Pir плита pirro отзывы: Pir плита pirro отзывы

Содержание

Pir плита pirro отзывы

Утепление балкона logicpir

Мой потоп в ванной настроил меня на ремонтное настроение. Пока бригада работала над санузлом, решил я и балкон в божеский вид привести. Померили, посчитали – не дорого и обещали справиться за 3-5 дней.

Разбирать было нечего – балкон пустой. Прораб советовал не заморачиваться с минватой, пенопластом или пеноплексом, а утепляться пиром. LOGICPIR Балкон 5 см, но что-то решили перестраховаться и по периметру в 10 см заделать. Первый слой делали на монтажную пену + дюбелями закрепили и второй слой также сделали. LOGICPIR легкий + с замками сразу – никаких проблем с крепежом. На полу постелили теплый пол по пиру. Он не горит (проверял на газовой плите – точно не горит и даже толком-то не воняет. Был какой-то запах, но я не понял даже, что это было. Через минут 5 обуглился, а в разрезе все равно белым остался).

Пол застелили ламинатной сантиметровой доской, стены зашили пластиковыми панелями. В итоге всю работу сделали за день (растянули на 2, так как я с панелями и паркетной доской определялся.

Теперь на балконе и без теплого пола не холодно, можно даже в майке постоять спокойно какое-то время. Градусов 13-15 держит по ощущениям, надо градусник повесить. А с теплым полом нагревается за 10 минут, за 30 минут – Африка. Когда выключаю – тепло очень долго держится. По часам не засекал.

Думаю снести перегородку с балконом и кухню так расширить, а из подоконника отличная барка получится. Так что LOGICPIR тепло держит, укладывается за час-полтора на весь балкон. Брал за 270 руб/квадрат. Подробнее о LogicPir.

именно поэтому у PIRа
группа горючести Г3
а токсичность Т3 – максимальная.
для тех кому интересно – може сравнить химический состав газов от горящего PIRa и химического оружия! )))

Мин вата – если камень то НЕГОРЮЧАЯ! если СТЕКЛО – то слабогорючая. Они Вообще нетоксичные))) ¶

Зачем тогда вообще лоджию утеплять, если она неотапливаемая.

минвата в 2-3 раза дешевле Экструдированного полистирола и в 5 раз дешеле PIRа ¶

Я бред не ношу))))
Деньги предпочитаю и правду)))

"теплоизоляция 0,035 у 45 мм полистирола против 0.029 у ППУ 35 мм – вот и прикиньте на 100 мм сколько будет разница "

простите – а что такое ТЕПЛОИЗОЛЯЦИЯ 0,035 у 45мм и 0,029 у 35мм . ¶

А теперь по пунктам
1 – Есть термическое сопротивление конструкции – оно R и зависит напрямую от толщины!
2 – Есть показатель ТЕПЛОПРОВОДНОСТИ лямбда – он бывает нескольких видов в зависимости от влажности материала и температуры окружаего воздуха. – вынаверное его имели ввиду, да попутали.
3 – показатель ТЕПЛОПРОВОДНОСТИ не зависит от ТОЛЩИНЫ материала
4 – Суть это меняет координально, так как на равных толщинах разница теплопроводности и термического сопротивления в % будет ОДИНАКОВОЙ. математика школьный курс – пропроции.
5 – есть ещё коэффициент неоднородности, так вот у листовых продуктов он равен 1. так как листы ровные. А вот для вашего ППУ нужно брать 0,63. (Для вас объясню – увеличивать на 58,7%) так как ППУ наноситься ручным образом из пистолета или по простому "КАК БЫК НАССАЛ" ))) и толщина его неодинаковая.

6 – в итоге чтобы обеспечить нормальный климат этого ппу нужно БОЛЬШЕ )))

7 – ах да. Гигиенический сертификат на применение в больницах и дет садах есть?

наверное нет. Жаль
8 – Техническое свидетельство выданное ФЦС. тоже нет.
9 – может хоть Объекты кроме коровников нормальные есть? ¶

в самарской области есть разрешение из ППУ строить
уж не знаю почему
возможно лобби продавцов ваты не прокатило 🙂

откуда не однородность толщины то? делают чуть больше и фрезой снимается излишек
кстати по ппу – вообще загадка – значит пенить можно двери
более того – есть пена не горючая – противопожарная – это камешек в ваш огород – не слышали о такой? ¶

Негорючая и противопожарная – это разные понятия и означают разное.
материал может быть негорючим, не не быть противопожарным.
И наоборот.

Фрезой или струной – это пофиг – клиент то готовое издение получает.

То что есть разрешение в 1 субъете, еще не говорит о массовом применении. И наоборот. В МСК и МО заперещен ПСБС ¶

Приступим к отжигу!

2. Напомню основные преимущества плит из пенополиизоцианурата: самый низкий коэффициент теплопроводности, не горят (группа горючести Г1 – не поддерживают горение), не впитывают влагу, обладают достаточно высокой прочностью на сжатие. Наиболее близок по характеристикам экструдированный пенополистирол (ЭППС/ XPS – на фото по центру), но у него есть один и очень серьезный недостаток: класс горючести Г4, сгорает моментально, при этом выделяя очень ядовитые вещества.

3. Попробуем запечь 100 мм PIR-плиту на «гриле». Для этого будем использовать пропан-бутановую горелку, температура пламени которой может достигать 2000 градусов по Цельсию. При этом стоит отметить, что PIR-плита может долговременно эксплуатироваться при температуре 120-130 градусов по Цельсию без каких-либо повреждений.

4. При воздействии открытого огня высокой температуры поверхность обугливается и образуется углеродная корка, которая препятствует дальнейшему проникновению огня внутрь.

5. Снимаем верхний слой и видим абсолютно неповрежденную внутреннюю часть PIR-плиты. То есть, плита не только не поддерживает горение, но и после обгорания представляет собой защитный слой, препятствующий дальнейшему распространению огня.

6. А теперь возьмем обычный экструдированный пенополистирол, массово распространенный в настоящее время. Во-первых, он моментально загорается.

