как “мишени” для лекарственных средств. В качестве таких мишеней выступают рецепторы, ионные каналы, ферменты, транспортные системы. В последнее время кроме мембраны мишенью для лекарственных веществ становятся также гены, спрятанные в клеточном ядре.
Видео: Введение в биофизику клеточной мембраны: Структура мембран 1 (Владимиров Ю.А.)
Видео: История, строение и функции клеточной мембраны: Структура мембран 2 (Владимиров Ю.А.)
Дополнительно: Антонов В.Ф., 1996.
Подробности о биомембранах на сайте Биомолекула
Читать далее:
© 2010-2021 Сазонов В.Ф. © 2010-2016 kineziolog.bodhy.ru, © 2016-2021 kineziolog.su
Описан механизм формирования структуры мембран митохондрий
Воздействие Mic60 на липососмы – формирование тубул (электронная микрография)
Manuel Hessenberger et al / Nature Communications, 2017
Немецкие ученые выяснили, как происходит формирование сложной структуры митохондриальных мембран. Выяснилось, что помимо образования изгибов, необходимо действие еще по крайней мере двух белков. Один из них «раскрывает» второй, после чего второй присоединяется к месту сочленения внутренней и внешней мембраны, а также меняет форму внутренней мембраны, создавая тубулоподобные структуры, которые в результате становятся кристами. Работа опубликована в Nature Communications.
Митохондрия — двумембранная органелла эллипсоидной формы. Митохондрии являются «энергетической станцией» эукариот, так как в ее мембранах происходит окисление органических соединений и использование высвобождающейся при этом энергии для генерации электрического потенциала, тепла и синтеза «батареек» — АТФ.
В соответствии с широко распространенной теорией симбиогенеза, когда-то давно митохондрии были самостоятельными бактериальными организмами. Симбиоз с ними, начавшийся около двух миллиардов лет назад, обеспечил эукариотам налаженную систему энергосбережения, а им, вероятно, дал взамен защиту и питание. У митохондрий до сих пор осталась собственная ДНК, кодирующая белки, но многие гены они утратили, и существовать самостоятельно они не могут.
Наружная мембрана митохондрий гладкая, имеет толщину около семи нанометров и наполовину состоит из липидов. В ней также имеются порины и ряд ферментов. Она служит, в основном, в качестве ограничивающего от цитоплазмы барьера, а также для транспорта веществ и, например, контакта с эндоплазматическим ретикулумом. Между внешней и внутренней мембраной имеется межмембранное пространство толщиной 10-20 нанометров. Внутренняя мембрана на три четверти состоит из белков, не имеет поринов и несет элементы дыхательной цепи, АТФ-синтазные комплексы и транспортные комплексы. Она образует многочисленные складки — кристы, и за счет этого ее площадь примерно в пять раз больше, чем площадь наружной мембраны. Внутри этой мембраны располагается митохондриальный матрикс.
Структуру двух мембран можно представить как многопальцевую перчатку, вшитую внутрь варежки. До сих пор было не вполне ясно, как именно происходит формирование такого лабиринта. Правильная структура важна не только для работы энергетических систем, но и, например, для деления митохондрий, и нарушения ее ведут к разрыву митохондрий, причем содержимое их может отравлять клетку.
Места, в которых кристы прилегают к внешней мембране, называются «сочленениями крист». Такое сочленение содержит комплекс MICOS, который помимо митохондриальных мембран включает по крайней мере семь белков. Именно он обеспечивают правильное формирование крист.
Два белка, Mic10 и Mic60, по-видимому, являются ключевыми элементами этого процесса, поскольку удаление их приводило к разрушению структуры внутренней мембраны. Было известно, что Mic10 принимает форму изогнутого каркаса, и движется вдоль мембраны, к которой он прикреплен. Именно он, по всей видимости, обеспечивает изгибание крист. Однако роль Mic60 до сих пор оставалась неясна.
Ученые выделили белки комплекса MICOS и рассматривали их взаимодействие с липидными мембранами (липосомами) отдельно от клетки. Оказалось, что Mic60 в свободной форме не прикреплен к мембране, а свернут таким образом, что соответствующее место крепления (сайт) его оказывается недоступным. Этот сайт консервативен у мышей, людей, бактерий, дрожжей, птиц и других организмов, что свидетельствует о его значительном возрасте и, соответственно, эволюционной значимости. При взаимодействии с комплексом MICOS, а именно, с белком Mic19, белок меняет конформацию, и сайт оказывается снаружи. Белок прикрепляется к внутренней мембране в месте ее сочленения с внешней мембраной.
Выяснилось, что помимо межмембранного контакта, он при этом выполняет еще важнейшую роль в формировании структуры крист. Он стабилизирует их изгибы, закрепляя мембраны в пространстве в виде длинных тубул. Такие белки можно представить как резинки, надетые на пальцы перчатки и держащие их на определенном расстоянии друг от друга. В отсутствии Mic19 этого не происходит. Таким образом, система Mic19–Mic60 оказывается необходимой для правильного формирования мембранной структуры митохондрий.
А о том, как митохондриями обмениваются нервные клетки, можно прочитать здесь.
Анна Казнадзей
Наружная мембрана бактерий – это эволюционирующий антибиотический барьер
Наружная мембрана (OM) дидерм «грамотрицательного» класса бактерий является важной органеллой и надежным барьером проницаемости, который не позволяет многим антибиотикам достигать своих внутриклеточных мишеней (1) . OM представляет собой уникальный асимметричный липидный бислой (рис.1): внутренний листок состоит из фосфолипидов (PL), а внешний листок состоит почти исключительно из гликолипида, называемого липополисахаридом (LPS, у бактерий, которые прикрепляют длинные повторы сахара к гликолипиду) или липоолигосахариду (LOS, у бактерий, которые присоединяют только короткий олигосахарид, чтобы покрыть гликолипид) (1).Сборка этих липидов в непрерывный барьер и то, как этот барьер поддерживается в ответ на повреждение, представляет собой увлекательную биологическую проблему. И PL, и LPS / LOS синтезируются внутри клетки, поэтому они должны сначала пройти через внутреннюю мембрану (IM), а затем пройти через враждебную водную периплазматическую среду, прежде чем они будут собраны в OM. Работа последнего десятилетия открыла белковый мостик, который связывает IM и OM и позволяет LPS / LOS течь непосредственно во внешнюю створку OM (2). Как PLs транспортируются в OM, остается загадкой.Понимание путей биогенеза ОМ является актуальной задачей. Срочно необходимы новые антибиотики против грамотрицательных бактерий (3). Уровень устойчивости к антибиотикам продолжает неуклонно расти, в то время как последний по-настоящему новый антибиотик, эффективный против грамотрицательных бактерий, был открыт в 1960-х годах (3). Есть надежда, что лечение, мешающее биогенезу ОМ, предложит новые смертельные терапевтические средства или поможет проникнуть грамотрицательными бактериями в существующие лекарства. Пока это обещание не реализуется, клиницисты все чаще вынуждены полагаться на антибиотики в крайнем случае, которые когда-то были исключены из-за их неблагоприятных профилей токсичности, включая нацеленный на ОМ антибиотик колистин (полимиксин E) (4).В PNAS Пауэрс и Трент (5) предоставляют новое понимание того, как устойчивые к колистину бактерии развивают улучшенную физическую форму, изменяя свой состав ОМ. Примечательно, что их работа предоставила неожиданное понимание транспорта PL в клеточной оболочке.
Рис. 1.Архитектура грамотрицательной оболочки. ОМ и ИМ разделены водной периплазмой. Липиды OM распределены симметрично, при этом поверхностные гликолипиды (LPS / LOS) удерживаются вместе за счет мостикового соединения двухвалентных катионов. PL находятся во внутренней створке, но могут неправильно локализоваться при повреждении OM.Пути PldA и Mla работают вместе, чтобы удалить неправильно локализованные PL и восстановить асимметрию. В LOS-дефицитных клетках конститутивная активность PldA и Mla вредна, поскольку клетка пытается поддерживать липидный бислой OM.
Строгая липидная асимметрия в бислое является ключом к барьерной функции OM (Fig. 1). LPS / LOS на поверхности клетки укрепляет мембрану от антибиотиков и детергентов (например, желчных солей) несколькими способами: во-первых, эти молекулы плотно упаковывают внешний листок насыщенными ацильными цепями, которые делают его чрезвычайно гидрофобным, и, во-вторых, липид и сахаридные части отдельных молекул LPS / LOS каждая несут отрицательные заряды, которые позволяют межмолекулярным мостиковым взаимодействиям происходить за счет связывания двухвалентных катионов (1).Эти мостиковые взаимодействия между соседними молекулами LPS / LOS приводят к тесным латеральным взаимодействиям, которые изолируют мембрану от антибиотиков и детергентов, которые в противном случае способны проникать в типичный бислой PL. Полимиксины, класс антибиотиков, который включает колистин, непосредственно повреждают ОМ, нарушая мостиковые взаимодействия LPS / LOS (6). Полимиксины – это катионные молекулы, которые конкурентно связывают отрицательные заряды на LPS / LOS, но, поскольку они не допускают мостиковых взаимодействий, полимиксины ослабляют латеральные взаимодействия LPS / LOS и дестабилизируют ОМ (рис.1) (6).
Несмотря на то, что колистин редко используется в качестве последнего средства лечения, резистентность к колистину не исчезла. Как правило, любая из нескольких ферментативных модификаций LPS / LOS может уменьшить его отрицательный заряд и тем самым уменьшить связывание колистина (6). Acinetobacter baumannii – распространенный патоген человека с множественной лекарственной устойчивостью, который лечится клинически колистином (6). Пауэрс и Трент (5) изучают штаммов A. baumannii , которые предприняли замечательный шаг по полной инактивации продукции LOS и приобрели высокую устойчивость к колистину.Для большинства грамотрицательных бактерий продукция LPS / LOS важна для жизнеспособности; A. baumannii относится к небольшой группе, которая может переносить потерю LOS (7). Эта стратегия резкого сопротивления не обходится без значительных затрат на фитнес. Отсутствие LOS радикально изменяет OM: PL заменяют LOS во внешней створке, и OM становится симметричным бислоем PL. В результате дефицит LOS вызывает серьезное снижение скорости роста in vitro, клетки становятся проницаемыми для больших антибиотиков, а вирулентность заметно снижается (8).
Последствия дефицита LOS очевидны, но штаммов A. baumannii остаются жизнеспособными. Что позволяет некоторым бактериям выжить без LPS / LOS, а другим – нет? Потенциально ответ может быть получен при изучении того, как A. baumannii адаптируется к потере LOS. Пауэрс и Трент (5) пытались получить представление о такой адаптации путем последовательного культивирования LOS-дефицитного A. baumannii и изучения спонтанных мутаций, которые возникают для улучшения приспособленности. В течение 120 поколений их данные сходятся к одному центральному выводу: когда OM сталкивается с дефицитом липидов (потому что LOS отсутствует), две системы, путь Mla и фосфолипаза PldA OM, которые, как предполагается, удаляют PL из OM, оказываются вредны для пригодности (рис.1). Спонтанно возникают мутации, инактивирующие как Mla, так и PldA, чтобы повысить скорость роста LOS-дефицитных клеток. Что еще более удивительно, эти мутации также каким-то образом помогают восстановить антибиотический барьер против крупных антибиотиков.
Химическое повреждение или дефекты сборки ОМ позволяют PL перемещаться к наружной створке (1). Эти неправильно локализованные PL нарушают липидную асимметрию и нарушают целостность барьера (1). Генетические данные из Escherichia coli показали, что Mla и PldA действуют вместе, чтобы сохранить липидную асимметрию ОМ (9).Мультибелковая система Mla имеет компоненты в каждом отсеке клеточной оболочки: интегральный липопротеин MlaA OM, растворимый периплазматический шаперон MlaC и комплекс транспортера IM ATP-связывающей кассеты (ABC) MlaBDEF (рис. 1) (9⇓⇓⇓ –13). Отсутствие какого-либо белка Mla инактивирует систему и позволяет PL накапливаться во внешнем листке (9). Неправильно локализованные PLs могут быть обнаружены (хотя и косвенно), потому что они становятся субстратами для реакции модификации LPS, которая происходит только во внешней створке OM (14).Эти PL также являются субстратами для PldA фосфолипазы, активный сайт которой стратегически расположен во внешнем листке (15). PldA процессивно деградирует неправильно локализованные PL, чтобы удалить их из OM (Fig. 1) (15). В клетках дикого типа инактивация мутации pldA не вызывает значительных дефектов (9). Однако объединение мутаций в pldA и mla вызывает серьезную чувствительность к детергентам и заметное увеличение неправильно локализованных PL; эти дефекты у двойного мутанта больше, чем наблюдаемые с любой одиночной мутацией (9).Более того, спонтанные супрессорные мутации, которые увеличивают продукцию PldA, могут дополнять дефекты мутаций в mla .
Поскольку их отсутствие приводит к большему количеству PL во внешней створке OM, путям Mla и PldA приписывают роли в удалении PL из OM: PldA путем деградации неправильно локализованных PL и Mla путем транспортировки их обратно в IM. Действительно, IM-белок MlaD принадлежит к классу белков, которые участвуют в импорте липидов в различных организмах. MlaD обладает доменом входа в клетки млекопитающих (MCE), который был идентифицирован в diderm Mycobacterium tuberculosis как важный для вирулентности, но с тех пор было показано, что этот домен связывает липиды (10, 12).В M. tuberculosis белки MCE необходимы для импорта липидов, что позволяет этим бактериям метаболизировать холестерин хозяина (16). Белок MCE даже присутствует в хлоропластах, которые имеют внутреннюю и внешнюю оболочку (вероятно, из-за их цианобактериального происхождения). В растительных клетках липиды обмениваются между эндоплазматическим ретикулумом (ER) и внешней оболочкой мембраны (17). MCE-содержащий белок TGD2 необходим для последующего импорта липидов, происходящих из ER, с внешней на внутреннюю оболочку мембраны, чтобы они могли метаболизироваться в хлоропласт-специфические липиды.
Предполагаемый ретроградный транспорт PL (от OM к IM) системой Mla был поддержан мутантами mla , проявляющими накопление PL наружных створок, комплементацию этого мутантного фенотипа mla с помощью PldA-фосфолипазы и функции Белки MCE (9). Недавние структурные исследования компонента OM, MlaA, выявили центральную пору, открывающуюся к наружной створке, и структуры, которые препятствуют проникновению PL внутренних створок в пору (11, 13).
Удивительно, но LOS-дефицитный A.Ранее было обнаружено, что baumannii демонстрирует поразительное увеличение транскрипции генов mla (18, 19). Почему клетка должна увеличивать экспрессию системы, которая удаляет липиды из ОМ, если в отсутствие продукции LOS эта органелла сталкивается с дефицитом липидов? Более разумным подходом должно быть увеличение антероградного транспорта PL (от IM к OM) для обеспечения дополнительных PL, необходимых для построения OM. Важно отметить, что массовая транспортировка PL в ОВ еще не учтена.Повышение регуляции mla и генов при отсутствии LOS, по-видимому, указывает на то, что, возможно, по крайней мере в этом организме, Mla может функционировать в антероградном направлении или двунаправленно. Замечательная мутация mlaA , по-видимому, частично подтвердила эту возможность. Мутация mlaA *, по-видимому, активно способствует перемещению PL к наружному листку (20). Однако эта деятельность полностью независима от системы Mla; Удаление любого другого гена mla в мутанте mlaA * не подавляет эту активность (20).Скорее, мутантный белок MlaA * функционирует аберрантно, позволяя проходить PL внутренних листочков к внешнему листку (11, 13, 20).
Обнаружение того, что мутации, инактивирующие как Mla, так и PldA, возникают для увеличения приспособляемости LOS-дефицитного A. baumannii , может указывать только на одно направление транспорта липидов для Mla: он должен работать ретроградным образом. Поскольку LOS-дефицитный OM стал бислоем PL, Mla д. Быть конститутивно активным. Однако его деятельность бесполезна; клетка сталкивается с дефицитом липидов в ОМ.Преимущество пригодности инактивации как Mla, так и PldA позволяет клеткам продолжать накапливать PL в OM в попытке построить OM, который, в конце концов, остается важной органеллой. Выводы Пауэрса и Трента (5) позволяют использовать несколько штаммов и беспристрастный подход: штаммы с дефицитом LOS просто культивируются, и лучшее эволюционное решение побеждает. Итак, поразительно, что одно и то же решение независимо возникло во всех, кроме одного, из эволюционировавших LOS-дефицитных штаммов (задержка несет в себе мутацию в системе передачи сигнала, которая, вероятно, является плейотропной).Эта работа является напоминанием о том, что профили экспрессии генов не обязательно предсказывают ключевые детерминанты приспособленности (21).
Развитый LOS-дефицитный A. baumannii также демонстрирует повышенную устойчивость к большим антибиотикам, что позволяет предположить, что качество барьера ОМ каким-то образом улучшилось. Учитывая быстрое развитие приспособленности, можем ли мы встретить в клинике устойчивый к колистину, дефицитный по LOS A. baumannii ? Возможно нет. Восстановлена ли вирулентность эволюционирующих штаммов, пока неясно.Даже эволюционировавшие штаммы все еще могут быть легко очищены иммунной системой. Однако стоит отметить, что LOS-дефицитная Neisseria meningitidis была выделена из спинномозговой жидкости в клинике (22). По крайней мере, это богатое и защищенное иммунитетом место может поддерживать рост бактерий с резко измененным ОМ. Штаммы с дефицитом LOS, полученные из клинических источников, не следует сразу сбрасывать со счетов. Результаты Пауэрса и Трента (5) поучительны для оценки как транспорта PL в оболочке грамотрицательных клеток, так и адаптации бактерий к лечению антибиотиками.По мере того, как мы узнаем больше об обоих этих процессах, мы будем лучше подготовлены для разработки стратегий, направленных на борьбу с устойчивостью к антибиотикам.
Благодарности
Эта работа была поддержана институциональным финансированием стартапа из Университета Эмори.
Сноски
Автор: K.L.M. и М. написал газету.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
См. Сопутствующую статью на стр. E8518.
Внешняя мембрана – обзор
3.1 OMV: состав, биогенез и функциональные роли
OMV представляют собой устойчивые и дискретные сферические двухслойные липидные наноструктуры диаметром от 10 до 300 нм, полученные из клеточной оболочки и неспособные к реплицируются независимо (Kulp, Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (рис. 4). Отделение OMV было впервые обнаружено более 50 лет назад на микрографических снимках, сделанных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, на которых изображена ультраструктура клеточной стенки бактерий (Bladen and Waters, 1963; Bayer and Anderson, 1965; Chatterjee and Das, 1967).Было установлено, что эти наносферические структуры представляют собой единую мембрану, окружающую электронно-плотный центр (Work et al., 1966). Другие исследования того же периода также сообщили о наличии «внеклеточных глобул» в бесклеточном супернатанте E . coli культивировали в условиях ограничения роста питательных веществ (Bishop and Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Поэтому изначально предполагалось, что образование OMV происходит исключительно в стрессовых условиях.Тем не менее, дальнейшие исследования ясно показали, что OMV также можно обнаружить в нестрессовых условиях, как в лабораторных условиях, так и в условиях окружающей среды (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). В настоящее время известно, что OMV вносят вклад в множество ключевых биологических функций, и одна из первых ролей, когда-либо описанных для OMV, – это их участие в патогенезе, особенно в качестве средств доставки факторов вирулентности (обзор Ellis and Kuehn, 2010). На протяжении многих лет OMV приписывались дополнительные функции, в зависимости от вида и условий культивирования, включая внутри- и межвидовое общение, реакцию на стрессы оболочки, приобретение питательных веществ, горизонтальный перенос генов, действия в качестве агентов-приманок, а также общественные блага ( подробное описание см. в Kulp and Kuehn, 2010 и Schwechheimer and Kuehn, 2015).В целом, OMV, по-видимому, способствуют выживанию бактерий в определенной экологической нише, что подчеркивает их значимость для бактериального гомеостаза.
Рис. 4. Везикулы наружной мембраны грамотрицательных бактерий. (A) Изображение везикулы внешней мембраны (OMV – верхняя панель ), полученная из оболочки бактериальной клетки (нижняя панель) . Показаны детали внешней мембраны (OM) и внутренней мембраны (IM), включая трансмембранные белки. Периплазматическое пространство, в котором находится слой пептидогликана (PG), показывает растворимые периплазматические белки, неправильно свернутые белки и нуклеиновые кислоты.Содержание OMV иллюстрирует часть биомолекул, которые были идентифицированы как на их мембране, так и в просвете. (B и C) Электронные микрофотографии в просвечивающем свете отрицательного окрашенного уранилацетатом Synechocystis sp. Клетка PCC 6803, высвобождающая OMV (B, увеличение 120 000 ×), и бесклеточная концентрированная внеклеточная среда Synechocystis sp. PCC 6803, показывающий несколько OMV (C, увеличение 40000).