7. Во-вторых, он продолжает гореть самостоятельно, хотя источник пламени я уже давно убрал (см. видео в конце статьи). Ну и самое плохое — это черный ядовитый дым, который в замкнутом пространстве приведет практически к моментальной смерти. Это накладывает очень серьезные ограничения по его применению. В частности я твердо уверен, что ЭППС/ XPS должен применяться только в тех местах, где он будет надежно защищен несгораемым покрытием, толщиной хотя бы 15-20 мм. То есть фактически только в утепленных плитных фундаментах и, в крайнем случае, для утепления стен снаружи с дополнительным оштукатуриванием.

8. Несколько образцов PIR-плит с различными обкладками. По порядку:
1. Плита с двусторонней облицовкой из рифленой алюминиевой фольги, применяемой в системе для утепления кровли, стен, парной бань и саун, а также для создания утепленных воздуховодов.
2. Классическая плита с покрытием из алюмоламината (многослойная алюминиевая фольга) с разметкой для резки.

3. Плита с облицовкой из крафт-бумаги.
4. Плита со специальным огнезащитным углеродным покрытием

9. Начнём с самого интересного — специальное огнезащитное покрытие. При воздействии огня вздувается, тем самым защищая основание от высокой температуры. Посмотрите на видео как происходит этот процесс.

10. Образовавшаяся корка легко счищается, а под ней можно увидеть неповрежденное основание.

11. Это самая простая облицовка — крафт-бумага, используемая для внутренних работ. Как я уже рассказывал в репортаже с производства, технология выпуска плит такова, что они сразу формируются требуемой толщины, а обкладка является ограничителем по толщине. И даже облицовка из крафт-бумаги имеет отличную адгезию, в отличие от гладкой поверхности пенополистирольных плит.

12. Также есть PIR-плиты с обкладками из стеклохолста — это идеальный вариант для дальнейшего оштукатуривания или шпатлевания поверхности. Причем мне пришлось приложить достаточно усилий, чтобы оторвать этот кусок стеклохолста для красивого кадра.

13. Еще один вариант облицовочного покрытия: стеклохолст с битумной пропиткой, допускающий кратковременное воздействие огня. Поверх такой плиты можно наносить наплавляемую гидроизоляцию! Идеально для кровли, можно использовать PIR-плиты вместо выравнивающей стяжки в плоских кровлях и сразу же наплавлять гидроизоляцию.

14. PIR-плиты легко разрезаются канцелярским ножом, а разметка с шагом 10 см на верхней обкладке еще больше упрощает монтажные работы.

15. Плиты с алюминиевой фольгой самые прочные, используются в сертифицированной системе «ПИР-кровля эксперт», а также для изготовления воздуховодов. Здесь на фотографии хорошо видна структура материала. Отличные теплоизоляционные свойства утеплителя обеспечивают закрытые поры, заполненные газовой смесью с низкой теплопроводностью.

16. В прошлом году я рассказывал о том, как сделать автомобильный холодильник своими руками на элементах Пельтье и использовал в качестве примера пенополистирольные плиты, склеенные на монтажную пену. При интенсивной эксплуатации без дополнительного покрытия пенополистирол замялся и раскрошился по углам, да и адгезия монтажной пены к пенополистиролу недостаточно высока, как кажется на первый взгляд. А вот PIR-плиты с алюминиевой фольгой просто идеально подходят для того, чтобы сделать самодельный холодильник в автомобиль. Сначала я попытался срезать углы по диагонали, как это делает станок на производстве (см. репортаж с производства), но у меня ничего не получилось, поэтому я делал разрезы под прямым углом, оставляя нетронутой внешнюю облицовку из фольги.

Затем сложил в куб и проклеил все швы алюминиевым скотчем. Стыки вклеил резиновым клеем и промазал герметиком. Прочность конструкции такова, что его можно использовать как табуретку.

17. Техническая начинка осталась без изменений — 50 Вт элемент Пельтье зажатый между двумя компьютерными кулерами с радиаторами. В качестве разделителя используется кусочек утепленного оконного откоса.

18.

Автомобильный холодильник готов к эксплуатации. Алюминий надежно защищает его от повреждений, отражает тепло снаружи. Стоит обратить внимание и на толщину стенок — у PIR-плит самый низкий коэффициент теплопроводности из существующих утеплителей: 0,023. Примерно можно ориентироваться, что 30 мм PIR-плита по теплопроводности эквивалентна 50 мм ЭППС/XPS.

19. Про нулевое водопоглощение, думаю, говорить нет необходимости: материал не впитывает влагу в принципе, а если же вас беспокоит вопрос паропроницаемости, то я уже неоднократно об этом писал — в любом доме должна быть полноценная вентиляция, через стены/кровлю дом не должен «дышать». Важный же момент заключается в экологической чистоте материала, что позволяет использовать его в жилых помещениях без каких-либо дополнительных изоляционных работ.

20. Давайте еще разок попробуем побаловаться с огнем. На этот раз я взял тонкую 20 мм PIR-плиту с двусторонним покрытием из многослойного алюминия.

21. Обкладка из верхнего слоя сгорает моментально, но пламя не увеличивается.

22. Убрали источник огня — все потухло. Это очень важный момент, т.к. если сравнивать с ЭППС/XPS, который при сгорании полностью прогорает, в ограждающей конструкции появляется пустота, способствующая увеличению тяги и притока свежего воздуха, что лишь ускоряет распространение огня. С PIR такой сценарий в принципе невозможен.

23. Снимаем углеродную корку, а под ней неповрежденный материал. Напомню, здесь плита имеет толщину всего 20 мм, пока прогорело не более 5-7 мм.

24. Продолжаем сжигать. Пламя есть только первые секунды, пока обгорает верхний слой разрушенных ячеек пенополиизоцианурата, после этого горение моментально прекращается.

Вероятно, на фотографиях это выглядит не так впечатляюще, поэтому я сделал небольшие видеоролики, где показал несколько циклов сжигания PIR-плит с различными обкладками.

Испытания показали, что PIR-плиты это самый высокотехнологичный теплоизоляционный материал на сегодняшний день. Еще один интересный момент касается долговечности. Как я уже писал ранее, в Европе и США этот утеплитель применяется достаточно давно и имеет подтвержденную долговечность. В Европе вскрыли кровлю, утепленную PIR-плитами 28 лет назад, и материал не изменил свои физико-механические свойства, а лишь немного потемнел.

LOGICPIR Баня L-1190х590х30 (8 плит, 5,62 кв.м) (PIR плиты)

LOGICPIR Баня L-1190х590х30 (8 плит, 5,62 кв.м)

Обладая теплосберегающими свойствами и фольгированной обкладкой, LOGICPIR Баня не только отражает тепло, но и не пропускает пар. Благодаря этому баня быстро нагревается и на долго сохраняет необходимый температурный режим. LOGICPIR Баня абсолютно безвреден для здоровья человека на протяжении всего срока службы, который составляет более 50 лет.

Обладая теплосберегающими свойствами и фольгированной обкладкой, LOGICPIR Баня не только отражает тепло, но и не пропускает пар. Благодаря этому баня быстро нагревается и на долго сохраняет необходимый температурный режим. LOGICPIR Баня абсолютно безвреден для здоровья человека на протяжении всего срока службы, который составляет более 50 лет.

Читать все Скрыть
Страна происхождения
Россия
Теплопроводность при (25±5)˚С, не более, Вт/м·K
0,022
Водопоглощение по объему, % не более
1
Температурный режим использования
от -65°С до +120°С
Горючесть, степень
Г4
Размер
1190х590х30 мм
Толщина плиты, мм.
30
Прочность на сжатие при 10% линейной деформации не менее, кПА
120
Форма кромки
L-кромка
Все характеристики
  • Доставка

    Быстрая доставка по России

  • Безопасность платежа

    технология 3D Secure для карт VISA и Mastercard Secure Code

  • Гарантия качества

    прямая покупка от производителя

Facebook

Одноклассники

Вконтакте

  • Показатель
  • Значение
  • Бренд
  • ТЕХНОНИКОЛЬ
  • Материал
  • Жесткий пенополиуретан
  • Страна происхождения
  • Россия
  • Теплопроводность при (25±5)˚С, не более, Вт/м·K
  • 0,022
  • Водопоглощение по объему, % не более
  • 1
  • Температурный режим использования
  • от -65°С до +120°С
  • Горючесть, степень
  • Г4
  • Размер
  • 1190х590х30 мм
  • Толщина плиты, мм.
  • 30
  • Прочность на сжатие при 10% линейной деформации не менее, кПА
  • 120
  • Форма кромки
  • L-кромка
  • Водопоглощение по объему при полном длительном погружении (28 сут.), % не более
  • 1

Теплоизоляционные плиты LOGICPIR Баня предназначены для утепления помещений с повышенной влажностью, применяется при строительстве бань и саун.

LOGICPIR Баня L-1190х590х30 (8 плит, 5,62 кв.

м)

Отзывы пользователей 1 item(s)

5
100

я работал с этим материалом впервые! я утеплял только зону парилки, остальную баню утеплял каменной ватой, но потом пожалел если честно.
с пир работать в 1000 раз удобнее и по времени я не возился весь день.
Эксплуатация месяц - полет нормальный, особенно порадовала что нет барабана как обычной фольги когда хлопаешь дверью в бане. упаковки пленка пачка руки когда рвется подходит для парилки и нет эффекта барабана когда закрываешь двери
string(1) "5"
Отзыв пользователя Анонимный пользователь / (Отзыв написан 28. 05.2021)

Отзывы пользователей 1 item(s)

5
100

я работал с этим материалом впервые! я утеплял только зону парилки, остальную баню утеплял каменной ватой, но потом пожалел если честно.
с пир работать в 1000 раз удобнее и по времени я не возился весь день.
Эксплуатация месяц - полет нормальный, особенно порадовала что нет барабана как обычной фольги когда хлопаешь дверью в бане. упаковки пленка пачка руки когда рвется подходит для парилки и нет эффекта барабана когда закрываешь двери
string(1) "5"
Отзыв пользователя Анонимный пользователь / (Отзыв написан 28. 05.2021)

Теплоизоляционные PIR-плиты PirroGroup | Характеристики и цена

Компания PirroGroup предлагает современные решения для теплоизоляции жилых, коммерческих и производственных объектов. Утеплитель PIR – инновационный для России теплоизоляционный материал, основой которого является пенополиизоцианурат – полимер с закрыто-ячеистой структурой.

Утепление PIR-плитами имеет ряд преимуществ перед традиционными видами теплоизоляции. Основные из них – рекордно низкие теплопроводность и влагопроницаемость; помимо этого, утеплитель PIR обладает высокой огнестойкостью и безопасен с экологической точки зрения. Играют роль также удобство транспортировки и простота монтажа панелей, возможность создать единый теплоизоляционный контур без мостиков холода и сэкономить полезную площадь помещений благодаря небольшой толщине плиты PIR.


Использовать именно PIR-утеплитель, характеристики которого обеспечивают ему повышенную долговечность, не только эффективно, но и в конечном счете выгодно. Срок службы этого материала составляет от 50 лет, при этом PIR-плита не меняет своих физико-технических свойств – благодаря этому расходы на утепление PIR-панелями стабильно окупаются.

Выбирать конкретную разновидность PIR-плит PIRRO следует исходя из специфики стоящей задачи – проконсультируйтесь по этому поводу со специалистами компании. Важный момент, на который стоит обратить внимание, подбирая утеплитель PIR – цена и свойства материала зависят от обкладки полиизоцианурата, будь то крафтовая бумага, фольга или стеклохолст, а также от толщины плиты.

Теплоизоляционную PIR-плиту PIRRO в ассортименте можно заказать непосредственно на заводе в Саратове по ценам производителя либо, если это удобнее и выгоднее с точки зрения логистики, приобрести утеплитель PIR у дилеров компании PirroGroup в регионах РФ и странах СНГ.

PirroGroup с 2014 года производит теплоизоляционные PIR-плиты - самый эффективный утеплитель в России. Компания - член технического комитета по стандартизации "Строительные материалы и изделия" (ТК 144), активно принимает участие в разработке и актуализации национальных отраслевых стандартов. Ассоциация производителей панелей и теплоизоляционных плит из ППУ (PUR, PIR) НАППАН регулярно подключает экспертов PirroGroup для обсуждения вопросов и решения ключевых задач отрасли.