(A) Основано на Jan, A.T., 2017. Везикулы наружной мембраны (OMV) грамотрицательных бактерий: перспективное обновление.Передний. Microbiol. 8, 1053.Многочисленные исследования показали, что OMV обогащены компонентами OM, а именно LPS и OMP, а также периплазматическими белками, фрагментами PG и даже цитоплазматическими и нуклеиновыми кислотами (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al. ., 2016). В ранних сообщениях фактически не дифференцировали MV, искусственно сформированные в растворе (из-за естественного липидного поведения, заключающегося в перегруппировке в пузырьки, неизбирательно захватывая материал от бактериального лизиса) от интактных OMV. Совсем недавно улучшенные методологии изоляции и современные омические методы позволили провести тщательный анализ состава OMV.Примечательно, что OMV на самом деле обогащены определенными клеточными компонентами и обеднены другими (Lee et al., 2008), что подтверждает идею о том, что выбор содержимого груза не является случайным процессом. Например, Salmonella sp. Содержание OMV варьировалось в зависимости от тестируемых условий роста: в OMV, выделенных из клеток в условиях обилия питательных веществ, преимущественно выявлялись цитозольные белки, участвующие в трансляции и клеточном метаболизме, в то время как в ограниченных условиях питания OMV были обогащены мембранными белками, участвующими в транспорте питательных веществ (Bai и другие., 2014). Кроме того, подход, основанный на масс-спектрометрии, показал, что в OMV не было обнаружено широко консервативного специфического компонента (Schwechheimer et al., 2013), что еще раз указывает на переменный состав. В целом, ожидается, что дифференциальные составы OMV связаны как с зависимыми от штамма особенностями клеточной оболочки, так и с отдельными экологическими нишами (Yoon, 2016).
Было предложено три не исключающих друг друга механизма образования OMV. В одной модели везикуляция происходит, когда ковалентные поперечные связи между мембранными белками и слоем PG локально разрываются либо за счет временного уменьшения общего количества поперечных связей, либо за счет локального смещения поперечных связей, способствуя выпучиванию небольших ОМ порциями.Другая модель включает периплазматические нанотерритории, в которых накапливаются неправильно свернутые белки и другие компоненты оболочки (фрагменты LPS или PG). После этого аномального, ограниченного скопления клеточных компонентов целостность оболочки локально снижается, вызывая образование пузырьков в частях ОМ, загруженных содержимым просвета. Наконец, также было высказано предположение, что определенные биофизические свойства некоторых липидов OM могут способствовать везикуляции за счет точного определения специфической интеграции LPS или фосфолипидов, что приводит к изменениям текучести и гибкости мембран.Также предполагается, что многие другие факторы влияют на размер, скорость продукции и состав OMV, и, если существует консенсусный процесс биогенеза OMV, он не полностью охарактеризован (Kulp, Kuehn, 2010; Schwechheimer and Kuehn, 2015; Yoon, 2016). ).
В исследованиях цианобактерий область OMV еще совсем недавно, и многое еще предстоит изучить. Это особенно хорошо иллюстрируется тем фактом, что самая ранняя публикация, посвященная исключительно изучению цианобактериальных OMV, датируется 2014 годом (Biller et al., 2014). В этом новаторском исследовании не только показано, что лабораторно контролируемые культуры морской цианобактерии Prochlorococcus постоянно выделяют OMV, но также и то, что эти везикулы можно найти в большом количестве в пробах морской воды. Кроме того, было продемонстрировано, что Prochlorococcus OMV способны поддерживать рост гетеротрофных бактериальных культур, участвуя в этих структурах в морских потоках углерода. Кроме того, наблюдались взаимодействия морских фагов и везикул, показывающие способность OMV действовать как «ловушки».В целом авторы проиллюстрировали некоторые фундаментальные роли OMV и их бесчисленные значения для микробных экосистем (Biller et al., 2014). В более поздней публикации OMV Prochlorococcus сравнивали с таковыми трех других морских гетеротрофов в попытке раскрыть частоту упаковки ДНК в везикулы и различия между различными таксонами (Biller et al., 2017). Путем изучения количества и распределения ДНК, связанной с OMV, было показано, что ДНК по-разному инкапсулирована внутри популяций OMV и между ними.Более того, эта работа предполагает, что механизм упаковки ДНК в OMV не работает одинаково у всех бактерий (Biller et al., 2017). Было показано, что помимо Prochlorococcus и морских Synechococcus , другие цианобактерии образуют и высвобождают OMV, включая одноклеточный Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) и Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), нитевидный Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al., 2017), а также нитевидная, образующая гетероцисты Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) и Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Помимо функций, описанных выше для OMV, происходящих из морских цианобактерий (Biller et al., 2014), для этих внеклеточных везикул были предложены другие функции. Высвобождение OMV цианобактериями может работать как эффективный путь секреции. Метаболически модифицированный Synechococcus sp.Было показано, что штамм PCC 7002, лишенный двух генов гликогенсинтазы, glgA -I и glgA -II, выделяет значительно больше OMV, чем штамм дикого типа (Xu et al., 2013). Авторы предположили, что, поскольку этот мутант экспортирует спонтанно растворимые сахара в среду, наблюдаемые OMV могут быть связаны с этим механизмом секреции, даже несмотря на то, что содержание сахара в наблюдаемых OMV не оценивалось (Xu et al., 2013) . Кроме того, Synechocystis sp.Штамм PCC 6803, лишенный гомолога TolC (необходимого для мембранно-зависимых механизмов секреции; см. Рис. 1 и 3), также продемонстрировал высвобождение значительно большего количества OMV, чем родительский штамм (Oliveira et al., 2016). Поскольку нокаут tolC был сильно нарушен в секреции внутриклеточных белков, метаболитов и экзогенных соединений, было высказано предположение, что гипервезикуляция может удовлетворить потребность в секреции. В согласии с этим, цианобактериальные OMV также были предложены для транспортировки материала, необходимого для развития биопленок.Это было предложено при наблюдении везикул, происходящих от цианобионтов, в спорокарпе водяного папоротника Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Более того, поскольку генетический материал, по сообщениям, наблюдался внутри этих пузырьков, они могли быть векторами для латерального переноса генов между цианобионтом и папоротником (Zheng et al., 2009). Однако цианобактериальные OMV могут также работать как механизм для снятия стресса оболочки: Gonçalves et al. охарактеризован набор из Synechocystis sp. Штаммы PCC 6803, лишенные нескольких компонентов транслоказы IM, участвующих в TolC-зависимых системах секреции (Gonçalves et al., 2018). Интересно, что среди различных штаммов, обладающих разной способностью к высвобождению OMV, нокаут tolC (самый высокий продуцент OMV в исследовании) был единственным, демонстрирующим удивительно высокие уровни транскриптов spy и degQ , кодирующих белки, участвующие в стрессовые реакции оболочки и сверхэкспрессия Spy и DegP (Gonçalves et al., 2018). Таким образом, авторы предположили, что делеция tolC вызывает стресс оболочки, и что гипервезикуляция в нокауте tolC представляет собой независимый механизм для борьбы с такими стрессовыми состояниями (Gonçalves et al., 2018).
Наружная мембрана – обзор
Грамотрицательные бактерии
Несмотря на то, что порины на внешней мембране позволяют молекулам размером менее 500 Да проходить через нее, грамотрицательные бактерии развивают особые пути для получения хелатирующих сидерофоров из окружающей среды [110] . Транспортная система включает рецептор внешней мембраны (OMR), периплазматический связывающий белок (PBP) и транспортер АТФ-связывающей кассеты (ABC) на внутренней мембране для импорта комплексов железо-сидерофор.После того, как железо высвобождается в цитоплазму, сидерофоры либо разлагаются ферментами, либо выводятся через систему оттока (EP), как показано на рис. 13.6 [111].
Рис. 13.6. Парадигма транспорта сидерофоров у грамотрицательных бактерий. (A) holo -siderophore прикрепляется непосредственно к связующему карману, а затем транспортируется в периплазму. (B) Сидерофор апо сначала прикрепляется к карману для связывания, а затем сидерофор holo прикрепляется к карману для связывания.Конформация связывающего кармана изменяется, и затем высвобождается апо -сидерофор и переносится голо -сидерофор в периплазму. CM , цитоплазматическая мембрана; ЭПс , насосы отводящие; ОМ , наружная мембрана; P , периплазма; PBP , периплазматический связывающий белок [111].
Структуру OMR можно разделить на две части: β-бочкообразный домен и N-концевой домен. Β-домен содержит позицию связывания сидерофоров.Он состоит из 10 периплазматических петель, 22 бочек β-цепей и 11 внеклеточных петель. Хелатирующие железо сидерофоры могут либо напрямую связываться с рецептором, как показано на фиг. 13.6A, либо заменять сидерофор апо , который уже прикреплен к рецептору, как показано на фиг. 13.6B. После успешного связывания конформация OMR изменяется и впоследствии закрывает карман связывания OMR [111]. Роль N-концевого домена – блокатор, предотвращающий попадание экзогенных элементов в периплазму [112].Он содержит 4-нитевой β-лист, окруженный петлями и спиралями. Верх N-концевого домена взаимодействует с комплексами железо-сидерофор. Однако этот домен не так важен, как домен β-бочонка для узнавания сидерофоров [113]. Другой важной структурой в N-концевом домене является TonB box, короткая аминокислотная последовательность, которая взаимодействует с TonB, что позволяет комплексам железо-сидерофор получать доступ к периплазме. TonB находится на CM. Хотя функция TonB все еще неясна, на сегодняшний день были предложены четыре гипотезы: модели челнока, тяги, вспомогательного механизма и пропеллера [111].Для поглощения комплекса железо-пиохелин P. aeruginosa обладает FptA, OMR на внешней мембране. Этот рецептор эффективно ассимилирует комплекс железо-пиохелин. Примечательно, что FptA способен связывать ряд комплексов металл-пиохелин, но могут переноситься только комплексы Fe 3 + -, Co 2 + -, Ga 3 + – и Ni 2 + –пиохелин. в цитоплазму. Кроме того, FptA транспортирует Fe 3 + -пиохелин с более высокой эффективностью, что демонстрирует высокую селективность FptA [114].Хотя энантиопиохелин ( 4 ) проявляет ту же биологическую функцию, что и пиохелин ( 3 ), по стимулированию роста P. protegens во время железного голодания, пиохелин ( 3 ) и энантиопиохелин ( 4 ) не могут могут быть использованы в гетерологичных видах. Это связано с тем, что переносчики внешней мембраны FptA в P. aeruginosa и FetA в P. protegens высокоспецифичны для пиохелина ( 3 ) и энантиопиохелина ( 4 ) соответственно.Анализ рентгеновских структур и анализы связывания позволяют предположить, что стереоспецифичность распознавания пиохелина и энантиопиохелина переносчиками внешней мембраны сильно зависит от конфигурации хиральных центров C4 ″ и C2 ″, а не C4 ‘, как показано на рис. 13.7 [ 23,115–118]. Нагруженный железом пиохелин ( 3 ) и энантиопиохелин ( 4 ) стереоспецифично распознаются регуляторами AraC-типа PchR в цитоплазме, которые проявляют различную энантиоселективность в P.aeruginosa и P. protegens [119–121].
Рис. 13.7. Абсолютные конфигурации изомеров пиохелина ( 3 ) и энантиопиохелина ( 4 ). В присутствии иона металла пиохелин II ( 3b ) и энантиопиохелин II ( 4b ) изомеризуются в пиохелин I ( 3a ) и энантиопиохелин I ( 4a ) соответственно. Этот результат предполагает, что существует управляемый металлами эффект, дающий соотношение цис H-2 ″ –H-4 ″ для оптимальной тетракоординированности ионов трехвалентного железа.Структура пиохелина II ( 3b ) и энантиопиохелина II ( 4b ) несовместима с хелатированием металлов из-за связи транс H-2 ″ –H-4 ″ вдали от координационной сферы железа [23,115,116 ].
Сидерофор PBP необходим для доставки импортированного комплекса железо-сидерофор от OMR к транспортеру ABC. Комплекс железо-сидерофор-PBP образуется и затем транспортируется к транспортеру ABC, чтобы транспортировать железо-сидерофор. Специфические PBP привлекаются для переноса химически различных сидерофоров [112].Несмотря на то, что PBP играет критическую роль в системе транспорта железо-сидерофор, не так много исследований обсуждали механизм и структуру этих белков для различных сидерофоров у разных бактерий [111].
ABC-транспортеры обычно состоят из двух трансмембранных доменов и двух нуклеотид-связывающих доменов. Два трансмембранных домена образуют канал для комплексов железо-сидерофор, чтобы достичь цитоплазмы. Цитоплазматические субъединицы ABC предоставляют энергию транспортерам ABC для переноса субстратов через канал в цитоплазму.К настоящему времени было признано, что пять подтипов переносчиков ABC обладают способностью доставлять железо-сидерофоры. Среди этих пяти подтипов транспортер ABC подтипа YbtPQ был способен доставлять комплекс железо-иерсиниабактин [122]. Напротив, P. aeruginosa оснащает FptX на внутренней мембране для доставки комплекса железо-пиохелин из периплазмы в цитоплазму [123].
Существует два механизма высвобождения железа из комплекса железо-сидерофор: гидролиз железо-сидерофор и восстановление железо-сидерофор.Сидерофоры апо либо разлагаются, либо выводятся из организма. Бактерии используют ЭП для экструзии сидерофоров. Сообщалось, что два EP отталкивают сидерофоры. Один был обнаружен у P. aeruginosa для выделения пиовердина под названием PvdRT-OpmQ EP. Другой составлен белком внутренней мембраны EntS и белком внешней мембраны TolC и обнаружен в Escherichia coli для экспорта энтеробактина [111]. Знания о механизмах поглощения и оттока сидерофоров скудны; в частности, для сидерофоров с салициловыми кэпами не сообщалось о механизмах захвата и оттока или совсем о них.Следовательно, для лучшего применения сидерофоров необходимы дополнительные исследования для выявления этих механизмов.
Границы | Роль белков внешней мембраны и липополисахаридов в чувствительности Escherichia coli к антимикробным пептидам
Введение
Быстрое развитие устойчивости бактерий к классическим антибиотикам происходит во всем мире. Число инфекций, вызываемых бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, увеличивается, и бактериальные инфекции снова становятся угрозой.Подсчитано, что бактериальные инфекции, вызванные бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, приводят к 25000 смертей ежегодно в Европе. В США более 2 миллионов человек заражаются устойчивыми к антибиотикам бактериями в год, и 23 000 человек умирают как прямая причина (Davies et al., 2013; World Health Organization, 2014). В частности, особую озабоченность вызывают инфекции, вызванные грамотрицательными бактериями, устойчивыми почти ко всем доступным в настоящее время лекарствам. Грамотрицательные бактерии с множественной лекарственной устойчивостью представляют большую угрозу для здоровья из-за ограниченных возможностей лечения.Канал разработки новых эффективных противомикробных препаратов, специально нацеленных на грамотрицательные бактерии, остается пустым, несмотря на рост числа бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (Hampton, 2013). В частности, множественная лекарственная устойчивость Enterobacteriaceae, такая как β-лактамаза расширенного спектра (БЛРС) и продуцирующая карбапенемаза Escherichia coli , вызывают серьезную озабоченность, поскольку обладают устойчивостью к доступным в настоящее время антибиотикам (Kanj and Kanafani, 2011; Antibiotics Current in Clinical Development, 2014).
В отличие от грамположительных бактерий, все грамотрицательные бактерии окружены дополнительной мембраной, так называемой внешней мембраной (ОМ) (рис. 1). В отличие от цитоплазматической мембраны, OM сильно асимметричен, с внутренним листком, содержащим фосфолипиды, и внешним листком, в основном состоящим из липополисахаридов (LPS). ЛПС грамотрицательных бактерий, включая E. coli , состоит из трех частей (Рисунок 1): (i) липид A, гидрофобный мембранный якорь, образующий внешний листок OM, (ii) фосфорилированное неповторяющееся ядро олигосахарид (core-OS) и, следовательно, имеет высокоанионную природу, и (iii) O-антиген (O-полисахарид), состоящий из цепочки нескольких типов повторяющихся сахарных единиц, действующих как поверхность гидрофильного покрытия (Erridge et al., 2002; Raetz and Whitfield, 2002). Липид А является высококонсервативным среди грамотрицательных бактерий, в отличие от О-антигена, который очень гибок. Ядро-OS E.coli разделено на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D- , манно -октулозовой кислоты (Kdo) и одного или нескольких L- глицеро -D- . manno – остатки гептозы и внешняя область, состоящая из различных связанных сахарных остатков. Основные особенности внутренней области core-OS сохраняются у представителей Enterobacteriaceae , что предположительно отражает его критическую роль в стабильности OM (Caroff and Karibian, 2003).В E. coli внутренняя коровая область core-OS может быть дополнительно модифицирована переменными нестехиометрическими заменами в зависимости от типа core-OS (Heinrichs et al., 1998b). Внешняя область core-OS демонстрирует большую вариабельность, что определяет пять различных типов ядра в E. coli (K12, R1, R2, R3 и R4) (рис. 2). Все типы ядер имеют общую структурную тему с (гексозой) 3 углеводной основной цепью и двумя остатками боковой цепи. Однако порядок остатков гексозы, а также положение, природа и связь боковой цепи варьируются от каждого типа ядра (рис. 2).Большинство клинических изолятов E. coli имеют гладкий LPS (S-LPS), который состоит из всех трех частей, включая О-антиген, тогда как E. coli с грубым LPS (R-LPS) не содержит О-антигена и может даже иметь усеченное ядро ОС (глубокая грубость). Минимальный необходимый для роста ЛПС состоит из липида A и Kdo (3-дезокси-D-, манно -окт-2-улозоновая кислота) (Frirdich and Whitfield, 2005).
Рисунок 1 . Общая структура клеточной оболочки Escherichia coli K-12.Схематическое изображение клеточной оболочки E. coli K-12.
Рисунок 2 . Структура ядра ОС Escherichia coli . (A) Структура внутренней области core-OS типов ядра E. coli . Пунктирными линиями обозначены нестехиометрические замены, и указаны отличительные модификации различных типов ядер. (B) Структура внешней области сердечника-ОС типов сердечника R1, R2, R3, R4 и K-12.Glc, глюкоза; GlcN, глюкозамин; Hep, L- , глицеро -D- , манно , гептопираноза; Kdo, 3-дезокси-D- манно- окт-2-улозоновая кислота; Ра, раммонс; Гал, галактоза; GlcNAc, N- ацетилглюкозамин; ПЭТН, фосфорилэтаноламин.
ОМ необходим для жизнеспособности клеток и служит барьером проницаемости, предотвращающим проникновение вредных токсичных соединений (Savage, 2001; Raetz and Whitfield, 2002; Nikaido, 2003). Общий состав и структура ОВ широко сохранены, с небольшими вариациями у разных видов (Vaara, 1992).LPS, являясь основным компонентом внешней створки OM, играет центральную роль в целостности и избирательной проницаемости OM. Заряженные макромолекулы не могут проникнуть в ОВ, в то время как многим гидрофобным молекулам разрешена ограниченная диффузия (Nikaido, 2003). LPS, в частности core-OS, играет важную роль в обеспечении селективности по отношению к гидрофобным молекулам. Благодаря анионным фосфатным группам во внутренней области ядра OS, молекулы LPS способны образовывать межмолекулярные электростатические связи с соседними молекулами LPS через двухвалентные катионы, в основном Mg 2+ и Ca 2+ (Vaara, 1992). .Это перекрестное связывание соседних молекул ЛПС в значительной степени способствует устойчивости к гидрофобным антимикробным агентам. Анионная природа липида A и внутренней области core-OS, по-видимому, является ахиллесовой пятой для целостности OM (Schneck et al., 2010).