Теплоизоляционные PIR плиты от PirroGroup

Согласно исследованиям проведенным производителями плиты PIR, через ограждающие конструкции зданий теряется около половины всей тепловой энергии. Поэтому утепление стен, потолка, пола является основным способом повышения энергоэффективности строений.

Вопрос, какой именно материал рациональнее всего использовать уже не стоит - PIR плиты.

Что такое плиты теплоизоляционные PIR

Термоизоляционные плиты из пенополиизоцианурата (Polyisocyanurate) Pir/Пир – инновационный утеплитель, выпускаемый компанией PirroGroup. Относится к термоактивным (реактопластным) полимерным утеплительным материалам, по сути это модифицированный пенополиуретан PUR.

Реактопласты получают в результате необратимых химических реакций. Внешне пенополиизоцианурат PIR сложно отличить от пенополиуретана PUR.

Основным параметром любого утеплителя является его теплопроводность. У термоизоляционных плит она предельно низкая, и составляет примерно 0,022 Вт/м•К.

Это означает, что при одинаковой толщине теплоизоляционные свойства PIR плиты превосходят показатели экструдированного полистирола, пенополиуретана, базальтового и всех известных на сегодняшний день утеплителей.

PIR плиты толщиной 50 мм обеспечивают такую же теплоизоляцию, как 330 мм дерева или 90 мм базальтовой термоизоляции.

Такая высокая теплоизоляционность объясняется наличием закрытых, заполненных инертным газом ячеек, обладающих «эффектом термоса». На их долю приходится 95% объема.

Дополнительный теплоизоляционный эффект панелей создается конструкцией кромок, выполненных в виде L-образного замка или шип паз у сэндвич-панелей.

Плотно прилегающие друг к другу стыки обеспечивают качественное герметичное соединение между плитами.

Жесткие каркасные материалы занимают в термоизоляционных плитах ПИР всего лишь 3%. Этого достаточно для обеспечения повышенной (более 120 кПа) прочности.

Такая конструкция позволяет плитам выдерживать нагрузку от любой стяжки – классической цементно-песчаной толщиной до 250 мм, сухой или сборной.

Это важное преимущество, позволяющее использовать теплоизолятор в различных строительно-ремонтных ситуациях.

Поверхности PIR плит LogicPiR и PIRRO покрыты алюминиевой фольгой. Помимо гидро- и паронепроницаемости фольга характеризуется низкими (менее 0,5 Вт/м2) излучающими свойствами, способствующими сохранению тепла.

Производитель утверждает, что при использовании термоизоляции из пенополиизоцианурата не требуется укладка дополнительного пароизоляционного слоя.

Достаточно оклеить стыки панелей скотчем из алюминия, и стопроцентная герметичность конструкции обеспечена.

Производители выпускают 6 марок теплоизоляционного материала, в их числе утеплительные панели, покрытые стеклохолстом и крафт-бумагой, ламинированной фольгой.

В последнее время компанией ИЗОБУД налажено производство сэндвич-панелей под брендом ISOPIR облицованных с двух сторон гладким или профилированным листом.

Термоизоляция PirroVentiDuct используется для изготовления воздуховодов, в системах воздушного отопления и кондиционирования помещений дома.

Специалисты компании ТехноНиколь изготавливающие термоизоляционные изделия под маркой LogicPiR утверждают, что покрытые алюминиевой фольгой PIR-панели, имеют огнестойкость Г1 (невозможность горения при отсутствии источника огня).

Плиты утепления PIRRO, покрытые стеклохолстом и крафт-бумагой, по огнестойкости относятся к классу Г2 (умеренно горючий, без источника огня может гореть не больше 30 секунд).

Применение PIR плит

✔ PIR плиты из пенополиизоцианурата применяются в жилых и общественных зданиях, производственных помещениях, на спортивных объектах для утепления любых ограждающих конструкций и пола в доме;

✔ Внутреннее и наружное утепление плоских и скатных крыш, мансардных помещений, чердачных перекрытий ;

✔ Наружное утепление стен дома под отделку вагонкой/сайдингом или слоистую кладку;

✔ Устройство вентилируемого утепленного фасада и под штукатурку;

✔ Теплоизоляция стен балконов;

✔ Внутреннее утепление стен дома, пола и потолка под сухую отделку или штукатурку;

✔ Теплоизоляция перекрытий, в том числе под «теплые» полы;

✔ Утепление бань и саун.

Видео: Виды утеплителя PIR для строительства дома

Преимущества PIR утеплителя

В отличии от пенополиуретана термоизоляционные панели PIR обладают следующими характерными преимуществами:

✔ Высочайшие теплоизоляционные свойства;

✔ Способность держать слой штукатурки и других облицовочных материалов благодаря прочности и жесткости плит;

✔ Экономия внутреннего пространства при утеплении изнутри за счет малой толщины утеплителя;

✔ Низкое водопоглощение термоизоляционных плит утепления PIR;

✔ Возможность монтажа в сырую погоду;

✔ Высокая степень герметичности благодаря водо- и паронепроницаемости алюминиевого покрытия и замковым соединениям кромок панелей;

✔ Технологичность и удобство работы, обеспечиваемое жесткостью утеплительных плит и отсутствием необходимости укладывать пароизоляцию;

✔ Экологичность, безвредность использования PIR утеплителя;

✔ Длительный срок службы утеплителя.

Недостатки PIR теплоизоляции

✔ Небольшая (0,02-2 %) усадка теплоизоляционного материала в течение первых лет эксплуатации;

✔ Умеренная горючесть некоторых марок утеплителя;

✔ Сравнительно высокая цена плитного утеплителя;

Срок службы утеплителя PIR

Срок службы ПИР плиты из пенополиизоцианурата выше чем у пенополиуретана, пенополистирола (ЭППС) и составляет не меньше 50 лет.

Во многих случаях это означает эффективную работу теплозащиты на все время эксплуатации здания или сооружения.

Видео: Испытание огнем фольгированного утеплителя от ТехноНИКОЛЬ

PIR плиты – современный термоизоляционный материал нового поколения, виды и цена

На нашем портале в разделе «Утепление дома» представлено немало разнообразной информации по самым разным типам термоизоляционных материалов. Однако, в комментариях к статьям некоторые читатели удивленно спрашивают, почему ничего не говорится о PIR плитах? Согласимся – замечания вполне справедливые. Действительно, этой теме было уделено непростительно мало внимания. Настоящей публикацией попробуем восполнить досадный пробел.