Однако ОМ E. coli состоит не только из ЛПС, но и из других компонентов, таких как белки внешней мембраны и липопротеины (рис. 1). Lpp или муреин-липопротеин – самый распространенный липопротеин E.coli , и, по оценкам, это самый распространенный белок, содержащий более 500 000 молекул на клетку (Vaara, 1992; Neidhardt and Umbarger, 1996). Lpp состоит из 58 амино и существует в двух формах: (i) «связанная форма», в которой Lpp ковалентно связан со слоем пептидогликана через ε-аминогруппу С-концевого лизина (Nikaido, 1996) и (ii ) «свободная форма» (Браун и Рен, 1969; Браун и Вольф, 1970; Браун и Бош, 1972). Функция «свободный от» не изучена, однако было показано, что «свободный от» обнажается на поверхности своим С-концом (Cowles et al., 2011). «Связанная форма» Lpp является важным структурным компонентом в поддержании стабильности и целостности ОМ. Клетки, лишенные Lpp, обнаруживают несколько дефектов ОМ, таких как повышенная проницаемость ОМ для малых, токсичных молекул и антибиотиков и утечка периплазматического содержимого (Hirota et al., 1977; Suzuki et al., 1978).
Противомикробные пептиды (АМП) вновь привлекают внимание как потенциальная альтернатива классическим антибиотикам, борющимся с бактериальными инфекциями, включая инфекции, вызываемые грамотрицательными патогенами.Катионные противомикробные пептиды представляют собой самый большой класс AMP и присутствуют практически во всех группах организмов, таких как бактерии, грибы, растения и животные. Катионные АМП характеризуются положительным зарядом и гидрофобной областью, но их размеры, последовательности и вторичные структуры широко варьируются. Широко распространено мнение, что положительный заряд катионных АМП обеспечивает электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными микробными мембранами (Yeaman and Yount, 2003; Jenssen et al., 2006) и что гидрофобная область участвует в проникновении клеток (Aoki и Уэда, 2013).
Целью нашей работы является исследование антимикробной активности выбранных катионных AMP против грамотрицательных бактерий, в частности, E. coli . В частности, мы изучили потенциальную роль внешней мембраны, которая выполняет решающую роль в обеспечении дополнительного слоя защиты, действующего как селективный барьер. Более конкретно, мы проанализировали потенциальную роль определенных компонентов ОМ, таких как LPS, Lpp и OmpT, протеаза внешней мембраны, в антимикробной активности катионных AMP.Мы измерили минимальную ингибирующую концентрацию катионных AMP Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттина, индолицидина, цекропина P1 и цекропина B против E. coli BW25113 (K12) и изогенных мутантов, дефектных по LPS. компоненты, Lpp или OmpT. Кроме того, мы проанализировали чувствительность E. coli F470, E. coli F632, E. coli F653 и E. coli F2513, представляющих прототипы R1, R2, R3 или R4, против выбранные катионные AMP.Наконец, мы исследовали механизм действия Cap18 путем анализа антимикробной активности выбранных производных Cap18 против E. coli дикого типа ATCC25922, а также мутантов LPS.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и условия роста
Все штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице 1. Штаммы E. coli 470, F632, F653 и F2513 были любезно предоставлены профессором Х. Брэйдом и профессором С. Мюллер-Леннис, Исследовательский центр Борстел, Лейпниц. -Центр медицины и биологических наук, Германия. E. coli BW25113 (CGSC #: 7636), производное F – , λ – E. coli Штамм K12 BD792 – штамм дикого типа, который использовался при создании коллекции KEIO и заказано в Центре генетических запасов кишечной палочки (CGSC, Йельский университет). E. coli JW3596, E. coli JW3024, E. coli JW3595, E. coli JW3606, E. coli JW0212, E. coli JW1667, E. coli JW1667, E. coli JW Э.coli JW3605 и E. coli JW3600 являются изогенными мутантами waaC, waaE, waaF, waaG, gmhA (lpcA), lpp, ompT, waaP или waaY , полученными из родительского штамма 2 E. coli 2 E. coli и были заказаны из коллекции KEIO (Баба и др., 2006). E. coli ATCC25922 – клинический изолят серотипа O6, часто используемый в качестве контрольного штамма в тестах на чувствительность к противомикробным препаратам, которые были заказаны из коллекции штаммов ATCC. Все штаммы выращивали на среде Мюллера-Хинтона-II, инкубацию проводили в аэробных условиях при 37 ° C в течение 18–20 часов.
Таблица 1 . Бактериальные штаммы, использованные в этом исследовании.
Противомикробные пептиды
Аминокислотная последовательность, происхождение и структура цекропина P1, цекропина B, Cap18, Cap11, Cap11-1-12m 2 , мелиттина и индолицидина приведены в таблице 2. Цекропин B, цекропин P1 и сульфат колистина (C4461) были приобретены у Sigma-Aldrich. Цекропин B с чистотой ≥97% и цекропин P1 с чистотой ≥95% растворяли в воде. Сульфат колистина растворяли в воде.Cap11 (чистота 94,7%), Cap11-1-18m 2 (чистота 87,9%) и Cap18 (чистота 89,5%) были синтезированы в Genscript. Cap18 и Cap11 растворяли в ДМСО, Cap11-1-18m 2 растворяли в воде. Мелиттин (RP10290) и индолицидин (RP11242-0,5), каждый с чистотой> 95%, были приобретены у Genscript и растворены в воде. Производные Cap18, использованные в этом исследовании, были приобретены в виде химически синтезированных пептидов высокой чистоты у Genscript или Peptide 2.0. Аминокислотная последовательность и чистота каждого производного Cap18 сведены в Таблицу 6.Все пептиды растворяли до исходной концентрации 10 мг / мл, за исключением сульфата колистина, который растворяли до исходной концентрации 50 мг / мл и хранили при -20 ° C.
Таблица 2 . Катионные противомикробные пептиды, использованные в этом исследовании: последовательность, происхождение и структура.
Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам (определение MIC)
Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) AMP измеряли в 96-луночных микротитровальных планшетах в соответствии с Институтом клинических и лабораторных стандартов [CLSI, ранее Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS)] (Wikler et al., 2009). Жидкую среду Мюллера-Хинтона-II, содержащую возрастающие концентрации AMP, инокулируют определенным количеством клеток (~ 10 5 КОЕ / мл) в 96-луночных микротитровальных планшетах (полипропилен). Каждый микротитровальный планшет включает положительный контроль роста и отрицательный контроль (стерильный контроль). После инкубации определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) по самой низкой концентрации, при которой не наблюдается видимого роста. Все чашки инкубировали 16–20 ч.
Результаты
OmpT не влияет или оказывает незначительное влияние на антимикробную активность катионных AMP в Escherichia coli
K12 BW25113OmpT, член аспартилпротеаз, обнаружен во внешнем члене E.coli и отвечает за расщепление пептидов и белков между двумя последовательными основными аминокислотными остатками (Sugimura and Nishihara, 1988; Kramer et al., 2000, 2001). Ранее было показано, что мутант E. coli Δ ompT является сверхчувствительным к протамину AMP (Stumpe et al., 1998), и что OmpT энтерогеморрагической E. coli (EHEC) расщепляет LL-37, человеческий гомолог Cap18 (Thomassin et al., 2012). Чтобы оценить роль OmpT в K12 E.coli BW25133, мы исследовали антимикробную активность семи катионных AMP из разных классов и происхождения, а также антибиотика колистина против мутанта ompT , который был выбран из коллекции KEIO (Baba et al., 2006). Антимикробная активность была измерена как минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и суммирована в таблице 3. На активность кателицидина Cap18, гомолога LL-37, не влияет мутант ompT по сравнению с родительским штаммом BW25113 (таблица 3). .Cap11, другой член семейства кателицидинов, немного более активен, вплоть до фактора 2, в мутантном штамме ompT по сравнению со штаммом дикого типа. Однако MIC Cap11-1-18m 2 , более короткое производное Cap11, не изменяется на фоне ompT . Подобно Cap11, антимикробная активность цекропина B и цекропина P1 увеличивается до фактора 2. Напротив, антимикробная активность индолицидина не затрагивается, а мелиттин немного менее эффективен (до фактора 2) у мутанта ompT . фон.Антимикробная активность полипептидного антибиотика колистина не изменилась у мутанта ompT . Растворитель ДМСО не обладал антимикробной активностью в концентрациях, используемых в анализах MIC (данные не показаны). Основываясь на этих результатах, мы можем предположить, что протеаза внешней мембраны OmpT не оказывает или оказывает незначительное влияние на антимикробную активность катионных AMP.
Таблица 3 . Чувствительность мутантов E. coli BW25113, дефицитных по внешней мембране, к катионным антимикробным пептидам.
Тестирование чувствительности
E. coli BW25113 lpp :: kan к катионным антимикробным пептидамХотя известно, что делеция гена lpp приводит к повышенной лекарственной чувствительности, антимикробная активность катионных AMP не анализировалась более подробно с использованием изогенных штаммов. Чтобы исследовать потенциальную роль Lpp в антимикробной активности катионных AMP, мутант BW25133 lpp :: kan был выбран из коллекции KEIO и протестирован на чувствительность к антимикробным препаратам.Из-за ограниченного количества доступного пептида только Cap18, Cap11, Cap11-1-12m 2 , цекропин B и колистин были протестированы на антимикробную активность у мутанта lpp (таблица 3). Значения MIC для цекропина B, Cap11 и Cap11-1-12m 2 не изменились в мутантном штамме lpp по сравнению с штаммом дикого типа. Только для Cap18 и колистина можно было обнаружить минимальное увеличение фактора 2 чувствительности к противомикробным препаратам. Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что Lpp не играет центральной роли в антимикробной активности большинства протестированных катионных AMP.Только для Cap18 и колистина Lpp играет второстепенную роль в антимикробной активности.
Повышение антимикробной чувствительности к катионным антимикробным пептидам при дефиците ЛПС
E. coli МутантыЧтобы понять влияние LPS, в частности core-OS, на антимикробную активность катионных AMP, несколько мутантов LPS были отобраны из коллекции KEIO и проанализированы на чувствительность к антимикробным препаратам. Были выбраны три различных набора мутантов LPS, один набор мутантов, несущих делеции генов, участвующих в сборке молекулы LPS, включая гликозил- и гептозилтрансферазы ( waaC, waaF и waaG ), один набор содержит ферменты, модифицирующие LPS, такие как как киназы LPS waaP и waaY , и третий набор, состоящий из мутантов, дефицитных по синтезу ADP-гептозы ( gmhA и waaE) , который является предшественником молекулы LPS гептозы.МИК Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттина, индолицидина, церопина P1, цекропина B и колистина измеряли для штаммов E. coli BW25113, несущих мутацию в waaG, waaC, waaE, waaF или gmhA , все гены, необходимые для ядра ОС ЛПС, и штамм дикого типа BW25113. Значения MIC приведены в таблице 3. За исключением Cap11, все испытанные катионные AMP показали более высокую антимикробную активность против мутантов waaC, waaF, waaG, waaE и gmhA по сравнению с родительским штаммом BW25113.Наибольшее увеличение (от 8 до 16 раз) антимикробной активности было зарегистрировано для мелиттина против BW25113 gmhA :: kan . Кроме того, восприимчивость BW25113 waaC :: kan , BW25113 waaF :: kan , BW25113 waaG :: kan и BW25113 waaE :: kan была увеличена в 4-8 раз по сравнению с диким -тип штамма. Цекропин P1 и цекропин B более активны в фонах мутантов LPS; В 4–8 раз активнее на фоне waaF :: kan , в 4 раза активнее на фоне gmhA :: kan , в 2–4 раза активнее на фоне waaC :: kan и waaE :: kan и до В 2 раза более активен на фоне waaG :: kan по сравнению с родительским штаммом BW25113.Индолицидин в два раза активнее, а Cap11-1-18m 2 показывает небольшое, до 2-кратного увеличения антимикробной активности у всех протестированных мутантов LPS по сравнению со штаммом дикого типа. Точно так же делеции waaC, waaE, waaF и waaG показывают немного повышенную чувствительность (до 2 раз) к Cap18. Для сравнения, полипептидный антибиотик колизитин проявлял немного повышенную антимикробную активность (до фактора 2) против мутантов waaC, waaF, waaG, waaE и gmhA .Помимо ферментов, непосредственно участвующих в синтезе основного олигосахарида, мы проанализировали влияние ферментов, модифицирующих ЛПС, таких как киназа ЛПС waaP и waaY , ответственных за фосфорилирование гептозы I и гептозы II. WaaP фосфорилирует остаток гептозы I, тогда как waaY отвечает за фосфорилирование остатка гептозы II. Однако у мутанта waaP оба сахарных остатка, гептоза I и гептоза II, остаются нефосфорилированными (Yethon et al., 1998). Чувствительность к противомикробным препаратам мутанта waaP не изменяется для Cap18, Cap11, цекропина B, цекропина P1, индолицидина и колистина. Только мелиттин в 4-8 раз более активен на фоне мутанта waaP по сравнению со штаммом дикого типа. Инактивация waaY не влияла на активность Cap18, Cap11, цекропина P1, мелиттина и индолицидина, тогда как цекропин B был немного менее активен (до фактора 2). Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что LPS, в частности сахарная структура core-OS, играет важную роль в антимикробной активности катионных AMP.Однако усиление антимикробной активности тестируемых AMP против отдельных мутантов LPS сильно зависит от природы самого AMP. Антимикробная активность Cap18, Cap11 и Cap11-1-18m 2 , всех членов семейства кателицидинов, не затрагивается или затрагивается лишь незначительно во всех протестированных мутантах LPS по сравнению с мутантами дикого типа, тогда как мелиттин в 4 раза активнее в любой из протестированных мутантов LPS с усечением сахарного остова. Напротив, эффект фосфорилирования сахарного остатка гептозы I и гептозы II незначителен.Антимикробная активность большинства протестированных AMP, а также полипептидного антибиотика колистина не изменилась в waaP и waaY . Только мелиттин в 4 раза активнее в мутанте waaP , но не в мутанте waaY .
Основной тип
Escherichia coli определяет антимикробную активность катионных AMPЧтобы исследовать роль LPS более подробно, мы проанализировали потенциальную роль различных сахарных фрагментов во внешней части core-OS в E.coli . Таким образом, мы определили антимикробную активность выбранных катионных AMP против пяти штаммов E. coli , представляющих пять различных типов ядра (R1, R2, R3, R4 и K12). Отобранные AMP были протестированы на антимикробную активность против E. coli ATCC25922, E. coli BW25113 (K12), E. coli F470 (прототип R1, грубый LPS), E. coli F632 (прототип R2 , грубый LPS), E. coli, F653 (прототип R3, грубый LPS) и E.coli F2513 (прототип R4, грубый LPS). Антимикробная активность была измерена как минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и суммирована в таблице 4. Антимикробная активность Cap18 очень похожа на все протестированные штаммы E. coli со значениями МИК 4-8 мкг / мл. Только E. coli F2513 немного более восприимчивы к Cap18 со значением MIC 2–4 мкг / мл. Антимикробная активность Cap11, другого члена семейства кателицидинов, варьируется в 2–4 раза в зависимости от типа ядра.Cap11 проявляет наивысшую антимикробную активность против E. coli F2513, прототипа R4. Точно так же Cap11-18m 2 , короткое производное Cap11, наиболее эффективно против E. coli F2513. В отличие от AMP из семейства кателицидинов, мелиттин демонстрирует самые большие различия в антимикробной активности в зависимости от типа ядра. Антимикробная активность мелиттина, например, в 4-8 раз выше против E. coli F2513 (тип ядра R4), чем против BW25113 (K12). Значение МИК индолицидина против E.coli F2513 в 4–2 раза ниже значений МИК, измеренных для других штаммов. Значения MIC, измеренные для цекропина P1, очень похожи для всех измеренных штаммов, что указывает на то, что активность цекропина P1 не зависит от типа ядра. Аналогично для цекропина B было измерено небольшое изменение значений MIC (≤2-кратное) в зависимости от типа ядра. Таким образом, антимикробная эффективность тестируемых катионных AMP варьируется в зависимости от типа ядра E. coli . Все протестированные катионные пептиды наиболее активны в отношении E.coli F2513, который представляет тип ядра R4. Это открытие указывает на то, что сахарные фрагменты области внешнего ядра core-OS могут играть важную роль в антимикробной активности катионных AMP. Однако отдельные AMP различаются по степени селективности LPS. Мелиттин показал наибольшую разницу в значениях MIC в диапазоне от 4 до 32 мкг / мл в зависимости от изолята и типа ядра. Напротив, значения MIC для Cap18 показывают лишь минимальные вариации (до фактора 2) в зависимости от штамма.Это говорит о том, что Cap18 нацелен на E. coli эффективным способом независимо от типа ядра.
Таблица 4 . Антимикробная активность выбранных антимикробных пептидов в Escherichia coli с различными типами ядра LPS.
Антимикробная активность образца
E. coli ATCC25922 аналогична Core типа R1Одним из наиболее часто используемых штаммов E. coli в тестах на чувствительность к противомикробным препаратам является E.coli ATCC25922. E. coli ATCC25922 представляет собой клинический изолят с гладким LPS (серотип 6), служит эталонным штаммом при тестировании чувствительности к противомикробным препаратам и использовался в предыдущем исследовании, посвященном антимикробной активности Cap18. Тип ядра ATCC25922 до сих пор не идентифицирован. Мы измерили антимикробную активность выбранных катионных AMP против E. coli, ATCC25922 и сравнили значение MIC с BW25311, F470, F632, F653 и F2513, все они содержат грубый LPS и представляют различные основные типы (таблица 4).Антимикробная чувствительность ATCC25922 ко всем протестированным AMP очень похожа на F470. Это указывает на то, что ATCC25922 может быть членом типа ядра R1.
Восстановление антимикробной активности производных CAP18 путем изменения структуры внутренней области ядра LPS
В предыдущем исследовании мы проанализировали антимикробную активность Cap18 и смогли создать производные Cap18 с улучшенным видо-селективным уничтожением (Ebbensgaard et al., 2018).Наряду с нашими текущими результатами, демонстрирующими, что антимикробная активность Cap18 не является или только незначительно зависит от присутствия внутренней центральной области или сахарного состава внешней области core-OS, мы решили исследовать механизм Cap18 и подробнее о роли LPS. Для этого анализа мы выбрали набор производных Cap18 с видоспецифичными убивающими свойствами. Основываясь на нашем предыдущем исследовании, мы выбрали 12 производных Cap18, которые утратили свою антимикробную активность против E.coli ATCC25922 (МИК ≥ 64 мкг / мл). Каждое из этих 12 производных содержит одну единственную аминокислотную замену по сравнению с исходным пептидом Cap18. Кроме того, мы отобрали 8 производных, проявляющих такую же антимикробную активность, что и исходный пептид Cap18 (MIC = 4–8 мкг / мл), и были включены в исследование в качестве контрольных пептидов. Аминокислотные последовательности и чистота выбранных производных Cap18 приведены в таблице 5. Для всех 20 производных Cap18 антимикробную активность исследовали, измеряя значение MIC против E.coli ATCC29522 Δ waaC, E. coli ATCC29522 Δ waaE, E. coli ATCC29522 Δ waaF, E. coli ATCC29522Δ waaG и родительский штамм ATCC29522 (таблица 6).
Таблица 5 . Производные Cap18: аминокислотная последовательность, чистота, растворитель, производитель.
Таблица 6 . Антимикробная активность производных Cap18 в отношении мутантов ЛПС E. coli, ATCC25922 и других энтеробактерий.
Антимикробная активность может быть полностью восстановлена для четырех производных путем удаления любого из wwaC, waaE, waaF или waaG в фоне ATCC29522.Более подробно, Cap18, несущий замену L17K, I20E, I24G или L27P, не проявляет антимикробной активности против E. coli ATCC29522, но восстанавливает полную антимикробную активность (значение MIC: 4-8 мкг / мл) у мутантов LPS, несущих делецию. либо в wwaC, waaE, waaF , либо в waaG . Производное Cap18 с заменой I24N восстановило полную антимикробную активность на фоне мутанта waaC и waaF по сравнению с ATCC29522 дикого типа. Однако делеция waaE и waaG привела только к частичному восстановлению антимикробной активности I24N.Точно так же замена I20N может успешно восстановить антимикробную активность Cap18 на фоне мутанта waaF и частично восстановить активность в Δ waaC , Δ waaE и Δ waaF . Cap18 I13R не был активен ни в диком типе, ни в мутанте waaE (MIC ≥ 64 мкг / мл), однако полностью активен в мутанте waaG и частично активен в waaF и waaC мутанты. Противомикробная активность производных Cap18, содержащих замену I13P или I24D, оба неактивные в ATCC29522, могла быть восстановлена только частично путем удаления либо wwaC, waaE, waaF , либо waaG .Интересно, что Cap18 I13D, L17D и L17P были неактивны против всех тестируемых штаммов, включая мутанты LPS. Производные Cap18, проявляющие антимикробную активность, сравнимую с исходным пептидом Cap18 (MIC = 4-8 мкг / мл), показали либо неизменную, либо слегка улучшенную (фактор 2) антимикробную активность у мутантов LPS по сравнению с исходным пептидом Cap18 (таблица 6). Подводя итог, мы смогли продемонстрировать, что изменение структуры LPS E. coli ATCC25922, в частности внутренней области core-OS, может привести к восстановлению антимикробной активности отдельных производных Cap18, которые не были активны в родительском ATCC25922. напряжение.
Обсуждение
Бактериальные патогены выработали различные механизмы противодействия антимикробной активности катионных AMP (Peschel and Sahl, 2006). Производство протеаз, разлагающих и тем самым инактивирующих катионные AMP, является одним из очевидных способов защиты бактерий от антимикробных препаратов. Некоторые омптины, такие как OmpT и PgtE, все протеазы, обнаруженные в ОМ различных грамотрицательных патогенов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae , были связаны с деградацией AMP (Hritonenko and Stathopoulos, 2007).В частности, OmpT участвует в протеолитической деградации протамина и LL-37, человеческого гомолога Cap18. При измерении значений MIC для Cap18, мелиттина и индолицидина не было обнаружено никаких изменений на фоне мутанта ompT по сравнению с исходным E. coli BW25113. Аналогичным образом, только незначительное увеличение антимикробной активности Cap11, Cap11-1-18m 2 , цекропина P1 и цекропина B было обнаружено в мутантном штамме ompT по сравнению с штаммом дикого типа.Наши данные ясно показывают, что OmpT играет лишь второстепенную роль в защите E. coli K-12 от катионных AMP. Это согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что MIC LL-37, человеческого гомолога Cap18, не изменилась в CFT073Δ ompT по сравнению с CFT073 дикого типа, уропатогенным штаммом E. coli (Brannon et al. , 2013). Аналогичные результаты наблюдались для EPEC E2348 / 69, энтеропатогенной E. coli . Значение MIC LL-37 не изменилось в мутанте Δ ompT по сравнению с родительским штаммом.Для C18G, другого AMP, небольшое снижение MIC (фактор 2) наблюдалось у мутанта Δ ompT (Thomassin et al., 2012). Несмотря на отсутствие или незначительное влияние OmpT на восприимчивость, было продемонстрировано, что OmpT из E. coli CFT073 и E. coli EPEC E2348 / 69 опосредуют деградацию LL-37 (Thomassin et al. , 2012; Браннон и др., 2013). Влияние OmpT на восприимчивость было более выражено у энтерогеморрагической E. coli EHEC EDL933.Значения MIC для LL-37 были уменьшены в 2 раза, а для C18G – в 8 раз. В целом это указывает на то, что вклад OmpT в деградацию и инактивацию AMP в целом незначителен, однако также зависит от самого AMP и природа штамма E. coli .
Природа клеточной поверхности, в частности состав ОМ грамотрицательных бактерий, оказывает большое влияние на антимикробную активность и эффективность антимикробных агентов, включая катионные AMP.Поэтому мы исследовали роль Lpp, который является наиболее распространенным белком в E. coli , присутствующим либо в виде Lpp, экспонированного на свободной поверхности, либо в связанной форме, соединяющей пептидогликан с OM. Недавно было продемонстрировано, что Lpp специфически связывается с α-спиральными AMP, такими как Cap18, LL-37 и SMAP-29, но не с полимиксином B. Была предложена модель, в которой Lpp действует как рецептор для Cap18, LL- 37 и SMAP-29, непосредственно влияющие на чувствительность α-спиральных катионных АМП (Chang et al., 2012). Однако наши данные демонстрируют, что удаление гена lpp приводит к немного повышенной чувствительности, что указывает на то, что Cap18 эффективно убивает E. coli BW25113 даже в отсутствие Lpp. Основываясь на наших выводах, мы делаем вывод, что присутствие Lpp не требуется для антимикробной активности тестируемых катионных AMP, таких как Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 и церкопин B против E. coli BW25133. Истощение клетки для обеих форм Lpp, «свободной от», которая подвергается воздействию поверхности, а также «связанной формы» с четко определенной периплазматической функцией путем удаления гена lpp может привести к измененному ОМ.Было показано, что мутанты, дефицитные по общему Lpp, продуцируют везикулы OM и выделяют периплазматические белки (Hirota et al., 1977). Совсем недавно структура чувствительности к различным антибиотикам была исследована на L51, производном E. coli K-12 и в изогенном мутанте Δ lpp . Подобно нашим результатам для катионных AMP, чувствительность к ванкомицину, эритромицину и рифампицину была немного увеличена в мутанте Δ lpp по сравнению с родительским штаммом (Kowata et al., 2016). Несмотря на то, что было продемонстрировано, что Lpp способен связывать α-спиральные катионные AMP, Lpp, по-видимому, играет лишь маргинальную роль в антимикробной чувствительности E. coli к катионным AMP, которые мы тестировали в нашем исследовании.
Хорошо известно, что ЛПС играет центральную роль в проницаемости мембран и, следовательно, оказывает большое влияние на антимикробную активность, главным образом, гидрофобных антибиотиков (Vaara, 1993; Delcour, 2009). Одним из основных интересов этого исследования было выяснение роли ЛПС в антимикробной активности катионных AMP, уделяя особое внимание как влиянию структуры внутренней и внешней области ядра-ОС, так и фосфорилированию ядра. -ОПЕРАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ.Исходя из наших результатов, мы можем заключить, что изменения структуры внутренней области core-OS оказывают большое влияние на антимикробную активность катионных AMP, и большинство протестированных AMP проявляют повышенную антимикробную активность в мутантах deep raw E coli В E. coli внутренняя область core-OS может выполнять защитную функцию, предотвращая связывание катионных AMP с внутренним core-OS, которое считается ахиллесовой пятой LPS. Связывание катионных AMP с внутренним ядром OS может вызвать усиленную латеральную диффузию LPS.Это вызвано смещением двухвалентных катионов, которые обычно стабилизируют соседние молекулы LPS за счет электростатических взаимодействий и приводят к увеличению проницаемости ОВ. Удалив внешнюю область core-OS, AMP получат более легкий доступ к клеточной мембране, что способствует проникновению AMP за счет самодостаточного поглощения. Это согласуется с предыдущими исследованиями, которые продемонстрировали, что внешняя область сердцевины ОС играет защитную роль против крупных катионных антимикробных агентов, таких как колицин N, и что внешняя область сердцевины ОС ослабляет неспецифические взаимодействия между колицином N и поверхность мембраны (Clifton et al., 2016). Однако степень повышенной восприимчивости сильно зависит от природы самого AMP. Чувствительность тестируемых мутантов, дефицитных по внутреннему коровому региону OS, например, не изменяется для Cap11 по сравнению со штаммом дикого типа, тогда как те же мутанты в 4-8 раз более чувствительны к мелиттину по сравнению с родительским штаммом. Не только природа AMP, но и ген, который был удален, по-видимому, играет решающую роль в антимикробной активности некоторых AMP. Например, мутант waaF проявляет в 4-8 раз повышенную чувствительность к цекропину P1 и цекропину B по сравнению с мутантом waaG только в 2 раза более восприимчивым.Фосфорилирование остатков сахара HepI и HepII играет второстепенную роль в антимикробной активности большинства тестируемых AMP, за исключением мелиттина. Только мелиттин на 4-8 более активен в E. coli , в котором отсутствуют все фосфатные группы во внутренней области ядра. Однако ранее было продемонстрировано, что мутант waaY , у которого отсутствует фосфатная группа на HepII, менее восприимчив к LL-37, но не к другим AMP, включая CRAMP, SMAP-29, BMAP-27, Bac7 или полимиксин (Bociek et al., 2015). Эти результаты позволяют предположить, что E. coli с внутренней областью ядра OS, не содержащей фосфатов, может быть более или менее восприимчивым к катионным AMP, что предполагает более специфические взаимодействия отдельных AMP и LPS.
Кроме того, наши находки предполагают, что не только внутренняя центральная область core-OS, но также и внешняя область core-OS важна для механизма действия катионных AMPs в E. coli . Состав различных сахарных фрагментов внешней области ядра-OS определяет антимикробную активность некоторых из протестированных катионных AMP, включая Cap18, Cap11, Cap11-1-18m 2 , мелиттин и индолицидин. E. coli F2513, представляющий тип ядра R4, в 4-8 раз более восприимчив к мелиттину, чем штамм E. coli , представляющий тип ядра K-12, R1, R2 или R3. Точно так же индолицидин, Cap18, Cap11 и Cap11-1-18m 2 в 2 раза более эффективны в отношении E. coli F2513. Напротив, для цекропина B, как и для цекропина P1, состав внешней области core-OS не влияет на антимикробную активность. Взятые вместе, эти данные ясно показывают, что защитная роль внешней области ядра-ОС зависит от типа ядра и различных составов сахаров.Чтобы определить наиболее эффективный AMP против одного конкретного E . coli, анализ основного типа был бы полезным и полезным перед введением AMP. Ранее для E. coli была разработана система типирования ядра LPS на основе ПЦР, которая позволяет идентифицировать тип ядра (Amor et al., 2000).
Как было показано ранее, Cap18 очень активен против более широкого круга бактериальных патогенов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, и является многообещающим кандидатом для дальнейшего применения (Ebbensgaard et al., 2015). Чтобы лучше понять механизм действия и взаимодействия между Cap18 и OM E. coli , мы исследовали противомикробную активность ряда производных Cap18 в различных мутантных фонах E. coli с измененным внутренним ядром-OS. область. Наши данные показывают важность LPS для противомикробной активности Cap18 и демонстрируют, что некоторые из изначально неактивных производных Cap18 могут восстанавливать полную антимикробную активность в определенных фонах с дефицитом LPS.Основываясь на наших результатах, мы можем сделать вывод, что неповрежденная гидрофобная поверхность Cap18 играет решающую роль в антимикробной активности против E. coli ATCC25922, в частности гидрофобных остатков I13, L17, I20, I24 и L27 (Рисунок 3). . Тестируемые производные, содержащие замену на гидрофобной поверхности (I13, L17, I20, I24, L27), можно разделить на две разные группы. Одна группа демонстрирует полную потерю антимикробной активности независимо от структуры LPS, а вторая группа производных Cap18, которые изначально были неактивны против дикого типа, но восстановили полную или частичную антимикробную активность у мутантов LPS с измененным внутренним ядром-OS. .Введение отрицательно заряженного остатка аспарагиновой кислоты в положение I13 или L17 разрушает антимикробную активность Cap18 против мутантов дикого типа и LPS независимо от внутренней структуры ядра-OS. Это говорит о том, что изменения Cap18, вызванные введением отрицательно заряженного остатка в центральном гидрофобном положении, оказывают драматическое влияние на антимикробную активность, что согласуется с нашим предыдущим исследованием, показывающим, что Cap18 I13D и L17D теряли активность против любого из протестированных микроорганизмов, независимо от того, грамположительные они или грамотрицательные (Ebbensgaard et al., 2018). Точно так же введение остатка пролина в положение L17 приведет к полной потере антимикробной активности. Напротив, антимикробная активность Cap18 I13R, в котором гидрофобный остаток заменен положительно заряженным аргинином, может быть восстановлена у мутантов deep raw. Интересно, что степень антимикробной активности Cap18 I13R сильно зависит от типа мутации LPS, что предполагает, что длина усечения LPS определяет антимикробную активность Cap18 I13R.Мутант LPS, у которого отсутствует только внешняя область core-OS, более восприимчив, чем мутант без гептозы, состоящий только из минимальной единицы Kdo2-LipidA. Точно так же антимикробная активность Cap18 L17K может быть частично восстановлена путем изменения внутренней структуры ядра-ОС. Интересно, что это же производное, как было показано, проявляет видоспецифичную антимикробную активность, убивая только P. aeruginosa , но не поражая Y. ruckeri, L. lactis и E. faecalis (Ebbensgaard et al.). Эти данные свидетельствуют о том, что антимикробная активность Cap18 L17K зависит от структуры бактериальной клеточной стенки. Аналогичным образом производные с заменой I20E, I20N, I24G, I24N или L27P, изначально неактивные в отношении E. coli дикого типа , восстанавливают полную или частичную активность за счет изменения структуры LPS. Подводя итог, мы предлагаем тесное взаимодействие между LPS и Cap18, которое очень специфично для тестируемой производной Cap18 и сильно зависит от структуры внутреннего ядра ОС.
Рисунок 3 . Прогнозируемая структура Cap18. Структура Cap18 была предсказана с помощью I-Tasser (Roy et al., 2010) и визуализирована с помощью программного обеспечения CCP4 (McNicholas et al., 2011). Предсказанная α-спираль выделена красным. Зеленым цветом показаны гидрофобные остатки α-спирали. (A) Вид по оси спирали, (B) вид от N до C-терминала, (C) вид от C- до N-терминала.
Авторские взносы
AE, EH и FA разработали исследование, отвечали за общий дизайн исследования и принимали участие в обсуждениях проекта.AE и HM выполнили все экспериментальные работы. Рукопись составили AE и EH. AE, HM, FA и EH внесли свой вклад в редактирование рукописи и одобрили заявку.
Финансирование
Исследование стало возможным благодаря финансовой поддержке со стороны Датского Министерства продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства, программы поддержки зеленого развития и демонстрации (номер гранта GUDP: 3405-10-0124) и Датского инновационного фонда (номер гранта 7045-00021B).
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Список литературы
Амор К., Хайнрихс Д. Э., Фрирдич Э., Зибелл К., Джонсон Р. П. и Уитфилд К. (2000). Распределение основных типов олигосахаридов в липополисахаридах из Escherichia coli . Заражение. Иммун. 68, 1116–1124. DOI: 10.1128 / IAI.68.3.1116-1124.2000
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Баба Т., Ара Т., Хасегава М., Такай Ю., Окумура Ю., Баба М. и др. (2006). Конструирование Escherichia coli K-12 в рамке считывания, нокаут-мутантов по одному гену: коллекция Keio. Mol. Syst. Биол. 2: 2006.0008. DOI: 10.1038 / msb4100050
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Bociek, K., Ferluga, S., Mardirossian, M., Benincasa, M., Tossi, A., Gennaro, R., et al. (2015). Фосфорилирование липополисахарида киназой WaaY влияет на восприимчивость Escherichia coli к человеческому антимикробному пептиду LL-37. J. Biol. Chem. 290, 19933–19941. DOI: 10.1074 / jbc.M114.634758
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Браннон, Дж.R., Thomassin, J. L., Desloges, I., Gruenheid, S., and Le Moual, H. (2013). Роль уропатогенного OmpT Escherichia coli в устойчивости к человеческому кателицидину LL-37. FEMS Microbiol. Lett. 345, 64–71. DOI: 10.1111 / 1574-6968.12185
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Браун В. и Рен К. (1969). Химическая характеристика, пространственное распределение и функция липопротеина (муреин-липопротеин) клеточной стенки E. coli.Специфическое влияние трипсина на структуру мембраны. Eur. J. Biochem. 10, 426–438.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Chang, T.-W., Lin, Y.-M., Wang, C.-F., and Liao, Y.-D. (2012). Липопротеин внешней мембраны Lpp представляет собой грамотрицательный рецептор бактериальной клеточной поверхности для катионных антимикробных пептидов. J. Biol. Chem. 287, 418–428. DOI: 10.1074 / jbc.M111.2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Клифтон, Л.А., Чесельски, Ф., Шкода, М. В. А., Парачини, Н., Холт, С. А., и Лейки, Дж. Х. (2016). Влияние размера липополисахаридного основного олигосахарида на электростатическое связывание антимикробных белков с моделями внешней грамотрицательной бактериальной мембраны. Langmuir 32, 3485–3494. DOI: 10.1021 / acs.langmuir.6b00240
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Коулз, К. Э., Ли, Ю., Земмельхак, М. Ф., Кристя, И. М., и Силхави, Т. Дж. (2011).Свободные и связанные формы Lpp занимают разные субклеточные местоположения в Escherichia coli . Mol. Microbiol. 79, 1168–1181. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2011.07539.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Даценко К. А., Ваннер Б. Л. (2000). Одностадийная инактивация хромосомных генов в Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР. Proc. Natl. Акад. Sci. США 97, 6640–6645. DOI: 10.1073 / pnas.120163297
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэвис, С.К., Фаулер, Т., Уотсон, Дж., Ливермор, Д. М., и Уокер, Д. (2013). Годовой отчет главного врача: инфекция и рост устойчивости к противомикробным препаратам. Ланцет 381, 1606–1609. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (13) 60604-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эббенсгаард А., Мордхорст Х., Овергаард М. Т., Ареструп Ф. М. и Хансен Э. Б. (2018). Анализ антимикробной и гемолитической активности Cap18: создание производных Cap18 с повышенной специфичностью. PLoS ONE 13: e0197742. DOI: 10.1371 / journal.pone.0197742
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эббенсгаард, А., Мордхорст, Х., Овергаард, М. Т., Нильсен, К. Г., Ареструп, Ф. М., и Хансен, Э. Б. (2015). Сравнительная оценка антимикробной активности различных антимикробных пептидов против ряда патогенных бактерий. PLoS ONE 10: e0144611. DOI: 10.1371 / journal.pone.0144611
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фрирдич, Э.и Уитфилд К. (2005). Липополисахаридная структура олигосахарида внутреннего ядра и стабильность внешней мембраны в патогенных микроорганизмах человека, принадлежащих к Enterobacteriaceae. J. Endotoxin Res. 11, 133–144. DOI: 10.1179 / 096805105X46592
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хэммерлинг Г., Людериц О., Вестфаль О. и Макела П. Х. (1971). Структурные исследования основного полисахарида Escherichia coli 0100. Eur.J. Biochem. 22, 331–344. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1971.tb01549.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хайнрихс Д. Э., Монтейро М. А., Перри М. Б. и Уитфилд К. (1998a). Система сборки липополисахарида R2 стержневого типа Escherichia coli представляет собой гибрид тех, что обнаружены в Escherichia coli K-12 и Salmonella enterica . J. Biol. Chem. 273, 8849–8859. DOI: 10.1074 / jbc.273.15.8849.
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998b). Молекулярная основа структурного разнообразия в основных областях липополисахаридов Escherichia coli и Salmonella enterica . Mol. Microbiol. 30, 221–232. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1998.01063.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хирота Ю., Судзуки Х., Нисимура Ю., и Ясуда, С. (1977). О процессе деления клеток в Escherichia coli : мутант E. coli, лишенный муреин-липопротеина. Proc. Natl. Акад. Sci. США 74, 1417–1420.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Хритоненко В., Статопулос К. (2007). Белки омптина: расширяющееся семейство протеаз внешней мембраны грамотрицательных бактерий Enterobacteriaceae. Mol. Membr. Биол. 24, 395–406. DOI: 10.1080 / 09687680701443822
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кандж, С.С., Канафани З.А. (2011). Современные концепции противомикробной терапии против резистентных грамотрицательных организмов: продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра действия Enterobacteriaceae , устойчивые к карбапенемам Enterobacteriaceae и мультирезистентные Pseudomonas aeruginosa . Mayo Clin. Proc. 86, 250–259. DOI: 10.4065 / mcp.2010.0674
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ковата, Х., Точиги, С., Кусано, Т., и Кодзима, С. (2016). Количественное измерение проницаемости внешней мембраны у Escherichia coli, lpp и мутантов tol-pal определяет значение функции Tol-Pal для поддержания устойчивости к лекарствам. J. Antibiot. 69, 863–870. DOI: 10.1038 / ja.2016.50
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Крамер, Р. А., Вандепутте-Руттен, Л., Де Рун, Г. Дж., Грос, П., Деккер, Н., и Эгмонд, М. Р. (2001). Идентификация незаменимых кислотных остатков протеазы OmpT внешней мембраны поддерживает новый активный сайт. FEBS Lett. 505, 426–430. DOI: 10.1016 / S0014-5793 (01) 02863-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Крамер Р. А., Зандвейкен Д., Эгмонд М. Р. и Деккер Н. (2000). Фолдинг in vitro, очистка и характеристика протеазы наружной мембраны Escherichia coli OmpT. Eur. J. Biochem. 267, 885–893. DOI: 10.1046 / j.1432-1327.2000.01073.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
МакНиколас, С., Поттертон, Э., Уилсон, К. С., Нобл, М. Э. М. (2011). Представляем ваши структуры: программа молекулярной графики CCP4mg. Acta Crystallogr. Разд. D Biol. Кристаллогр. 67, 386–394. DOI: 10.1107 / S04
7281
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Neidhardt, F., and Umbarger, H. (1996). «Химический состав Escherichia coli », в Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology , eds F.Нейдхардт, К. Р. Кертисс, Дж. И. Ингрэм, Э. К. С. Лин, К. Б. Лоу и Б. Магасаник (Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press), 13–16.