PIR плиты – современный термоизоляционный материал

Ассортимент термоизоляционной продукции ширится с каждым годом. Выпускаются новые разновидности, отличающиеся от своих предшественников повышенными утеплительными качествами, более удобной формой для проведения работ, улучшенными эксплуатационными характеристиками. Время от времени рынок радует и появлением принципиально новых разработок. Не столь давно таковыми показали себя PIR плиты – современный термоизоляционный материал, существенно превосходящий по подавляющему числу критериев другие утеплители.

Что такое PIR плиты?

Химическая структура материала

Если внимательно посмотреть на разнообразие утеплительных материалов, становится очевидно, что в частном строительстве чаще всего применяются различные типы минеральной ваты и пенополистирол. В последнее время все шире стало использоваться напыление пенополиуретана. Каждый из этих материалов обладает собственным перечнем достоинств и недостатков. Останавливаться сейчас на них не будем – всё это рассмотрено на нашем портале в других статьях.

Какой утеплитель лучше выбрать для термоизоляции дома?

Выбор материала зависит от нескольких факторов. Один потребитель ставит «во главу угла» доступную стоимость, другой — максимальную простоту монтажа термоизоляции, третьему важны именно утеплительные характеристики и т.д. Оценить достоинства и недостатки и сделать правильный выбор поможет специальная статья нашего портала «Утеплители для наружных стен дома».

А есть ли такой материал, который бы сочетал основные достоинства распространённых утеплителей, и вместе с тем присущие им недостатки у него отсутствовали или были сведены к минимуму?
Например:

— Показывал бы максимально высокие утеплительные качества, не менее, чем у напыляемого пенополиуретана, но при этом не требовал сложного оборудования для нанесения?

— Обладал бы выраженной огнестойкостью, невозгораемостью, как минеральная вата, но вместе с тем не боялся переувлажнения и был удобнее в работе?

— Имел бы прочностные характеристики не хуже, чем у ЭППС, был же столь комфортен в укладке, но не боялся огня и не выделял при термическом разложении токсичных веществ, смертельно опасных для человека?

Да такой материал есть – это утеплитель нового поколения, который называют PIR плитами.

Полное название PIR – очень длинное и трудно произносимое: полиизоцианурат. Материал является «близким родственником» пенополиуретана, но отличается от него и пропорциями исходных компонентов, и использованием в процессе синтеза специальных каталитических присадок, и иными температурно-барическими режимами производства. В результате получается сложный полимер с жёсткой кольцеобразной молекулярной структурой. При всей схожести с пенополиуретаном, PIR имеют более высокие показатели сопротивления теплопередаче, структурной стабильности, механической прочности, химической инертности и стойкости к высоким температурам. Для сравнения – термическое разложение пенополиуретана начинается при нагреве до 110 °С, а у PIR плит эта граница практически вдвое выше – 200 °С.

Мелкоячеистая пористая структура PIR плит, характерного белого или светло-бежевого цвета

В результате производственных процессов получается пористая структура с закрытой газонаполненной ячейкой. Материал обладает хорошей жесткостью, но при этом доля самого полимера в его объеме составляет не более 5 %, а остальные 95 % приходятся на газовое наполнение структуры, что и обуславливает высочайшие термоизоляционные качества PIR плит.

Формы выпуска PIR плит

Вспенивающийся полимер, получающийся в результате реакции в процессе производства, обладает чрезвычайно высокой адгезией. Иными словами, он липнет буквально ко всему, с чем соприкасается. Это качество в определенной степени даже осложнят технологический процесс – обычная экструзия, которую используют, например, при изготовления схожего по структуре пенополистирола, здесь видоизменена. PIR плиты никогда не производятся в «голом» виде – у них всегда есть покрытие с обеих сторон. Этот покрывной слой, кроме того, повышает устойчивость материал к механическим нагрузкам, к воздействию ультрафиолетовых лучей, к другим природным факторам, негативно влияющим на долговечность плит.

Цены на PIR плиты

PIR плиты

Материал же покрытия и его толщина могут быть разными – это во многом и предопределяет предназначение плит для разных участков термоизоляции конструкций здания.

ИллюстрацияТип покрытия PIR плиты и ее предназначение
Покрытие из крафт-бумаги (картона). Такие плиты очень хорошо подходят для утепления внутри зданий, в том числе, например, подшивки чердачного перекрытия. Бумажные поверхности становятся отличным основанием для нанесения отделки.
Плиты с обкладками из стеклохолста вполне подойдут также для внутренней отделки. Кроме того, их широко применяют и для наружного утепления стен, например, по технологии «мокрый фасад» - по такому покрытию хорошо ложится армированный штукатурный слой. Стеклохолст, в свою очередь, может иметь еще и минеральное покрытие.
Плиты с покрытием из стекловолокна с битумной пропиткой – это отличное решение для утепления кровель, в особенности плоских. Удобство в том, что производить наплавку рулонных гидроизоляционных материалов можно непосредственно на уложенный слой утепления.
Алюминиевое покрытие – может быть «жатым» многослойным или гладким, кэшированным крафт-бумагой. Такая отражающая подложка значительно увеличивает теплоизоляционные качества материала и способна служить еще и дополнительной пароизоляцией, например, при утеплении помещений с повышенной влажностью.
Практикуется защитное покрытие из стекловолокна с графитовым составляющим – этот тип обкладки существенно увеличивает устойчивость материала к открытому пламени, повышая противопожарные качества всей конструкции. Часто используется для утепления фасадов, внешних стен хозяйственных построек.
Наконец, еще одной разновидностью можно считать сэндвич панели с заполнением из пенополиизоцианурата. Такие панели одновременно способны выполнять и несущие функции, и термоизоляционные. Широко применяются в промышленном строительстве. Могут быть использованы и в индивидуальном строительстве, обычно – для возведения гаражей или хозяйственных построек различного предназначения.

Размеры выпускаемых PIR плит по длине и ширине могут быть различными. В основном производители придерживаются стандарта 600×1200 м, но могут быть и исключения. Для масштабных работ при утеплении больших площадей могут применяться изделия с линейными размерами 1200×1200 и даже 1200×2400 мм. А по индивидуальным заказам отечественные производители берутся поставлять плиты и других форматов, насколько это позволяет имеющееся оборудование.

Наиболее «ходовой» размер выпускаемых PIR плит – 600×1200 мм

Такие утеплительные плиты пока еще относятся к довольно дорогим утеплителям, поэтому экономически необоснованно, а с эксплуатационной точки зрения – совершенно излишне злоупотреблять толщиной термоизоляции. В предлагаемом ассортименте – плиты с толщинами от 20 до 150, а у некоторых производителей до 170 и даже до 250 мм. То есть всегда имеется возможность выполнить именное такую термоизоляцию, которую требуют теплотехнические расчеты.

Как самостоятельно рассчитать необходимую толщину слоя утепления из PIR-плит – будет рассказано в приложении к статье, где, кроме того, имеется и удобный калькулятор.

Торцы плит могут быть ровными – такие утеплители удобны для укладки между, например, элементами обрешетки. Но для создания сплошной термоизоляции на большой площади лучше приобрести PIR плиты, оснащенные замковой частью.

Различные типы кромок PIR плит – ровная, с L-замком и с пазо-гребневым замком

Замковые соединения позволяют сделать термоизоляционное покрытие практически бесшовным, свести к минимуму лазейки для проникновения холода. На плитах малой и средней толщины практикуется использование L-замка (на иллюстрации – в центре). В панелях большой толщины может быть пазо-гребневый замок, расположенный по центру.

Следует иметь в виду, что L-замок несколько уменьшает полезную площадь PIR плиты. Так, если обычная панель имеет размер 1200×600 мм, то при планировании работ с использованием замковых плит необходимо принимать в расчет полезный размер 1185×585 мм, то есть  с двух сторон по 15 мм «съедается».

Основные характеристики PIR плит, достоинства и недостатки утеплителя.

Какими же характеристиками обладают PIR панели, почему они считаются на сегодняшний день одним из лучших утеплительных материалов.

Термоизоляционные качества

Для любого утеплителя, безусловно, на первом месте всегда стоят его термоизоляционные характеристики. Коэффициент теплопроводности PIR панелей некоторыми производителями указывается даже в 0,021 Вт/м×К — это лучший результат среди всех используемых для подобной цели материалов.

Сравнение толщин разных утеплителей при равном значении сопротивления теплопередаче.

Справедливости ради надо заметить, что в столь низкий коэффициент теплопроводности верится все же с трудом. Возможно, он достигается в каких-то идеальных лабораторных условиях, но при реальной эксплуатации, тем более в условиях повышенной влажности, он будет несколько выше. Но все равно, даже если рассматривать более «приземленные» значения, то 0,024÷0,026 Вт/м×К — это великолепный показатель, недостижимый для подавляющего большинства иных утеплительных материалов.

Гигроскопичность и паропроницаемость.

Казалось бы, пористая структура материала — это предпосылка для свободного проникновения влаги. Однако, все обстоит ровным счетом наоборот. Жесткие закрытые ячейки практически не пропускают воду. В экспериментальных условиях при длительном (на 28 суток) полном погружении PIR плиты в воду ее водопоглощение по объёму составило не более 1 процента. Причем в некоторых образцах различных производителей этот показатель был и еще ниже, от 0,25 до 0,5 процента.

Такая выраженная гидрофобность означает, что влага будет неспособна оказывать сколь-нибудь значимое негативное влияние на термоизоляционные качества материала и на его общую долговечность.

Паропроницаемость у пенополиизоцианурата также очень невысока. Ее коэффициент лежит в пределах от 0,0015 до 0,015 мг/м×ч×Па. Кстати, это качество не всегда может расцениваться как «плюс». Для внутреннего утепления или для термоизоляции кровли пароизоляционные качества действительно являются достоинством – при организации эффективной вентиляции помещений или чердака. А вот для утепления фасадов это уже, скорее, недостаток, так как влаге из стен не будет никакого выхода.

Плотность и прочностные качества

Пористая газонаполненная структура пенополиизоцианурата предопределяет невысокую плотность PIR плит. Она в различных моделях утеплителя колеблется от 30 до 40, максимум до 50 кг/м³. То есть с плитами удобно работать, их переноска и монтаж не требуют приложения сколь-нибудь значительных физических усилий.

Но это вовсе не означает, что материал непрочный. Ом прекрасно сохраняет приданную форму в течение всего срока эксплуатации. Усилие, которое необходимо приложить для 10-процентной деформации плиты – не менее 120 кПа, что соответствует 1,22 кгс/см². Материал не дает усадки. Способен выдерживать многократные нагрузки на сжатие без значимой потери прочности и первоначальной формы, что важно, например, при утеплении плоских кровель, по которым могут перемещаться люди, выполняя те или иные работы.

PIR плиты легко поддаются резке в нужный размер – ножовкой или, при небольшой толщине, даже просто острым ножом

Вместе с тем, плиты прекрасно поддаются обработке. Не составляет особого труда раскроить панель в необходимый размер при подгонке утеплительного слоя. В зависимости от толщины PIR плиты это можно сделать или ножовкой, или даже острым строительным ножом.

Противопожарные качества

Показатели стойкости к воздействию огня – одни из самых важных при выборе любых утеплителей, так как у некоторых типов с этим бывает очень неблагополучно. Но использование PIR плит не должно вызывать особых опасений.

Сам полиизоцианурат относится к группе горючести Г1÷Г2. То есть в этом вопросе он несколько уступает многим типам минеральной ваты, которые считаются вообще негорючими (НГ).

При воздействии на материал открытым пламенем происходит обугливание верхнего слоя, и эта углеродная корка препятствует проникновению кислорода и распространению огня вглубь и по поверхности плиты. Важно, что отсутствует эффект плавления и текучести материала – даже в самых неблагоприятных условиях он не станет распространителем очагов пламени.

Результаты огневых испытаний точечным источником пламени. Слева – мат из базальтовой минеральной ваты, справа – PIR плита.