Google Scholar
Никайдо, Х. (1996). «Наружная мембрана» в Escherichia coli и Salmonella: Cellular and Molecular Biology , ред. Ф. Нейдхардт, CR Curtiss, JI Ingraham, ECC Lin, KB Low и B. Magasanik (Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press), 29– 47.
Google Scholar
Рой А., Кучукурал А. и Чжан Ю. (2010).I-TASSER: единая платформа для автоматизированного прогнозирования структуры и функции белков. Nat. Protoc. 5, 725–738. DOI: 10.1038 / nprot.2010.5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шмидт Г., Фромм И. и Майер Х. (1970). Иммунохимические исследования основных липополисахаридов энтеробактерий разных родов. Eur. J. Biochem. 14, 357–366. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1970.tb00297.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шмидт, Г., Янн, Б., и Янн, К. (1969). Иммунохимия R-липополисахаридов Escherichia coli . Различные области ядра в липополисахаридах группы O 8. Eur. J. Biochem. 10, 501–510.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Шмидт, Г., Янн, Б., и Янн, К. (1974). Генетические и иммунохимические исследования на Escherichia coli O14: K7: H-. Eur. J. Biochem. 42, 303–309. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1974.tb03340.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шнек, Э., Шуберт Т., Коновалов О. В., Куинн Б. Э., Гуцманн Т., Бранденбург К. и др. (2010). Количественное определение распределения ионов в бактериальных липополисахаридных мембранах с помощью рентгеновской флуоресценции скользящего падения. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 9147–9151. DOI: 10.1073 / pnas.0
7107.PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Штумпе С., Шмид Р., Стивенс Д. Л., Георгиу Г. и Баккер Э. П. (1998). Идентификация OmpT как протеазы, которая гидролизует антимикробный пептидный протамин до того, как он попадет в растущие клетки Escherichia coli . J. Bacteriol. 180, 4002–4006.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Сугимура К. и Нишихара Т. (1988). Очистка, характеристика и первичная структура протеазы VII Escherichia coli со специфичностью для парных основных остатков: идентичность протеазы VII и OmpT. J. Bacteriol. 170, 5625–5632.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Судзуки, Х., Нисимура, Ю., Ясуда, С., Нисимура, А., Ямада, М., и Хирота, Ю.(1978). Муреин-липопротеин Escherichia coli : белок, участвующий в стабилизации оболочки бактериальных клеток. MGG Mol. Genet Genet. 167, 1–9. DOI: 10.1007 / BF00270315.
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Томассен, Дж. Л., Браннон, Дж. Р., Гиббс, Б. Ф., Грюнхайд, С., и Ле Муаль, Х. (2012). Протеазы внешней мембраны OmpT энтерогеморрагической и энтеропатогенной Escherichia coli по-разному участвуют в деградации человеческого LL-37. Заражение. Иммун. 80, 483–492. DOI: 10.1128 / IAI.05674-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ваара, М. (1993). Чувствительные к антибиотикам мутанты Escherichia coli и Salmonella typhimurium . Антимикробный. Агенты Chemother. 37, 2255–2260.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Виноградов Э. В., Ван дер Дрифт К., Томас-Оутс Дж. Э., Мешков С., Брейд Х., Холст О.(1999). Структуры углеводных скелетов липополисахаридов из Escherichia coli грубых мутантов F470 (тип ядра R1) и F576 (тип ядра R2). Eur. J. Biochem. 261, 629–639. DOI: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00280.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Виклер М. А., Кокерилл Ф. Р., Буш К., Дадли М. Н., Элиопулос Г. М., Харди Д. Дж. И др. (2009). Методы испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам при разведении бактерий, которые растут в аэробных условиях; Утвержденный стандарт, 8-е издание .Уэйн, Пенсильвания: Институт клинических и лабораторных стандартов
Google Scholar
Йетон, Дж. А., Хайнрихс, Д. Э., Монтейро, М. А., Перри, М. Б., и Уитфилд, К. (1998). Участие waaY, waaQ и waaP в модификации липополисахарида Escherichia coli и их роль в формировании стабильной внешней мембраны. J. Biol. Chem. 273, 26310–26316 DOI: 10.1074 / jbc.273.41.26310
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Природные и сконструированные бактериальные везикулы наружной мембраны
Apostolico Jde S, Lunardelli VA, Coirada FC, Boscardin SB, Rosa DS (2016) Адъюванты: классификация, методы работы и лицензирование.J Immunol Res 2016: 1459394
PubMed Google ученый
Baselga J, Swain SM (2009) Новые противораковые мишени: повторное посещение ERBB2 и открытие ERBB3. Nat Rev Cancer 9 (7): 463–475
CAS PubMed Google ученый
Bauman SJ, Kuehn MJ (2006) Очистка пузырьков внешней мембраны от Pseudomonas aeruginosa и их активация ответа IL-8.Микробы заражают 8 (9–10): 2400–2408
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Baumgarten T, Sperling S, Seifert J, von Bergen M, Steiniger F, Wick LY, Heipieper HJ (2012) Образование мембранных пузырьков как механизм множественной стрессовой реакции усиливает гидрофобность поверхности клеток Pseudomonas putida DOT-T1E и образование биопленок. Appl Environ Microbiol 78 (17): 6217–6224
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Bishop D, Work E (1965) Внеклеточный гликолипид, продуцируемый Escherichia coli , выращенный в лизин-ограничивающих условиях.Biochem J 96 (2): 567–576
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Битто, штат Нью-Джерси, Капаракис-Лиаскос М. (2017) Терапевтическое преимущество бактериальных мембранных везикул. Int J Mol Sci 18 (6): 1287
PubMed Central Google ученый
Bjune G, Hoiby E, Gronnesby J, Arnesen O, Fredriksen JH, Lindbak A, Nokleby H, Rosenqvist E, Solberg L, Closs O (1991) Эффект вакцины на основе везикул наружных мембран против менингококковой инфекции группы B в Норвегии.Ланцет 338 (8775): 1093–1096
CAS Google ученый
Bonnington KE, Kuehn MJ (2014) Отбор и экспорт белка через везикулы внешней мембраны. BBA-Mol Cell Res 1843 (8): 1612–1619
CAS Google ученый
Брей Ф., Ферли Дж., Сурджоматарам И., Сигель Р.Л., Торре Л.А., Джемаль А. (2018) Глобальная статистика рака 2018: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности от 36 раковых заболеваний в 185 странах во всем мире.CA-Cancer J Clin 68 (6): 394–424
PubMed Google ученый
Brown L, Wolf JM, Prados-Rosales R, Casadevall A (2015) Через стенку: внеклеточные везикулы у грамположительных бактерий, микобактерий и грибов. Nat Rev Microbiol 13 (10): 620–630
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Чаттерджи Д., Чаудхури К. (2013) Vibrio cholerae Везикулы наружной мембраны O395 модулируют эпителиальные клетки кишечника белком NOD1 и индуцируют опосредованные дендритными клетками ответы клеток Th3 / Th27.J Biol Chem 288 (6): 4299–4309
CAS PubMed Google ученый
Chen DJ, Osterrieder N, Metzger SM, Buckles E, Doody AM, DeLisa MP, Putnam D (2010) Доставка чужеродных антигенов с помощью сконструированных вакцин везикул внешней мембраны. Proc Natl Acad Sci USA 107 (7): 3099–3104
CAS Google ученый
Chen L, Valentine JL, Huang CJ, Endicott CE, Moeller TD, Rasmussen JA, Fletcher JR, Boll JM, Rosenthal JA, Dobruchowska J, Wang Z, Heiss C, Azadi P, Putnam D, Trent MS, Jones BD, DeLisa MP (2016) Везикулы внешней мембраны, демонстрирующие сконструированные гликотопы, вырабатывают защитные антитела.Proc Natl Acad Sci USA 113 (26): E3609 – E3618
CAS PubMed Google ученый
Чен К., Розовский С., Чен В. (2017) Разработка многофункциональных бактериальных везикул внешней мембраны как модульных наноустройств для биосенсинга и биоимиджинга. Chem Commun 53 (54): 7569–7572
CAS Google ученый
Chin WC, Kim JH, Yoon YJ, Lee J, Choi EJ, Yi N, Park KS, Park J, Lötvall J, Kim YK, Gho YS (2013) Везикулы наружной мембраны, полученные из Escherichia coli up- регулируют экспрессию молекул адгезии эндотелиальных клеток in vitro и in vivo .PLoS One 8 (3): e59276
Google ученый
Choi SJ, Kim MH, Jeon J, Kim OY, Choi Y, Seo J, Hong SW, Lee WH, Jeon SG, Gho YS, Jee YK, Kim YK (2015) Активная иммунизация внеклеточными везикулами, полученными из Staphylococcus aureus эффективно защищает от стафилококковых инфекций легких, в основном через иммунитет, опосредованный клетками Th2. PLoS One 10 (9): e0136021
PubMed PubMed Central Google ученый
Dorward DW, Garon CF (1990) ДНК упакована внутри мембранных везикул грамотрицательных, но не грамположительных бактерий.Appl Environ Microbiol 56 (6): 1960–1962
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Эллис Т.Н., Куэн М.Дж. (2010) Вирулентность и иммуномодулирующая роль везикул наружной мембраны бактерий. Microbiol Mol Biol Rev 74 (1): 81–94
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Fantappie L, de Santis M, Chiarot E, Carboni F, Bensi G, Jousson O, Margarit I, Grandi G (2014) Опосредованный антителами иммунитет, индуцированный сконструированными OMV Escherichia coli , несущими гетерологичные антигены в своем просвете.J Extracell Vesicles 3: 24015. https://doi.org/10.3402/jev.v3.24015
CAS Статья Google ученый
Gao W, Fang RH, Thamphiwatana S, Luk BT, Li J, Angsantikul P, Zhang Q, Hu CM, Zhang L (2015) Модуляция антибактериального иммунитета с помощью наночастиц, покрытых бактериальной мембраной. Nano Lett 15 (2): 1403–1409
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Gnopo YMD, Watkins HC, Stevenson TC, DeLisa MP, Putnam D (2017) Конструирование везикул внешней мембраны в качестве иммуномодулирующих систем – перепрограммирующих бактерий для доставки вакцины.Adv Drug Deliv Rev 114: 132–142
CAS PubMed Google ученый
Guidi R, Levi L, Rouf SF, Puiac S, Rhen M, Frisan T (2013) Salmonella enterica доставляет свой генотоксин через везикулы внешней мембраны, секретируемые инфицированными клетками. Cell Microbiol 15 (12): 2034–2050
CAS PubMed Google ученый
Гуджрати В., Ким С., Ким С. Х, Мин Дж. Дж., Чой Х. Э., Ким С. К., Джон С. (2014) Биоинженерные везикулы бактериальной внешней мембраны в качестве клеточно-специфических средств доставки лекарств для лечения рака.ACS Nano 8 (2): 1525–1537
CAS PubMed Google ученый
Haurat MF, Elhenawy W, Feldman MF (2015) Прокариотические мембранные везикулы: новые взгляды на биогенез и биологические роли. Biol Chem 396 (2): 95–109
CAS PubMed Google ученый
Huang W, Yao Y, Long Q, Yang X, Sun W, Liu C, Jin X, Li Y, Chu X, Chen B, Ma Y (2014) Иммунизация против множественной лекарственной устойчивости Acinetobacter baumannii эффективно защищает мышей в моделях пневмонии и сепсиса.PLoS One 9 (6): e100727
PubMed PubMed Central Google ученый
Хуанг В, Ван С, Яо И, Ся И, Ян Х, Ли К., Сунь П, Лю Ц., Сунь В, Бай Х, Чу Х, Ли И, Ма Y (2016), использующие Escherichia coli -производные везикулы наружной мембраны в качестве платформы для доставки антигена вызывают защитный иммунитет против инфекции Acinetobacter baumannii . Научный представитель 6: 37242
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Джанг С.К., Ким С.Р., Юн Й.Дж., Пак К.С., Ким Дж.Х., Ли Дж., Ким ОЙ, Чой Э.Дж., Ким Д.К., Чой Д.С., Ким Ю.К., Пак Дж., Ди Визио Д., Гхо Ю.С. (2015) In vivo кинетическое биораспределение наноразмерных везикул внешней мембраны, полученных из бактерий.Малый 11 (4): 456–461
CAS PubMed Google ученый
Капаракис-Лиаскос М., Ферреро Р.Л. (2015) Иммунная модуляция с помощью везикул наружной мембраны бактерий. Nat Rev Immunol 15 (6): 375–387
CAS PubMed Google ученый
Kataoka M, Yamaoka A, Kawasaki K, Shigeri Y, Watanabe K (2014) Чрезвычайная денатурирующая толерантность к ансамблям кератинолитического протеазного комплекса, производимым Meiothermus ruber h428.Appl Microbiol Biotechnol 98 (7): 2973–2980
CAS PubMed Google ученый
Kim JE, Phan TX, Nguyen VH, Dinh-Vu HV, Zheng JH, Yun M, Park SG, Hong Y, Choy HE, Szardenings M, Hwang W, Park JA, Park S, Im SH, Min JJ (2015a) Salmonella typhimurium подавляет рост опухоли за счет провоспалительного цитокина интерлейкина-1бета. Тераностика 5 (12): 1328–1342
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Kim JH, Lee J, Park J, Gho YS (2015b) Грамотрицательные и грамположительные бактериальные внеклеточные везикулы.Semin Cell Dev Biol 40: 97–104
CAS PubMed Google ученый
Kim OY, Dinh NT, Park HT, Choi SJ, Hong K, Gho YS (2017a) Бактериальные нанопузырьки, полученные из протопластов, для направленной доставки химиотерапевтических препаратов в опухоли. Биоматериалы 113: 68–79
CAS PubMed Google ученый
Kim OY, Hong BS, Park KS, Yoon YJ, Choi SJ, Lee WH, Roh TY, Lotvall J, Kim YK, Gho YS (2013) Иммунизация с помощью везикул внешней мембраны Escherichia coli защищает вызванную бактериями летальность через ответы клеток Th2 и Th27.J Immunol 190 (8): 4092–4102
CAS PubMed Google ученый
Kim OY, Park HT, Dinh NTH, Choi SJ, Lee J, Kim JH, Lee S.W, Gho YS (2017b) Бактериальные везикулы наружной мембраны подавляют опухоль с помощью интерферон-γ-опосредованного противоопухолевого ответа. Nat Commun 8 (1): 626
PubMed PubMed Central Google ученый
Климентова Ю., Стулик Дж. (2015) Методы выделения и очистки везикул наружной мембраны от грамотрицательных бактерий.Microbiol Res 170: 1–9
CAS PubMed Google ученый
Knox K, Vesk M, Work E (1966) Связь между экскретируемыми липополисахаридными комплексами и поверхностными структурами лимитированной лизином культуры Escherichia coli . J Bacteriol 92 (4): 1206–1217
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Kuehn MJ (2012) Секретированные бактериальные пузырьки как хорошие самаритяне.Клеточный микроб-хозяин 12 (4): 392–393
CAS PubMed Google ученый
Kuipers K, Daleke-Schermerhorn MH, Jong WS, ten Hagen-Jongman CM, van Opzeeland F, Simonetti E, Luirink J, de Jonge MI (2015) Везикулы внешней мембраны сальмонелл, демонстрирующие высокую плотность пневмококкового антигена на поверхности предлагают защиту от колонизации. Вакцина 33 (17): 2022–2029
CAS PubMed Google ученый
Kulkarni HM, Jagannadham MV (2014) Биогенез и многогранная роль везикул внешней мембраны грамотрицательных бактерий.Microbiology 160 (Pt 10): 2109–2121
CAS PubMed Google ученый
Kulkarni HM, Swamy CVB, Jagannadham MV (2014) Молекулярная характеристика и функциональный анализ пузырьков внешней мембраны антарктической бактерии Pseudomonas syringae предполагает возможную реакцию на условия окружающей среды. J Proteome Res 13 (3): 1345–1358
CAS PubMed Google ученый
Kulp A, Kuehn MJ (2010) Биологические функции и биогенез секретируемых бактериальных пузырьков внешней мембраны.Annu Rev Microbiol 64: 163–184
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Lee EY, Choi DY, Kim DK, Kim JW, Park JO, Kim S, Kim SH, Desiderio DM, Kim YK, Kim KP, Gho YS (2009) грамположительные бактерии продуцируют мембранные везикулы: на основе протеомики характеристика мембранных везикул, происходящих из Staphylococcus aureus . Протеомика 9 (24): 5425–5436
CAS PubMed Google ученый
Li P, Kaslan M, Lee SH, Yao J, Gao Z (2017) Прогресс в методах выделения экзосом.Тераностика 7 (3): 789–804
CAS PubMed Google ученый
Li ZS, Clarke AJ, Beveridge TJ (1998) Грамотрицательные бактерии продуцируют мембранные везикулы, которые способны убивать другие бактерии. J Bacteriol 180 (20): 5478–5483
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Li ZT, Zhang RL, Bi XG, Xu L, Fan M, Xie D, Xian Y, Wang Y, Li XJ, Wu ZD, Zhang KX (2015) Везикулы наружной мембраны, выделенные из двух клинических Acinetobacter baumannii штаммы обладают различной токсичностью и протеомными характеристиками.Microb Pathog 81: 46–52
CAS PubMed Google ученый
MacDonald IA, Kuehn MJ (2013) Стресс-индуцированное образование пузырьков внешней мембраны с помощью Pseudomonas aeruginosa . J Bacteriol 195 (13): 2971–2981
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Manning AJ, Kuehn MJ (2011) Вклад везикул внешней мембраны бактерий во врожденную бактериальную защиту.BMC Microbiol 11: 258
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Mashburn LM, Whiteley M (2005) Мембранные везикулы передают сигналы и способствуют групповой деятельности прокариот. Nature 437 (7057): 422–425
CAS PubMed Google ученый
McCaig WD, Koller A, Thanassi DG (2013) Производство везикул наружной мембраны и трубок наружной мембраны с помощью Francisella novicida .J Bacteriol 195 (6): 1120–1132
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Motevalli SM, Eltahan AS, Liu L, Magrini A, Rosato N, Guo W., Bottini M, Liang X-J (2019) Совместная инкапсуляция куркумина и доксорубицина в наночастицах альбумина блокирует адаптивную устойчивость раковых клеток к лечению. Biophys Rep 5 (1): 19–30
CAS Google ученый
Needham BD, Trent MS (2013) Укрепление барьера: влияние ремоделирования липида A на бактериальный патогенез.Nat Rev Microbiol 11 (7): 467–481
CAS PubMed Google ученый
Needham BD, Carroll SM, Giles DK, Georgiou G, Whiteley M, Trent MS (2013) Модуляция врожденного иммунного ответа с помощью комбинаторной инженерии эндотоксина. Proc Natl Acad Sci USA 110 (4): 1464–1469
CAS PubMed Google ученый
Oishi S, Miyashita M, Kiso A, Kikuchi Y, Ueda O, Hirai K, Shibata Y, Fujimura S (2010) Клеточные местоположения протеиназ и ассоциация с пузырьками в Porphyromonas gingivalis .Eur J Med Res 15 (9): 397–402
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Orench-Rivera N, Kuehn MJ (2016) Экологически контролируемый экспорт, опосредованный бактериальными пузырьками. Cell Microbiol 18 (11): 1525–1536
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Park M, Sun Q, Liu F, DeLisa MP, Chen W (2014) Позиционная сборка ферментов на бактериальных везикулах внешней мембраны для каскадных реакций.PLoS One 9 (5): e97103
PubMed PubMed Central Google ученый
Pathirana RD, Kaparakis-Liaskos M (2016) Бактериальные мембранные везикулы: биогенез, иммунная регуляция и патогенез. Cell Microbiol 18 (11): 1518–1524
CAS PubMed Google ученый
Pawelek JM, Low KB, Bermudes D (2003) Бактерии как векторы, нацеленные на опухоль. Lancet Oncol 4 (9): 548–556
PubMed Google ученый
Петусис-Харрис Х., Пейнтер Дж., Морган Дж., Сакстон П., МакАрдл Б., Гудиер-Смит Ф., Блэк С. (2017) Эффективность менингококковой менингококковой вакцины против гонореи везикул наружной мембраны группы В в Новой Зеландии: ретроспективный случай -контрольное исследование.Ланцет 390 (10102): 1603–1610
CAS Google ученый
Plesa M, Hernalsteens JP, Vandenbussche G, Ruysschaert JM, Cornelis P (2006) Липопротеин внешней мембраны SlyB Burkholderia multivorans способствует целостности мембраны. Res Microbiol 157 (6): 582–592
CAS PubMed Google ученый
Price NL, Goyette-Desjardins G, Nothaft H, Valguarnera E, Szymanski CM, Segura M, Feldman MF (2016) Гликоинженерные везикулы внешней мембраны: новая платформа для бактериальных вакцин.Научный представитель 6: 24931
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Rivera J, Cordero RJ, Nakouzi AS, Frases S, Nicola A, Casadevall A (2010) Bacillus anthracis продуцирует мембранные везикулы, содержащие биологически активные токсины. Proc Natl Acad Sci USA 107 (44): 19002–19007
CAS PubMed Google ученый
Roier S, Zingl FG, Cakar F, Durakovic S, Kohl P, Eichmann TO, Klug L, Gadermaier B, Weinzerl K, Prassl R, Lass A, Daum G, Reidl J, Feldman MF, Schild S (2016 ) Новый механизм биогенеза везикул наружной мембраны у грамотрицательных бактерий.Nat Commun 7: 10515
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Romeu B, Lastre M, Garcia L, Cedre B, Mandariote A, Farinas M, Oliva R, Rosenqvist E, Perez O (2014) Комбинированные менингококковые везикулы серогруппы A и W135 внешней мембраны активируют клеточно-опосредованный иммунитет и долгую -срочные ответы памяти против нековалентного капсульного полисахарида A. Immunol Res 58 (1): 75–85
CAS PubMed Google ученый
Ruiz N, Kahne D, Silhavy TJ (2006) Достижения в понимании бактериального биогенеза внешней мембраны.Nat Rev Microbiol 4 (1): 57–66
PubMed Google ученый
Schertzer JW, Whiteley M (2012) Двухслойная модель биогенеза бактериальных везикул внешней мембраны. MBio 3 (2): e00297-11
PubMed PubMed Central Google ученый
Schulz E, Goes A, Garcia R, Panter F, Koch M, Muller R, Fuhrmann K, Fuhrmann G (2018) Биосовместимые везикулы, полученные из бактерий, обладают присущей им антимикробной активностью.J Control Release 290: 46–55
CAS PubMed Google ученый
Schwechheimer C, Kuehn MJ (2013) Синтетический эффект между стрессом оболочки и отсутствием образования пузырьков внешней мембраны у Escherichia coli . J Bacteriol 195 (18): 4161–4173
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Schwechheimer C, Kuehn MJ (2015) Везикулы внешней мембраны грамотрицательных бактерий: биогенез и функции.Nat Rev Microbiol 13 (10): 605–619
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Sharpe SW, Kuehn MJ, Mason KM (2011) Выявление иммунных эффекторов, происходящих из эпителиальных клеток, с помощью везикул внешней мембраны нетипируемых Haemophilus influenzae . Инфекция иммунной 79 (11): 4361–4369
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Shen Y, Giardino Torchia ML, Lawson GW, Karp CL, Ashwell JD, Mazmanian SK (2012) Везикулы наружной мембраны комменсала человека опосредуют иммунную регуляцию и защиту от болезней.Клеточный микроб-хозяин 12 (4): 509–520
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Шимазу М., Нгуен А., Мулчандани А., Чен В. (2003) Отображение фосфорорганической гидролазы на клеточной поверхности в Pseudomonasputida с использованием якоря ледяной нуклеации. Biotechnol Progr 19 (5): 1612–1614
CAS Google ученый
Silhavy TJ, Kahne D, Walker S (2010) Оболочка бактериальной клетки.Cold Spring Harb Perspect Biol 2 (5): a000414
PubMed PubMed Central Google ученый
Sun Z, Fu Y-X, Peng H (2018) Нацеливание антител на опухолевые клетки повышает противоопухолевый иммунитет. Biophys Rep 4 (5): 243–253
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Thoma J, Manioglu S, Kalbermatter D, Bosshart PD, Fotiadis D, Muller DJ (2018) Обогащенные белком везикулы внешней мембраны как нативная платформа для исследований белков внешней мембраны.Commun Biol 1:23
PubMed PubMed Central Google ученый
Toyofuku M, Carcamo-Oyarce G, Yamamoto T, Eisenstein F, Hsiao CC, Kurosawa M, Gademann K, Pilhofer M, Nomura N, Eberl L (2017) Формирование мембранных пузырьков, вызванное профагом, через повреждение пептидогликанов в Bacillus subtilis . Nat Commun 8 (1): 481
PubMed PubMed Central Google ученый
Toyofuku M, Nomura N, Eberl L (2019) Типы и происхождение бактериальных мембранных везикул.Nat Rev Microbiol 17 (1): 13–24
CAS PubMed Google ученый
Tsai SL, Oh J, Singh S, Chen R, Chen W. (2009) Функциональная сборка мицеллюлозом на поверхности клеток Saccharomyces cerevisiae для гидролиза целлюлозы и производства этанола. Appl Environ Microbiol 75 (19): 6087–6093
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Turnbull L, Toyofuku M, Hynen AL, Kurosawa M, Pessi G, Petty NK, Osvath SR, Carcamo-Oyarce G, Gloag ES, Shimoni R, Omasits U, Ito S, Yap X, Monahan LG, Cavaliere R , Ahrens CH, Charles IG, Nomura N, Eberl L, Whitchurch CB (2016) Взрывной лизис клеток как механизм биогенеза бактериальных мембранных пузырьков и биопленок.Nat Commun 7: 11220
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Valentine JL, Chen L, Perregaux EC, Weyant KB, Rosenthal JA, Heiss C, Azadi P, Fisher AC, Putnam D, Moe GR, Merritt JH, DeLisa MP (2016) Иммунизация везикулами внешней мембраны, демонстрирующими дизайнерские гликотопы дает гликановоспецифические антитела с переключением классов. Cell Chem Biol 23 (6): 655–665
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
van de Waterbeemd B, Streefland M, van der Ley P, Zomer B, van Dijken H, Martens D, Wijffels R, van der Pol L (2010) Улучшенная вакцина OMV против Neisseria meningitidis с использованием генно-инженерных штаммов и процесс очистки без использования моющих средств.Vaccine 28 (30): 4810–4816
PubMed Google ученый
van de Waterbeemd B, Zomer G, van den Ijssel J, van Keulen L, Eppink MH, van der Ley P, van der Pol LA (2013) Истощение цистеина вызывает окислительный стресс и запускает высвобождение пузырьков внешней мембраны Neisseria meningitidis ; значение для разработки вакцины. PLoS One 8 (1): e54314
PubMed PubMed Central Google ученый
van der Pol L, Stork M, van der Ley P (2015) Везикулы наружной мембраны как технология платформенной вакцины.Biotechnol J 10 (11): 1689–1706
PubMed PubMed Central Google ученый
Ваная С.К., Руссо А.Дж., Бел Б., Банерджи И., Янкова М., Дешмук С.Д., Ратинам ВАК (2016) Бактериальные везикулы внешней мембраны опосредуют цитозольную локализацию ЛПС и активацию каспазы-11. Ячейка 165 (5): 1106–1119
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Vernikos G, Medini D (2014) Хроника Бексеро (R).Pathog Glob Health 108 (7): 305–316
PubMed PubMed Central Google ученый
Watkins HC, Rappazzo CG, Higgins JS, Sun X, Brock N, Chau A, Misra A, Cannizzo JPB, King MR, Maines TR, Leifer CA, Whittaker GR, DeLisa MP, Putnam D (2017) Безопасный рекомбинант везикулы наружной мембраны, которые отображают M2e, вызывают гетерологичную защиту от гриппа. Mol Ther 25 (4): 989–1002
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Xue X, Zhao Y, Zhang X, Zhang C, Kumar A, Zhang X, Zou G, Wang PC, Zhang J, Liang XJ (2015) Магнитные наночастицы, функционализированные фенилбороновой кислотой, для одностадийного обогащения сахаридов и массы спектрометрический анализ.Biophys Rep 1: 61–70
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Юань Дж, Ян Дж, Ху З, Ян Ю, Шан В, Ху Q, Чжэн Ю, Пэн Х, Чжан Х, Цай Х, Чжу Дж, Ли М, Ху Х, Чжоу Р, Рао Х (2018 ) Безопасная стафилококковая платформа для развития поливалентных наноразмерных везикул против вирусных инфекций. Nano Lett 18 (2): 725–733
CAS PubMed Google ученый
Zariri A, Beskers J, van de Waterbeemd B, Hamstra HJ, Bindels TH, van Riet E, van Putten JP, van der Ley P (2016) Активация врожденного иммунного ответа, зависящая от состава везикул внешней мембраны менингококка.Infect Immun 84 (10): 3024–3033
CAS PubMed PubMed Central Google ученый
Структура, функции, биогенез и вакцина. Применение
Грамотрицательные бактерии продуцируют везикулы наружной мембраны (OMV) диаметром от 10 до 300 нм. Вклад OMV в бактериальный патогенез представляет большой интерес, и их способность сочетаться с воздействием антигенов в будущем на разработку вакцин.
1. Введение
У широкого круга микроорганизмов во всем мире развилась устойчивость к нескольким антибиотикам, что повлияло на здоровье человека и животных [1, 2]. Патогенные бактерии могут жить в чрезвычайно враждебной среде и использовать различные механизмы для обхода стрессовых условий [3].
Грамотрицательные бактерии являются основными патогенами, которые развивают резистентность и вызывают различные типы инфекций [1, 2, 4]. Они населяют почти все вообразимые среды обитания, но независимо от местоположения; микробам потребовалось разработать инструменты для облегчения взаимодействия микроб-микроб, микроб-хозяин и микроб-среда.Эти бактерии способны продуцировать мембранные везикулы (МВ) [5–7]. Эти MV имеют сферическую форму и часто называют везикулами наружной мембраны (OMV), микровезикулами, экзосомами, толерасомами, агросомами и вирусоподобными частицами, подтвержденными электронной микроскопией [8–11]. Все типы грамотрицательных бактерий выделяют внеклеточные мембраносвязанные везикулы, такие как OMV, в различных средах, включая планктонные культуры, жидкую культуру, твердую культуру, пресную и соленую воду, биопленки, внутри эукариотических клеток и внутри млекопитающих-хозяев [6–8, 12].Мембранные везикулы были впервые обнаружены более 50 лет назад, но обычно считались незначительными и игнорировались микробиологами в течение нескольких десятилетий [13].
Диаметр пузырьков составляет приблизительно от 10 до 300 нм, происходящих от наружной мембраны (OM) и состоящих из липидов, белков, липополисахаридов (LPS), фосфолипидов, ДНК, РНК, белков, внутренней мембраны (IM), периплазмы, OM и другие молекулы из периплазмы между ИМ и ОМ [5, 6, 8, 12, 14]. Таким образом, несколько исследователей пришли к выводу, что OMV способны спровоцировать иммунную систему; затем они признаются многообещающими агентами для использования в качестве вакцин [6] (см. рисунок 1).
Несколько исследований показали, что OMV играют многогранную роль как в нападении, так и в защите [3, 5–7, 15–18]. Среди их функций – повышение выживаемости бактерий за счет снижения уровней токсичных соединений, нейтрализация антимикробных пептидов, придающих устойчивость к антибиотикам, помощь в высвобождении атакующего фага, удаление продуктов стресса из клетки, таких как неправильно свернутые белки, формирование бактериальных сообществ (биопленок). ), доставка молекул, горизонтальный перенос генов или усиление иммунного ответа в клетках-хозяевах [3, 5–7, 15–17].OMV, высвобождаемые из оболочки патогенных бактерий, играют важную роль во взаимодействиях между хозяином и патогеном, включая создание ниши колонизации, передачу факторов вирулентности в клетки-хозяева и модуляцию защиты хозяина [3, 5–7, 10, 14, 16, 17].
Исследования, проводившиеся на протяжении многих лет, были сосредоточены на функции этих пузырьков, но только недавно генетический и биохимический анализ позволил исследователям выяснить механистические аспекты производства OMV [5, 13, 18]. Несколько исследований продемонстрировали сложную клеточную регуляцию продукции OMV, которая зависит от многих факторов, таких как условия окружающей среды, патогенность и общее состояние клеточного метаболизма, варьирующееся в зависимости от вида [5, 6, 12].Перед обсуждением биогенеза этих везикул важно рассмотреть архитектуру оболочки клеточной стенки грамотрицательных бактерий.
В этом обзоре мы сосредоточились на биогенезе OMV, продуцируемых грамотрицательными бактериями, и их использовании в качестве системы доставки вакцин и лекарств. Во-первых, мы описываем аспекты, связанные с грамотрицательными структурами, устойчивостью к антибиотикам, функциями и структурой OMV.
2. Структуры грамотрицательных клеточных стенок (см. Рисунок 2)
Клеточная стенка представляет собой сложную многослойную структуру, которая защищает содержимое бактериальных клеток, предохраняя эти организмы от их непредсказуемой и часто враждебной среды.Он отвечает за селективный химический барьер, который определяет форму клеток и позволяет им выдерживать большие механические нагрузки [14, 19–23].
Оболочка грамотрицательных бактерий состоит из двух мембран, которые химически и структурно различны: внутренняя мембрана (IM) представляет собой жидкий фосфолипидный бислой, клеточная стенка пептидогликана, состоящая из повторяющихся единиц дисахарида N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмерамика. кислоты и внешней мембраны (OM) с фосфолипидами во внутреннем листке и липополисахаридами (LPS) во внешнем листке [8, 10, 14, 20, 23].Периплазма представляет собой водный отсек, плотно заполненный белками, ограниченными ОМ и ИМ [8, 10, 23, 24].
2.1. Outer Membrane (OM)
OM представляет собой асимметричный бислой, состоящий из липополисахаридов (LPS) во внешней створке и фосфолипидов во внутренней створке, залитых неспецифическими поринами и специфическими каналами [21, 23]. Молекула LPS отвечает за эндотоксический шок, связанный с септицемией, вызываемой грамотрицательными организмами, и состоит из основного липида A (структура димера фосфорилированного N-ацетилглюкозамина с 6 или 7 жирными кислотами), основного (R) антигена, R полисахарид (короткая цепь сахаров) и антиген О, присоединенный к полисахариду ядра (повторяющиеся олигосахаридные субъединицы, состоящие из 3-5 сахаров) [21, 23, 25].Вариация сахара в боковой цепи O происходит между видами грамотрицательных бактерий [25]. Эта мембрана также имеет липопротеины (Lpp), закрепленные через ковалентно присоединенный липидный фрагмент, и белки b-цилиндра, называемые белками внешней мембраны (OMP), такие как порины, такие как OmpF, OmpA и OmpC [10, 23]. OmpF и OmpC ответственны за пассивную диффузию небольших молекул, таких как моно-, дисахариды и аминокислоты, через ОМ [14, 20, 23]. OmpA представляет собой обильный мономер, который обеспечивает структурную стабильность клетки [23, 26].OMP на более низких уровнях ответственны за транспортировку крупных лигандов, таких как хелаты железа, или витаминов, таких как витамин B-12 [23]. Барьер селективной проницаемости способствует ограничению поринами диффузии гидрофильных молекул размером более 700 Дальтон [21, 23, 27]. Бислои ЛПС блокируют пассивную диффузию гидрофобных соединений [21, 23, 27]. Пористая мембрана обеспечивает диффузию для питания, удаления отходов и транспорта других молекул [14, 20, 23].
2.2. Пептидогликановая клеточная стенка
Основными структурными особенностями пептидогликана (PG) являются гетерополимер, состоящий из линейных цепей гликана чередующихся остатков β 1,4-связанного N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc). -связанные короткими пептидами [28].Этот компартмент является специфическим компонентом клеточной стенки, локализованным вне цитоплазматической мембраны почти всех бактерий, и он необходим для биосинтеза [29]. Он считается подобным экзоскелету из-за жесткости, окружающей клетку, которая определяет характеристики бактерий [30]. Эта стенка сохраняет форму бактерий, ограничивая лизис от осмотического давления, и служит каркасом для закрепления других компонентов клеточной оболочки, таких как белки. Враждебная среда (например, лечение антибиотиками) вызывает модификации PG в пептидах и частях сахара, которые защищают бактерии во время их роста [23, 29, 30].Эти структурные вариации могут приводить к более слабому врожденному иммунному ответу, защите от хищных ферментов, уклонению от иммунной системы хозяина и манипулированию метаболизмом хозяина для доступа к источнику углерода [31–34]. Микроорганизмы разработали ряд механизмов для изменения химической структуры PG с целью преодоления специфических угроз клеточной стенке [30].
2.3. Периплазма
Периплазма представляет собой компартмент, плотно заполненный белками, более вязкий, чем цитоплазма, содержащая слой пептидогликана (PG) [8, 14, 23].Он находится между двумя двухслойными мембранами оболочки грамотрицательных клеток. Периплазма имеет динамический поток, который изменяет разновидности макромолекул, отражая метаболический статус клетки и состояние окружающей среды [14]. Белки, которые населяют этот компартмент, обладают функциями переноса, хемотаксиса и биогенеза оболочки. Периплазма может изолировать деградирующие ферменты, такие как РНКаза или щелочная фосфатаза, которые потенциально опасны для грамотрицательных бактерий [14, 23, 24].
2.4.Внутренняя мембрана или цитоплазматическая мембрана
Внутренняя мембрана (IM) состоит из типичного фосфолипидного бислоя, который служит электрохимическим барьером [8, 23]. Внутренняя мембрана также содержит рецепторы, которые воспринимают окружающую среду и транспортные системы для питательных веществ и отходов. У бактерий отсутствуют внутриклеточные органеллы, и все органеллы эукариот находятся в ИМ. Эта мембрана содержит белки, которые отвечают за энергетические функции, биосинтез липидов, секрецию и транспорт белков [23].
3. Устойчивость к антибиотикам
По данным ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), устойчивость к бактериям считается проблемой общественного здравоохранения, а также здоровье в учреждениях по уходу [1]. Эта устойчивость возникает, когда бактерии адаптируются и приобретают способность расти в присутствии антибиотиков. Устойчивость к одному конкретному антибиотику может привести к целому родственному классу и быстро и непредсказуемо распространяться за счет обмена генетическим материалом бактерий между различными штаммами, что влияет на лечение слишком многих инфекций и заболеваний [2].
В больницах передача бактерий слишком высока из-за высокой восприимчивости населения. После открытия и широкого использования антибиотиков в середине 20 века многие инфекции можно было лечить и вылечивать [1]. Однако чрезмерное и неправильное применение противомикробных препаратов способствовало появлению штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью [1, 2]. Кроме того, устойчивость к противомикробным препаратам обусловлена легкостью доступа через внебиржевые продажи и продажи через Интернет [2].Следовательно, показатели заболеваемости и смертности растут во всем мире, особенно в развивающихся странах [1]. Многие штаммы, такие как пневмококков , стафилококков , энтерококков и туберкулез , в настоящее время устойчивы к большей части всех противомикробных препаратов [1]. Мультирезистентные Klebsiella , E. coli , Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli распространены во многих больницах [1, 4, 21, 35].
Помимо увеличения смертности и заболеваемости, последствия этой проблемы могут быть серьезными, включая длительное заболевание, длительное пребывание в больнице, риск заражения хирургических устройств и увеличение затрат. Чтобы противостоять резистентности, необходимы долгосрочные инвестиции, в основном для развивающихся стран, с финансовой, технической поддержкой и разработкой новых вакцин или других иммунобиологических продуктов [2], поэтому они чрезвычайно важны для разработки новых иммунобиологических препаратов для борьбы с инфекционными заболеваниями.В этом контексте везикулы, происходящие от патогенов, долгое время изучались с целью разработки вакцин-кандидатов против грамотрицательных бактерий [7, 19, 36-40]. В этом обзоре мы сосредотачиваемся на пузырьках внешней мембраны, потому что эти пузырьки являются многообещающей стратегией.