Группа горючести, устанавливаемая для готовых утеплительных плит, зависит еще и от материала обкладки, так как общее присвоение класса производится по наиболее горючей составляющей:

  • PIR плиты, покрытые алюминиевой фольгой или стеклотканью с графитовым наполнением, а также сэндвич-панели со стальной облицовкой относят к классу Г1.
  • Панели с покрытием из стеклохолста или крафт-бумаги – к классу Г2.
  • Плиты с обкладкой из стеклохолста с битумной пропиткой – к классу Г3.

Характерная особенность пенополиизоцианурата – как видно, он не распространяет пламени, не боится открытого огня, но при термическом воздействии уже в 200 °С начинает терять прочность, крошиться. Это может привести к разрушению самой конструкции теплоизоляции. И огнестойкость материала лежит в прямой зависимости от его толщины. Это необходимо учитывать, если плиты (панели) используются для создания несущих или самонесущих конструкций.

Например, для PIR сэндвич-панелей со стальной двусторонней профилированной обкладкой предел огнестойкости составляет:

  • Толщина 40 мм – воздействие пламенем без потери несущей способности – 15 минут (EI 15).
  • Толщина от 60 до 120 мм – 30 мин (EI 30).
  • Толщина от 120 до 200 мм – 45 мин (EI 45).

Есть еще одно очень важное достоинство PIR утеплителей, выгодно отличающее их от схожих по структуре плит из экструдированного пенополистирола (ЭППС). При термическом разложении не наблюдается выделения токсичных продуктов, представляющих смертельную опасность для человека при пожаре.

Видео: Огневые сравнительные испытания утеплительных плит из различных материалов

Другие достоинства PIR плит

Помимо перечисленных выше впечатляющих физико-эксплуатационных характеристик, можно отметить и некоторые другие положительные качества этого утеплителя:

  • Производители заявляют о выраженной долговечности материала. Так, срок эксплуатации утеплительных плит оценивается в 30 и более лет.
  • Диапазон допустимых эксплуатационных температур – очень широк. Материал не теряет свои качеств ни при охлаждении до – 70 °С, ни при нагреве до 120 °С.
  • PIR плиты не подвержены гниению, разложению, обладают высокой химической стойкостью к большинству агрессивных соединений, с которыми можно теоретически предположить контакт во время эксплуатации.
  • Такой утеплитель не становится питательной средой ни для каких форм жизни. В нем не селится паразитическая микрофлора, не делают гнезд насекомые или грызуны – из-за практически нулевой пропускаемой воздуха.
  • Собственная химическая стабильность полиизоцианурата – это гарантия того, что материал в процессе эксплуатации в нормальных условиях не будет выделять в атмосферу никаких вредных испарений. Экологическая чистота системы утепления – еще один из важных критериев для выбора этого материала.
PIR плиты отличаются экологической чистотой в течение всего периода эксплуатации, и поэтому без ограничений могут применяться для внутренних работ. Эмиссии токсичных веществ опасаться не приходится.
  • При монтаже утеплительных конструкций PIR плиты не пылят и не раздражают кожу. В отличие от укладки минеральной ваты, нет особой необходимости в каких-либо средствах защиты для глаз и органов дыхания.

Недостатки PIR-утеплителей

С эксплуатационной точки зрения, «минусов» в подобной термоизоляции найти сложно. Однако, востребованность PIR плит у массового отечественного потребителя пока невысока. Во всяком случае, в сравнении с минеральной ватой или ЭППС объёмы продаж пока что невелики.
Причин такому явлению можно назвать две:

  • Недостаточность информации – многие владельцы жилья даже и не знают про такой материал.
  • Слишком высокая цена, которая по мнению многих потенциальных покупателей, все же пока не адекватна для потребителя со средним уровнем доходов.

Надо надеяться, что стоимость материала со временем войдет в более приемлемые рамки, или доходы среднестатистического россиянина станут значительно выше. И тогда будет наблюдаться картина, как во многих странах Европы и Америки. Там уже который год устойчиво развивается тенденция постепенного отхода от других утеплителей в пользу более эффективной и безопасной термоизоляции на основе пенополиизоцианурата.

Производители PIR панелей

Несмотря на некую «пессимистическую нотку» в конце предыдущего раздела статьи, отечественный рынок PIR-продукции все же активно развивается. Подтверждение тому – широкий ассортимент высококачественной продукции нескольких российских компаний.

Основными производителями PIR полит в России являются следующие компании:

  • Компания «PirroGroup» с головным офисом в Москве и заводом в Саратове. Кстати, судя по отзывам потребителей, именно «саратовские» плиты негласно считаются неким эталоном качества отечественной продукции такого типа.
Логотип компании «PirroGroup»

Как понятно из названия, направление деятельности компании изначально было ориентировано на производство утеплительных материалов на основе пенополиизоцианурата. В своевременном ассортименте — плиты различного предназначения для промышленного и частного строительства.

Диапазон толщин – от 20 до 200 мм с шагом 10 мм. Варианты обкладки – любые, причем могут сочетаться разные варианты с лицевой и тыльной сторон плиты.

О стоимости материала абстрактно говорить сложно – она зависит и от модели плиты, и от обкладки, и от толщины утеплителя. Все эти данные несложно уточнить на официальном сайте производителя или на интернет-площадках его региональных торговых представительств.

Видео: самостоятельное утепление бани плитами «PIRRO» компании «PirroGroup»

  • Пользуется хорошим спросом продукция компании «Профхолод». Изначальное направление деятельности фирмы – изготовление сэндвич-панелей с пенополиуретановым заполнением. Но постепенно сфера деятельности расширялась, а с 2014 года в производство были запущены и инновационные PIR плиты различного типа.
По этому логотипу несложно узнать продукцию компании «Профхолод»

В настоящее время в ассортименте компании восемь наименований PIR плит, различающихся типами применяемых обкладок. Естественно, каждый из видов имеет еще и «внутреннюю градацию» по толщинам, от 30 до 150 мм с шагом 10 мм.

  • Не упустила из внимания эту сферу производства и известная российская компания «ТехноНиколь». В широком ассортименте выпускаемых материалов – и довольно представительная линейка LOGICPIR.
Плиты LOGICPIR – это гарантированное качество и долговечность, свойственные любой продукции компании «ТехноНиколь»

В этой линейке – различные типы плит, предназначенные для любых сфер профессионального и индивидуального строительства. Особое удобство дает продуманная специализация материалов, о которой красноречиво говорят названия разных типов PIR-панелей: универсальные «LOGICPIR Мастер», более узконаправленные «Стена», «Полы», «Балкон», «Баня». Это значительно упрощает потребителю задачу выбора оптимального материала.