OMV содержит множество функций, необходимых для эффективного вакцинного продукта: нативная конфигурация поверхностных мембранных антигенов, вызывающая гуморальный ответ, способность вызывать опосредованный Т-клетками иммунный ответ, наличие нескольких патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs). ) для запуска врожденного иммунного ответа и соответствующего размера для эффективного процессинга антигенпрезентирующими клетками [7, 19, 36–41].Потенциал OMV опосредовать бактериальную трансформацию, помогать бактериальным сообществам бороться с антибиотиками и распространять гены устойчивости к антибиотикам [8, 18, 42]. В E. coli добавление OMV или использование гипервезикулирующего мутанта увеличивало непосредственную устойчивость к антимикробным пептидам полимиксину B и колистину 25 [3, 8] . Acinetobacter baumannii также является актуальным условно-патогенным микроорганизмом в больницах и проявляет серьезную лекарственную устойчивость. OMV могут опосредовать передачу устойчивости к карбапенему за счет ингибирования проницаемости мембраны, оттока насосов, ферментов, инактивирующих лекарственные средства, и изменения мишеней лекарств [8, 43].Иммунизация AbOMV ( Acinetobacter baumannii, OMV) продуцировала высокие уровни антител, которые защищали мышей от заражения лекарственно-устойчивым штаммом [8, 43, 44]. Stenotrophomonas maltophilia , обработанный β -лактамным антибиотиком имипенемом, увеличивал продукцию OMV, а протеомный анализ показал присутствие β -лактамазы [45, 46]. Наличие этого фермента указывает на защитную роль везикул в стрессовых условиях [18, 46, 47].
4. Везикулы наружной мембраны (OMV): функции
Существует множество типов внеклеточных везикул (EV), связанных с патогенезом [7, 12, 47, 48]. OMV – это EV, спонтанно высвобождаемые грамотрицательными и грамположительными бактериями. Однако микроорганизм дикого типа производит небольшое количество, которого недостаточно для получения достаточного количества для крупномасштабного производства [47]. OMV представляют собой сфероидальные частицы, расположенные на расстоянии приблизительно от 10 до 300 нм от поверхности клетки на всех этапах роста бактерий, поэтому состав отражает компоненты внешней мембраны [6, 8, 12, 14].Они несут OMP (белки внешней мембраны), LPS (липополисахариды), фосфолипиды, пептидогликан, белки (периплазматические, цитоплазматические и мембраносвязанные), периплазматические компоненты, нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), ионные метаболиты и сигнальные молекулы [6– 8, 12, 14, 49].
Грузы в везикулах позволяют им управлять специализированными функциями в условиях окружающей среды, такими как общение посредством определения кворума (QS), формирование биопленки, получение питательных веществ, устойчивость к антибиотикам, реакция на стресс, конкуренция или защита от других микробов, окружающая среда, статус микробного сообщества , перенос нуклеиновых кислот, горизонтальный перенос генов, доставка токсинов и факторы вирулентности [3, 6, 10–12, 18, 19, 41, 45, 49–62].
Образование биопленок – это реакция на стресс, характеризующаяся наличием экзополисахаридной матрицы и других молекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты [6, 17]. OMV, происходящие из биопленок, играют роль в передаче сигналов о производстве биопленок через поверхностно-ассоциированную ДНК, а также могут опосредовать взаимодействия внутри и вне биопленки, предотвращая повреждение антибиотиками и ферментами [6, 18, 41, 62–67]. Везикулы, полученные в результате культивирования бактерий с течением времени, содержат более высокие уровни антибиотиков по сравнению с культивированием в течение короткого времени.Авторы утверждают, что OMV действуют как резервуар для антибиотиков в биопленках [45].
Микробы постоянно конкурируют в окружающей среде. OMV, продуцируемые одной бактерией, могут убивать другие микробы, даже встречающиеся среди грамотрицательных и грамположительных бактерий [6, 68]. Если пептидогликановые гидролазы, присутствующие в OMV, такие же, как у другого штамма, слой пептидогликана не может быть расщеплен ферментом. Однако, если OMV сливаются с клетками чужеродного штамма, тогда фермент может разрушить клеточную стенку и убить бактерию [6, 14, 68].Везикулы некоторых бактерий содержат бактериолитические ферменты, способные различать собственные и чужие клетки, достигая или не достигая бактерий, которые их окружают [6, 68, 69]. Аутолизины и факторы вирулентности или цитотоксины воздействуют на эукариотические клетки хозяина посредством OMV [6, 68–73].
Секреция OMV – это механизм распространения повреждающих факторов вирулентности, вызывающих бактериальную инфекцию [3, 5]. Бактерии могут подавлять и отклонять врожденную иммунную систему хозяина, чтобы вызвать инфекцию у хозяина.Таким образом, OMV могут выполнять «наступательные» и «оборонительные» функции. Везикулы могут работать как механизм доставки фактора вирулентности и способствовать колонизации бактерий во враждебной среде [3, 5]. OMV могут удалять неправильно свернутый белок, когда бактерии подвергаются химическому или физическому стрессу, изолируют и разрушают антибиотики, а также ловят мишени, защищающие клетки, с помощью антител или фагов [3, 5, 6, 41, 58, 74]. Например, продукция OMV увеличивает выживаемость бактериальных клеток, обработанных литическими бактериофагами [3].Адгезия фага увеличивает везикуляцию OMV и действует как индуктор мишеней для фагов, защищающих бактерии [3, 75]. OMV могут облегчить стресс, вызванный мембранно-направленными пептидными антибиотиками, такими как полимиксин B, действуя как мишени-ловушки и транспортируя эти молекулы от клетки [3]. Более того, OMV являются фундаментальными для выживания бактериального сообщества, потому что постоянное изменение окружающей среды запускает гипервезикуляцию [3, 6, 41, 58, 74].
OMV могут способствовать приобретению питательных веществ для выживания бактерий, несущих ионы металлов, ферменты деградации и рецепторы [6, 41, 45, 69, 76]. За получение ионов металлов идет внутривидовая конкуренция. Согласно Kulp и Kuehn, редкие ионы концентрируются в OMV для потребления бактериальными клетками в нужный момент [6, 41]. Несколько обзоров показали важность транспортировки железа OMV во время инвазии хозяина и для перехода бактерии от планктонного образа жизни к биопленочному, что позволяет микроорганизмам процветать в этом типе сообщества [45, 60].Ли и др. протеомические исследования OMV показали присутствие различных белков, связывающих ионы металлов [77]. Ферменты, содержащиеся в OMV, разрушают сложные биомолекулы в культуральной среде, чтобы сделать питательные вещества доступными [6]. Таким образом, эти везикулы выполняют важную роль во внутривидовом переносе питательных веществ [6, 41].
Бактерии общаются в микробных сообществах через небольшие сигнальные молекулы (), которые составляют сложную регуляторную сеть, контролирующую экспрессию множества генов, включая различные фенотипы, ответственные за их вирулентное поведение [78–80].N-ацилгомосериновые лактоны (AHL) являются наиболее изученным сигналом, продуцируемым более чем 70 видами грамотрицательных бактерий системы Quorum Sensing (QS) [78–83]. Сигнал хинолона Pseudomonas (PQS) из Pseudomonas aeruginosa способствует увеличению кривизны OM и, следовательно, образованию OMV [18, 78, 79, 84, 85]. Cooke et al. описал биофизический механизм этого и недавно показал, что он действует в биопленках. Они продемонстрировали, что продукция OMV, индуцированная PQS, очень динамична во время развития биопленок.Интересно, что синтез PQS и OMV значительно усиливается во время диспергирования по сравнению со стадиями прикрепления и созревания. Они показывают, что очищенные OMV могут активно разрушать внеклеточные белки, липиды и ДНК, и выдвинули гипотезу, что OMV усиливают продукцию PQS-индуцированных OMV во время диспергирования биопленок, облегчая ускользание клеток за счет координации контролируемой деградации компонентов матрикса биопленки [86]. Чувствительность кворума у грамотрицательных бактерий P. aeruginosa включает множественные сигналы, включая 3-оксо-додеканоил гомосеринлактон (3OC12-HSL), бутирилгомосеринлактон (C4-HSL) и PQS 2, 3.Эти молекулы являются частью сложной регуляторной сети и контролируют транскрипцию примерно 5% всех генов P. aeruginosa , включая многие гены, участвующие в вирулентности. PQS необходим для образования MV, а экзогенный PQS опосредует собственную упаковку и упаковку других хинолинов в эти везикулы. Передача сигналов между клетками и антимикробный хинолон, продуцируемый P. aeruginosa , важны для вирулентности, устойчивости к антибиотикам и конкуренции с другими бактериями в легких пациентов, страдающих муковисцидозом.Недавние исследования показывают, что сигнал бактериальная клетка-клетка опосредует упаковку себя и других малых молекул в МВ. Использование MV для координации группового поведения прокариот слишком важно, потому что они проводят параллели с переносом эукариотических пузырьков, которые являются аналогичными системами для многоклеточных организмов [86, 87].
Таким образом, у OMV много ролей. Например, они могут способствовать выживанию бактерий за счет устранения токсичных соединений, нейтрализации агентов окружающей среды и удаления неправильно свернутых периплазматических белков, создания ниши колонизации, образования биопленок, доставки лекарств и модуляции защиты и ответа хозяина [16, 88].
В следующем пункте мы более подробно обсудим функцию доставки, продвигаемую OMV.
5. Функция доставки
Бактериальные OMV обладают многогранной системой распределения взаимодействий между межвидовыми и внутривидовыми взаимодействиями, и эффекты могут быть как полезными, так и вредными [89]. Грузы в везикулы транспортируются на большие расстояния, защищенные от физических и биохимических стрессоров [47, 89, 90]. Везикулы экспортируют набор биомолекул, в основном белков, факторов вирулентности, ЛПС, ДНК, ферментов и токсинов [18, 60–62, 91].Нагрузка OMV обеспечивает несколько преимуществ для болезнетворных микроорганизмов. Белки нечувствительны к обработке протеазами и могут прибыть к месту назначения в необходимой концентрации, а также могут встречаться с другими бактериальными факторами. Белок без механизма самонаправления адгезинов или факторов вирулентности может прилипать к поверхности OMV для транспортировки к мишени. Везикулы, обогащенные липополисахаридом (ЛПС) и мембраносвязанными белками, обладают иммуностимулирующими способностями, способствуя возникновению инфекции и воспаления [5, 12, 86, 91–93].Более того, эти везикулы могут переносить гены между видами бактерий, небольшие фрагменты ДНК, автолизины конкурирующим видам бактерий и доставляющие лекарство синтетические наночастицы, используемые при вакцинации [6, 16, 18, 47, 48, 68, 70].
В целом OMV выделяются в повышенных количествах из патогенных бактерий, что позволяет предположить, что секреция является дополнительным механизмом вирулентности патогенов. OMV могут выполнять как защитные, так и наступательные задачи во время заражения. В качестве защиты они могут использоваться для изоляции антибиотиков, бактериофагов и антител; связывать или разлагать антимикробные пептиды; и приманка антигенов, чтобы отвлечь иммунную систему.Потенциал OMV как наступательного оружия заключается в способности доставлять факторы вирулентности в клетки-хозяева. В частности, OMV, продуцируемые и секретируемые энтерогеморрагической E. coli (EHEC), обладают развитым и одновременным механизмом секреции и доставки факторов бактериальной вирулентности в клетки-хозяева [94]. Энтеротоксигенный E. coli (ETEC) – важный патоген, ответственный за диарею, вызывающий более 700 000 детских смертей от диареи в год в странах третьего мира [1, 5, 8, 12, 91].Термолабильный энтеротоксин (LT), продуцируемый ETEC, нарушает электролитный баланс в эндотелии кишечника, связан с везикулами и способствует патогенности [91]. Kesty et al. показали, что патогенный ETEC использует везикулы для доставки LT, который катализирует интернализацию везикул микроорганизмов в слой слизистой оболочки клетки-хозяина, вызывая инфекцию, локально или вдали от места колонизации. Помимо токсичных соединений, везикулы, содержащие ДНК, были проверены у Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae с линейной и кольцевой ДНК, устойчивой к ферментативному гидролизу, Escherichia coli O157: H7, Haemophilus influenzae и других 70 видов бактерий [70]. , 95, 96].Горизонтальный перенос генов опосредован везикулами, выделенными из патогена Escherichia coli O157: H7, которые облегчают перенос генов в Salmonella enterica , и фрагментов ДНК, и наблюдались среди видов бактерий, и это может быть коррелировано генами, кодирующими факторы вирулентности. и устойчивость к антибиотикам [70]. Lin et al. (2017) подтвердили, что ионы железа необходимы во всех жизненных процессах, связанных с метаболизмом, размножением и патогенными бактериями, чтобы справиться с проблемами питания, разработав множество эффективных стратегий для удаления металлического железа из окружающей среды.У Mycobacterium tuberculosis мембранные везикулы участвуют в приобретении железа [97, 98]. P. aeruginosa представил ген TseF, который облегчает доставку OMV-ассоциированного железа к бактериальным клеткам за счет прямого взаимодействия с железосвязывающим сигналом хинолона Pseudomonas (PQS) [97, 99]. Actinobacillus actinomycetemcomitans вызывает заболевания пародонта, а мембранные везикулы несут несколько белков, связанных с вирулентностью, в виде лейкотоксина [100].
Многие доступные антибиотики неэффективны против внутриклеточных инфекций, в основном из-за трудности проникновения или снижения активности препарата [18, 101]. Использование OMV в качестве системы доставки выгодно, поскольку они считаются естественными агентами, продуцируемыми бактериями, быстро захватываются эукариотическими клетками и способны доставлять активные лекарства [101]. Pseudomonas aeruginosa , необработанная антибиотиками, высвобождает нормальные везикулы (n-MV), однако при обработке гентамицином продуцирует везикулы гентамицина (g-везикулы) [101, 102].Эти везикулы g-MV были способны убивать культуры патогенов, включая устойчивый к гентамицину штамм P. aeruginosa , вероятно, потому что g-MV (в сочетании с антибиотиком и автолизином) позволяли преодолевать барьеры проницаемости поверхности и высвобождать антибиотик непосредственно в бактериальная периплазма [101]. Escherichia coli везикулы внешней мембраны, покрытые синтетическими наночастицами с несущей функцией, демонстрируют способность вызывать высокий иммунологический ответ, показывая, что эта технология является большим перспективным средством создания эффективных антибактериальных вакцин [47, 103].
Если говорить о медицине, то OMV обладают многими характеристиками и функциями, необходимыми для средств доставки лекарств [18, 48, 104, 105]. Небольшой размер позволяет им избежать немедленного захвата и удаления иммунологической системой хозяина. Носитель не должен быть иммуногенным и воспалительным, поэтому для достижения этого потребуются различные подходы к разработке OMV в качестве носителей для доставки лекарств. Например, основной компонент везикул LPS является мощным активатором иммунных клеток, который полезен при разработке вакцин или адъювантов.
Однако он вызывает системную и сильную воспалительную реакцию, что нежелательно при доставке лекарств. Генная инженерия минимизирует этот ответ [48]. Встраивание молекул в везикулы может осуществляться двумя способами: до или после их выделения [48, 106]. Первый подход – это метод, используемый для молекул, таких как РНК или аминогликозидные антибиотики, включенных после выделения, поскольку загрузка этих молекул во время культивирования бактерий представляет собой сложный процесс [48, 105, 107].Малые РНК могут лечить заболевания, при которых определенные гены являются сверхактивными, например рак [105]. Методы загрузки везикул лекарством с использованием первого метода включают осмотические градиенты, электропорацию, ультразвуковую обработку или повышение проницаемости мембраны с помощью проникающих в клетки пептидов или химической трансфекции [48, 106]. Второй подход – это загрузка OMV гидрофобных лекарств и гидрофобных соединений во время культивирования бактерий, например куркумина как противовоспалительного препарата [103, 104].In vitro этот препарат внутри OMV показал увеличение растворимости и стабильности, а in vivo он увеличил биодоступность. Введенный куркумин усиливал защиту мышей от септического шока, вызванного ЛПС. Хотя OMV считаются многообещающими средствами доставки лекарств, необходимо разработать методы и подходы для их получения в больших количествах. Также определяющим фактором эффективного терапевтического действия является необходимость оптимизации методов биораспределения в организме пациента [105, 106].
Применение OVM как системы доставки вакцинации мы обсудим более подробно.
6. Биогенез
Биогенез OMV – это процесс почкования за пределами внешней мембраны. Существует множество доказательств того, что везикуляция у грамотрицательных бактерий не является пассивным процессом. Тем не менее, это сложный аппарат для секреции различных основных биологических молекул [6, 11, 16, 38, 41, 45, 76]. Бактерии дикого типа естественным образом выделяют OMV в низкой концентрации, но этого недостаточно для достижения разумного количества для крупномасштабного производства для фармацевтических и биотехнологических приложений [16, 41].Их гипервезикуляция происходит под действием множества факторов, таких как восприятие кворума, температурный стресс, изменение питательных веществ, окислительный стресс, антибиотики и стресс оболочки [16, 58, 108, 109]. OMV могут быть наделены несколькими способностями с использованием генетических модификаций, таких как доставка белков, стимуляция организма для создания иммунной защиты, увеличение бактериальной везикуляции, уменьшение эндотоксина с помощью менее реактогенных структур LPS, отображение антигенов на своей внешней мембране, генерирующих рекомбинантные OMV (rOMV), производят вакцину нового поколения и действуют как адъювант [110].Нет данных о расходе энергии во время биогенеза OMV; однако, вероятно, необходимо определить, какие биомолекулы будут нести OMV [6, 41]. В недавнем обзоре бактериальные мембранные везикулы грамотрицательных бактерий были разделены на везикулы внешней внутренней мембраны (OIMV), взрывные везикулы внешней мембраны (EOMV) и традиционные OMV [111] (см. Рисунок 3). Целостность внешней мембраны не нарушается, когда OMV образуются спонтанно. В то время как при искусственном производстве содержимое просвета отличается от естественных OMV [110, 112].
Предложено несколько моделей формирования механизма OMV. Первая модельная гипотеза касается потери или перемещения дефекта ковалентных связей между внешней мембраной и нижележащим пептидогликановым слоем [6, 41, 112, 113]. Когда это происходит, более высокая скорость роста внешней мембраны, чем подлежащая клеточная стенка, позволяет внешней мембране выступать и, наконец, генерировать OMV [6, 41].
Вторая модель – взаимодействие внешней мембраны и тургорного давления.Накопление фрагментов пептидогликана или неправильно свернутых белков в периплазматическом пространстве оказывает тургорное давление и вызывает выпячивание наружной мембраны [6, 111–116]. Например, у Escherichia coli внешняя мембрана выдерживает тургорное давление 3 атм, а фрагменты пептидогликана могут превышать этот предел и заставлять везикулы высвобождаться [115, 117]. У Pseudomonas aeruginosa истощение Opr86, который играет роль в сборке белка внешней мембраны (OMP), привело к повышенной экспрессии продукции периплазматической сериновой протеазы (MucD) при гипервезикуляции.Неправильно свернутые OMPs в периплазме индуцировали биогенез OMV [116].
Третья модель (модель двухслойной пары) защищает гипотезу об увеличении кривизны мембраны. Pseudomonas aeruginosa имеет сигнал Pseudomonas quinolone (PQS) и использует этот внеклеточный сигнал для связи и координации социальной активности. Эта молекула, воспринимающая кворум, также обеспечивает его упаковку и транспорт, стимулируя образование пузырьков внешней мембраны (OMV), которые служат для перемещения этой молекулы в популяции [118].PQS стимулирует анионное отталкивание между молекулами LPS, что приводит к образованию пузырей на мембране [41, 87, 100, 114, 115, 119]. PQS ограничен тем фактом, что он эксклюзивен для P. aeruginosa , следовательно, видоспецифичен [41, 112, 120].
В четвертой модели, когда гены vacJ и / или yrb замалчиваются или делетированы, фосфолипиды (PL) накапливаются во внешнем листке внешней мембраны, что приводит к асимметричному расширению наружного листка и способствует образованию почки. внешняя мембрана с образованием OMV [112, 117].OMV, полученные из мутантов-переносчиков PL (∆ vacJ и / или ∆ yrb ), содержат более высокие уровни PL по сравнению с OMV дикого типа. Гипервезикуляция, наблюдаемая как у штаммов дикого типа, так и у мутантных штаммов, секретирует везикулы с аналогичным распределением размеров, что указывает на одинаковое количество PL во внутреннем листке мембраны везикул [112]. Таким образом, гены транспортеров PL высококонсервативны. Гипервезикуляция мутантами проявляется у множества грамотрицательных бактерий, таких как Haemophilus influenzae , Vibrio cholerae и Escherichia co li [111, 117].Эта модель была бы идеальной в качестве механизма секреции OMV грамотрицательными бактериями, однако не полностью объясняет, почему OMV содержит ДНК внутри бактериальной внутренней мембраны. Следовательно, необходимы дополнительные исследования для объяснения механизма биогенеза OMV [112].
Другое исследование с участием Escherichia coli при воздействии повреждающих стрессоров привело к активации стрессовых реакций, которые разделены и управляются специализированными системами. Активность шаперона и протеазы E.coli DH5 α мутант (MK11F26 degP :: Tn5 без DegP), представленный повышенными температурами, повреждается, и, следовательно, неправильно свернутые белки образуются и удаляются через OMV. Этот мутант демонстрирует сильный фенотип гипервезикуляции по сравнению со штаммом, дополненным плазмидой degP (pCS20), который показал более чем 100-кратное снижение образования OMV [114].
Ни одна из упомянутых моделей убедительно не объясняет, как ДНК присутствует в OMV. Другой путь нового механизма образования доказывает ферментативное действие эндолизинов [111].Бактерия P. aeruginosa , попавшая в стрессовое состояние, имеет поврежденную ДНК. Таким образом, экспрессия эндолизина индуцируется и запускает деградацию пептидогликанового слоя [53, 111]. Следовательно, клетки взрываются (явление, называемое взрывным лизисом клеток), а оставшиеся фрагменты мембраны собираются и самособираются в OMV, названные EOMVs [111]. Эти сформированные везикулы также несут эндолизины и затем могут лизировать другие клетки, которые, в свою очередь, генерируют больше везикул [68, 111, 121]. Хотя этот путь требует гибели небольшой субпопуляции клеток, он приносит пользу выжившей популяции.Например, некоторые антибиотики вызывают реакцию SOS, лизис клеток и образование пузырьков у лизогенных бактерий. Оставшаяся бактериальная популяция становится защищенной OMV и может нейтрализовать факторы окружающей среды, которые нацелены на внешнюю мембрану, включая фаги, антибиотики и эукариотического хозяина, от факторов защиты [3, 111, 119].
В C. violaceum система CviI / CviR QS регулирует скорость высвобождения OMV, активируя как биосинтез виолацеина, так и систему VacJ / Yrb в стационарной фазе, два пути биогенеза OMV с обратной ролью в везикуляции.Наши данные указывают на то, что мутация или подавление генов vacJ / yrb вызывала гипервезикуляцию, чтобы поддержать появляющееся представление о том, что бактерии контролируют скорость высвобождения OMV, регулируя путь VacJ / Yrb (Roier et al., 2016). В недавних сообщениях было обнаружено, что несколько входных сигналов, таких как ограничение железа, соли желчных кислот и проникновение в хозяин, вызывают подавление генов vacJ / yrb , что приводит к увеличению высвобождения OMV, которые модулируют адаптацию бактерий к условиям хозяина.Поэтому будущие работы, посвященные роли OMV в вирулентности C. violaceum , будут представлять особый интерес [122].
Vibrio cholerae показал другой механизм образования OMV. Он собирает жгутики, окруженные оболочкой, образованной из внешней мембраны. Мембранные пузырьки, несущие LPS, проходят вдоль покрытых оболочкой жгутиков, которые высвобождаются при вращении жгутиков [22, 87, 116]. Подвижность жгутиков является важным признаком вирулентности, предполагающим, что феномен опосредованного жгутиками высвобождения LPS через OMVs может быть широко распространен среди бактерий [112].
McBroom et al. 2006 [74] предположил, что существует множество генов, ответственных за избыточное производство OMV, связанных с синтезом пептидогликана, белков OM (OMPs) и сигма-E стрессового ответа. Биогенез OMV – это не только реакция на стресс, но и жизненно важный физиологический процесс, обнаруживаемый у всех грамотрицательных бактерий [6, 74]. «Инженер-конструктор» этих везикул с помощью геномной инженерии мог бы создать бактериальные «фабрики», которые позволят оптимизировать производство OMV, необходимое для разработки превосходного биотехнологического продукта.Используя те же стратегии, возможно, реконструировали структуры липида А для устранения токсичности, перепрограммировали белковый груз и украсили внутреннюю и внешнюю часть OMV специфическими комбинациями, такими как уникальные антигены, антитела, рецепторы, лиганды рецепторов и / или ферменты [6, 16, 123].
7. OMV и применение вакцины
Сегодня разработка вакцин является наиболее активной областью исследований в биомедицинских науках [124]. Профилактическая вакцинация позволила искоренить оспу, чуму крупного рогатого скота и полиомиелит [125–128].Для предотвращения появления новых инфекционных заболеваний требуется постоянная разработка вакцин [129]. Несмотря на то, что вакцинация спасла множество жизней, предотвратив инфекции, болезни остаются основным источником смертности во всем мире [129]. Есть много причин для растущего спроса на разработку новых вакцин. Во-первых, при инфекционных заболеваниях проявляются антигенные изменения, снижающие эффективность вакцин; во-вторых, устойчивость бактерий к противомикробным препаратам; и, в-третьих, введение вакцин, специфичных для одной серогруппы, от конкретного заболевания вызывает появление другой серогруппы [56, 129].
Платформы вакцин могут обеспечить повышенную безопасность, производительность и простоту для получения наиболее подходящего продукта [90, 129]. Платформа нацелена на продвижение высоких и устойчивых иммунных антител хозяина к специфическим антигенам, стандартный врожденный ответ, защиту от различных заболеваний, вызванных проявлением различных антигенов, и значительное сокращение времени выхода на рынок [47, 90, 129]. Бактериальные везикулы наружной мембраны, несущие антигены, являются важным кандидатом в качестве платформы для вакцины.Более того, применение биоинженерных технологий в гетерологичных антигенах в везикулах позволит вызвать высокий иммунный ответ [47, 129]. Подводя итог, можно сказать, что стимулирование врожденного иммунитета и стимулирование адаптивных иммунных ответов, связанных с OMV, характеризуется тремя ключевыми характеристиками [125]. Во-первых, они несут поверхностно-ассоциированные антигены. Во-вторых, они быстро фагоцитируют антигенпрезентирующие клетки и несут множество патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) [125].
Bielig et al.предположили, что регуляция содержания пептидогликана в OMV используется бактериями для уклонения от иммунного обнаружения у хозяина, опосредованного Nod-подобными рецепторами (NLR-). Зондирование кворума играет важную роль в этом процессе у V. cholerae , но, вероятно, оно используется и другими бактериями. OMV доставляют факторы бактериальной вирулентности, и недавние исследования показали, что OMV также имеют решающее значение для доставки как связанных с мембранами, так и растворимых люминальных (т.е. периплазматических) патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) в клетку-хозяина, в результате происходит активация мембраны -ассоциированные и внутриклеточные рецепторы распознавания образов (PRR).Понимая, как бактерии контролируют PAMP, состав OMV даст нам инструменты для управления производством OMV и оптимизации его иммуногенных свойств. Это, вероятно, поможет активизировать использование OMV в качестве будущих кандидатов на вакцины [130]. Эти данные предоставляют доказательства физиологической значимости бактериальных MV в передаче сигналов между клетками и оправдывают будущие работы по лучшему пониманию регуляции прокариотической социальной активности.
OMV находятся на стыке традиционных и новых методов производства вакцин и представляют реальную возможность для борьбы с различными инфекционными заболеваниями, такими как нозокомиальные инфекции, кишечные заболевания, туберкулез, менингит и коклюш, которые остаются проблемой для здоровья детей и подростков. взрослые [36].Везикулы обладают преимуществами в качестве кандидата на вакцину, поскольку они нерепликативные частицы и не могут вызывать заболевание, действуют как самодостаточные, небольшой размер и форма частиц способствуют распространению по всему телу, обладают высокой стабильностью при различных температурах, вызывают реакции долговременной памяти и индуцируют как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ против OMV-представленных антигенов [56, 125, 131–135].
В настоящее время лицензированные вакцины на основе OMV используют экстракцию детергента для снижения уровня липополисахарида (LPS), который очень токсичен [36, 129].VA-MENGOC-BC®, MenBVac®, MeNZB® и Bexsero® являются примерами лицензированных OMV вакцин, полученных с использованием экстракции дезоксихолатного детергента из бактериальных мембран [36, 136, 137].
Таким образом, OMV могут предотвратить бактериальные инфекции. Исследования с OMV из E. coli имели высокий защитный эффект. Это было эффективно предотвращено от бактериальной летальности и индуцированного синдрома системного воспалительного ответа посредством ответов клеток Th2 и Th27 [47, 84, 138]. OMV Campylobacter jejuni являются альтернативой доставке белков в клетки-хозяева, которые придают цитотоксическую активность и индуцируют иммунный ответ хозяина в эпителиальных клетках кишечника [47, 139]. Pseudomonas aeruginosa везикулы внешней мембраны активируют значительный провоспалительный ответ IL-8 в эпителиальных клетках легких и индуцируют легочное воспаление за счет увеличения количества хемокинов и цитокинов в легких мыши и альвеолярных макрофагах мыши на модели грызунов [47, 76]. Воспалительные реакции, вызванные OMV, по сравнению с живыми бактериями, показали, что OMV обладают аналогичной способностью вызывать врожденный иммунитет [47, 140]. У мышей, иммунизированных OMV Salmonella , развились устойчивые В- и Т-клеточные ответы, кроме того, они стимулировали продукцию IFN-g большой долей CD4_T-клеток у мышей, ранее инфицированных этими бактериями [141].OMV, происходящие из Bordetella pertussis, , защищены от заражения коклюшем на мышиной модели. Эффект был сопоставим с цельноклеточным составом вакцин (эталонный штамм ВОЗ). В клинических исследованиях многокомпонентная вакцина Men B (4CMenB), содержащая три широко консервативных поверхностно-экспрессируемых рекомбинантных антигена и специфический OMV, обеспечивала широкую защиту от циркулирующих гетерологичных штаммов MenB. Этот состав оказался иммуногенным для взрослых, подростков и младенцев, а также для наиболее восприимчивых возрастных групп [47, 142].OMV, происходящие из Klebsiella pneumoniae , представляют собой важные секреторные нанокомплексы, которые вызывают мощный воспалительный ответ [47, 143]. Мыши, иммунизированные везикулами V ibrio cholera , выделенными от кишечных патогенов (детергент или свободный детергент), показали иммуногенные и защитные результаты [144, 145]. OMV, полученные с помощью штаммов E. coli , как энтеропатогенных (EPEC), так и энтеротоксигенных (ETEC) штаммов, показали высокую специфичность антител и гетерологичную перекрестную реактивность среди них [36].Везикулы, полученные из непатогенных микобактерий Mycobacterium smegmatis , которые имеют высокий уровень геномной и антигенной гомологии с микобактериями Mycobacterium tuberculosis (MTB), индуцировали перекрестные иммунные ответы против антигенов MTB на клеточном и гуморальном уровнях у мышей [146].
OMV имеют множество применений, и для повышения их производительности необходимы инженерные модификации [124]. Биоинженерия OMV позволяет модифицировать различные виды бактерий, которые естественным образом проявляют множество биологических эффектов и специфичности нацеливания, чтобы производить везикулы со специфическими характеристиками, используя относительно простые молекулярные методы [48, 56].Генетическая манипуляция позволяет упаковывать рекомбинантные эпитопы, включая сигнальные молекулы для клеточно-специфического нацеливания, исключая нежелательные сигналы, модифицируя токсические компоненты, генно конструируя везикулирующий штамм [48, 56, 90, 124, 147]. Применение генной инженерии, путей и генома позволит гипервезикуляции OMV создать бактериальные «фабрики», необходимые для реалистичного биологического применения [16, 56, 124].
Антигены, белки, специфические лиганды и антитела могут отображаться либо внутри OMV, либо на поверхности, обогащенной специфическими лигандами, такими как антитела и антигены [48, 124, 129].Расположение (дизайн) молекул важно для провоцирования желаемого иммунного ответа. Эти гетерологичные антигены могут быть представлены с поверхностным воздействием или без него, продуцированы бактериями (эндогенные антигены) и объединены на более поздней стадии продуцирования (экзогенные антигены) [129] (Рисунок 4). Иммунная система модулируется в соответствии с дизайном OMV, активируя гуморальный и / или клеточный ответ [37, 129]. Первый дизайн – это эндогенная загрузка открытых поверхностных антигенов на основе экспрессии белков на внешней мембране, однако многие исследования показали низкий выход или подходят только для небольших белков или их частей [129, 148].Kim et al. [149] сконструировали белок, слитый с несколькими гетерологичными белками, в том числе GFP с глициновым линкером из пяти остатков на С-конце порообразующего цитотоксина ClyA, которые эффективно транспортируются через внутреннюю мембрану к внешней мембране E. coli . [149]. Эндогенная загрузка антигенов в просвет OMV – это второй подход, и существуют разные методы. McBroom и Kuehn [114] продемонстрировали, что возможно обогащать специфические белки в просвете OMV, добавляя неправильно свернутую последовательность белка внешней мембраны к периплазматическому цитохрому b562 [114].Кести и Куэн [150] разработали биоинженерные антигены, нацеленные на просвет везикул, они слились с сигнальной последовательностью твин-аргинина (Tat) с образованием OMV E. coli с GFP в их просвете, и этот путь переносил свернутые белки по цитоплазматическому каналу. мембрана. Белок GFP в просвете везикул был стабильным, следовательно, защищенным от действия протеиназ [150].
Другой метод экспрессии люминального белка оказался успешным. Бартолини и др. (2013) и Fantappie et al.(2014) слили белки на периплазматической стороне с белком внешней мембраны (OmpA), чтобы получить сигналы секреции или периплазматические белки. Усечения или делеции OmpA приводили к фенотипу блеббинга, который был выведен из его дифференциальной иммунопреципитации и устойчивости к протеолитической деградации [60, 129, 151, 152]. Экзогенная загрузка поверхностно-экспонированных антигенов является третьим методом, антигены вводятся после массового производства OMV [129]. Alves (2015) загрузил фосфотриэстеразу (PTE), слитую с OmpA, через систему биоконъюгации SpyCatcher / SpyTag (SC / ST) [153].OmpA представляет собой высокоэкспрессируемый белок порина, присутствующий на внешней мембране бактерий и последующих OMV. PTE разрушает органофосфаты, делая их менее токсичными. Воздействие этой молекулы чаще всего вызывает судороги и смерть в результате удушья [153].
Экзогенная загрузка антигенов в просвет OMV – еще один подход к загрузке антигена после массового производства OMV. Пузырьки открываются и закрываются без непоправимого повреждения. Существуют исследования загрузки более мелких молекул во внеклеточные везикулы (EV), пассивной или активной загрузки, с использованием электропорации, обработки сапонином, экструзии или диализа [154].Гуджрати и др. (2014) инкапсулировали siRNA в OMV E. coli нацелены на белок веретена кинезина, который активируется во время опухолевых и быстрорастущих клеток [104].
Как мы подтвердили, биоинженерия может разработать OMV для прямого использования в качестве вакцины, поскольку она может вызывать отличные как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы [129]. Кроме того, подходящая конструкция везикул может снизить токсичность ЛПС, которая вызывает серьезные побочные эффекты в традиционных вакцинах, детоксифицируя эту молекулу [16, 38, 90, 112, 124, 129].Недавно Watkins et al. (2017) показали рекомбинантный штамм E. coli , сконструированный только с липидной частью LPS IVa вместо полного LPS. Этот рекомбинантный OMV (rOMV) показал ослабленную пирогенность и высокий уровень иммуногенности, кроме того, способствует сбалансированному гуморальному ответу Th2 / Th3 [155]. Другой способ снизить токсичность – экспрессия гетерологичных гликановых антигенов вместо антигенных белков [124, 129]. Рекомбинантный полисахарид, конъюгированный с везикулами внешней мембраны, приводит к везикулам внешней мембраны, сконструированным с использованием гликоля (geOMV), которые могут эффективно доставлять патоген-миметические гликотопы в иммунную систему [129, 153].
Комбинации различных OMV и их способность сочетаться с антигенами могут в будущем оказать существенное влияние на разработку вакцин против патогенов [36]. Таким образом, при конструировании мутантных штаммов со сверхэкспрессируемыми белковыми вакцинными антигенами, естественным образом вставленными в везикулы, большое количество вакцин-кандидатов с этими характеристиками улучшит выход, иммуногенность и профиль безопасности продуцируемых OMV через несколько лет [36, 156].
8.Выводы и направления на будущее
Постоянное употребление антибиотиков спровоцировало появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). B-лактамаза с расширенным спектром действия (БЛРС) и грамотрицательные бактерии, продуцирующие карбапенемазу, стали актуальной терапевтической проблемой. Возрождение классических бактериальных заболеваний и появление новых бактериальных и вирусных заболеваний происходит из-за неэффективности антибиотиков. Enterococcus faecium , S.aureus , K. pneumoniae , A. baumannii , P. aeruginosa и E. coli (возбудители ESKAPE) – шесть нозокомиально-резистентных бактерий, которые серьезно угрожают жизни пациентов [43]. Исследование и применение OMV в качестве платформы для вакцины включает оптимизацию соответствующих врожденных и адаптивных иммунных ответов путем удаления или вставки определенных компонентов, которые будут оцениваться индивидуально для каждого случая заболевания [38].
OMV выполняют разнообразные функции и имеют основополагающее значение для выживания грамотрицательных бактерий, которые выполняют многогранную функцию, влияющую на бактериальную экологию. Следовательно, зная экологическую роль, биогенез, генетические основы и точный путь стимуляции OMV, мы можем повысить урожайность и получить лучший продукт для борьбы с бактериальными патогенами. OMV с высоким выходом для приготовления вакцин являются предпосылкой для разработки хороших вакцин на основе OMV. Количество продуцируемых OMV является ответом на условия роста, факторы стресса и фазы роста бактериальных культур.Есть много генов, участвующих в увеличении или уменьшении продукции OMV. Pseudomonas естественным образом продуцирует более высокий выход OMV, чем другие бактерии, поэтому экспрессия представляющих интерес антигенных белков у видов с более высоким выходом OMV может быть выгодной [6].
Существуют широкие направления исследований, связанные с разработкой вакцин OMV, и одно из них – системы QS. Есть многообещающие цели для разработки новых противоинфекционных соединений, основанных на регулирующей функции этих систем в патогенезе бактерий, чтобы контролировать распространение устойчивых к антибиотикам [157].QS-контролируемая экспрессия генов вирулентности в E. coli опосредуется сигнальными молекулами, такими как индол, ацилгомосериновые лактоны (AI-1), диэфир фуранозила (AI-2) и ароматические соединения, такие как AI-3, адреналин и норадреналин, которые контролируют систему секреции типа III, которая является детерминантой вирулентности, необходимой для образования характерных прикрепляющихся и сглаживающих (A / E) повреждений [158].
OMV оказались гибкой платформой для производства вакцин и очень сложными структурами, которые содержат иммуностимуляторы (например,g., LPS, белки и ДНК) и антигенные молекулы, доставляемые к иммунокомпетентным клеткам иммунной системы [36, 124, 159]. Следовательно, OMV обладает внутренним адъювантным эффектом, воздействующим на не только бактериальные антигены, но и на гетерологичные антигены, которые могут быть включены или объединены в один состав, иммуностимулирующие свойства везикулы могут быть изменены, а токсичность может быть снижена [36, 112, 124, 159]. Более того, универсальность, позволяющая вводить через слизистую оболочку или парентерально, предлагает значительный выбор.Адъювантный потенциал и возросшие знания в области дизайна OMV за последние несколько десятилетий также позволят в будущем разработать новое поколение новых вакцинных составов [36, 124, 159].
Прогресс в производстве этих везикул отличный, но контролировать везикуляцию непросто, поскольку во время процесса ферментации между партиями существует много различий. Следовательно, биоинженерия имеет фундаментальное значение для получения более сложных OMV, устраняющих такие проблемы, как токсичность LPS, крупномасштабное производство, биологическая инженерия, загрузка гетерологичных белков, повышение безопасности и снижение затрат [16, 90].
Доступность высокой пропускной способности, такой как протеомная геномика, липидомические технологии, автоматизация микробиологических методов и поддержка биоинформатики, делает исследование более практичным, чтобы помочь в подготовке инженерных OMV [6]. Использование биотехнологии для создания OMV в качестве носителей вакцинных препаратов является наиболее многообещающим инструментом для разработки новых вакцин [160]. Более того, с генетическими модификациями OMV способны выполнять множество функций, неся молекулы [90]. OMV – это бионаночастица, обладающая множеством возможностей, и ее можно применять во многих областях, таких как иммунология, диагностика, клиническая медицина и другие [90].Благодаря непрерывным исследованиям нанотехнологий на основе OMV станет возможным разработать мощный иммунобиологический инструмент.