*  *  *  *  *  *  *

Приложение: Как самостоятельно подсчитать необходимую толщину утеплителя?

Как видно из сказанного выше, диапазон толщин выпускаемых PIR плит – довольно широк. А стоимость такой термоизоляции – весьма высока, то есть утеплять «на глаз с запасом» видится нецелесообразным. Проще будет провести небольшой расчет, который покажет, какая толщина утепления будет оптимальной для конкретного региона и конкретной строительной конструкции.

Расчет строится на том принципе, что любая строительная конструкция (стена, перекрытие или кровельное покрытие) суммарно должна обладать таким сопротивлением теплопередаче, чтобы оно было не меньше установленных нормативных значений для данной местности (естественно, это зависит от климатических особенностей региона).

Узнать нормированное значение термического сопротивления можно из таблиц СНиП, уточнить в любой местной строительной организации или же взять значение по карте-схеме, приведенной ниже Обратите внимание – для стен, перекрытий и покрытий эти значения – разные. Для удобства на схеме они выделены различными цветами.

Карта-схема для уточнения значения нормированного сопротивления теплопередаче для строительных конструкций (по регионам России).

Практически любая конструкция – это несколько слоев различных по предназначению материалов, каждый из которых обладает своими термоизоляционными способностями. Утеплитель тоже становится одним из таких слоев, и как раз на его долю должна прийтись компенсация «дефицита» термического сопротивления.

Зная коэффициенты теплопроводности материалов, толщину слоев конструкции и значение нормированного сопротивления несложно определить, какая же толщина потребуется.

Несколько уточняющих слов по слоям. Здесь необходимо исходить из реальных условий, оценивать специфику каждой конструкции. В калькуляторе ниже будет возможность указать дол трех слоев, без учета термоизоляции. Но, понятно, такое количество бывает не всегда и не везде.

Несколько примеров.

Внешняя стена дома. В общий «пирог» может войти прежде всего сам материал капитальной стены. Возможно, определёнными утеплительными способностями обладает материал внешней отделки фасада (скажем, планируется использовать «теплую штукатурку». Важно, если отделка сделана по принципу вентилируемого фасада, она никогда в теплотехнический расчет не принимается, так как отделена от стены продуваемым зазором. И, наконец, внутренняя отделка, для которой часто применяются материалы, обладающие весьма неплохими термоизоляционными качествами.

Возможно, какого-то из слоев нет — значит в поле «толщина» оставляется значение по умолчанию «0».

Случается, что и вовсе приходится рассчитывать толщину утепления без учета каких бы то ни было слоев. Классический пример – стена из сэндвич-панели без последующей отделки. Принимать в расчет тонкие листы металла снаружи и внутри – совершенно бессмысленно, так как они никакого значимого влияния на конечный результат не окажут.

С каждым конкретным случаем утепления необходимо разбираться «персонально»

При утеплении крыши, например, если создается полноценная жилая мансарда, в расчет не принимается кровельное покрытие (оно опять же отделено от термоизоляции вентилируемой воздушной прослойкой), но можно учесть планируемую внутреннюю обшивку. Понятно, что капитальной конструкции в данном случае нет вовсе.

Для каркасных стен или перекрытий можно взять в расчёт материал и толщину обшивки с обеих сторон.

Цены на PIR-плиты от популярных производителей

Одним словом, каждый из случаев требует индивидуального рассмотрения. На всякий случай в калькуляторе, как говорилось, дана возможность указания трех слоев. Но толщина для каждого из них по умолчанию указана «0».

Помимо PIR плит, в поле указания утеплителя приведены и другие материалы. Это и добавляет калькулятору универсальности, и, кстати, позволяет быстро и очень наглядно сравнить эффективность разных типов термоизоляции.

Калькулятор покажет результат в миллиметрах. Проведя округление в большую сторону до ближайшей стандартной толщины, несложно определить, какая плита станет оптимальной.

Калькулятор расчета толщины утепления PIR плитами

 Перейти к расчётам

НАДЕЖНЫЙ УТЕПЛИТЕЛЬ PIRRO - ТЕПЛО И НАДОЛГО


Разновидности материала PIR:

PIR-плита PirroСтена -

термоизоляционная плита на основе жесткого пенополиизоцианура с облицовками из стеклохолста с минеральным связующим. Плита имеет облицовки с обеих сторон.

Плиты имеют размеры 1200х600 мм, обеспечивающие комфортность в работе, нарезаются любым режущим инструментом (нож, ножовка, электролобзик и т.п.). Упаковка плит PirroСтена имеет габариты, удобные для перевозки легковым автотранспортом.

Плита

PirroСтена является специальным утеплителем для теплоизоляции стен и потолков под последующее оштукатуривание по технологии тонкослойных штукатурных фасадов. Используется для внешнего утепления наружных стен, утепления наружных стен изнутри (угловые комнаты и т.п.). Плита незаменима при утеплении стен и потолков балконов, лоджий и т.п. помещений небольших размеров за счет экономии полезной площади.

PIR-плита PirroТермо - термоизоляционная плита из жесткого пенополиизоцианурата с двухсторонней облицовкой из алюминиевой тисненной фольги толщиной 50 мкм.

Плиты имеют размеры 1200х600 мм, обеспечивающие комфортность в работе, нарезаются любым режущим инструментом (нож, ножовка, электролобзик и т.п.). Упаковка плит PirroСтена имеет габариты, удобные для перевозки легковым автотранспортом.

Плита PirroТермо предназначена для утепления скатных крыш, мансард, стен, в том числе в слоистых кладках с облицовкой кирпичом на объектах частного домостроения, а также для утепления холодных веранд и террас. Подходит для утепления балконов и лоджий в квартирах и дачах, для утепления стен и потолков помещений парных в саунах и банях.

PIR-плита PirroКрафт - термоизоляционная плита из жесткого пенополиизоцианурата с двухсторонней облицовкой крафт-бумагой.

Плиты имеют размеры 1200х600 мм, обеспечивающие комфортность в работе, нарезаются любым режущим инструментом (нож, ножовка, электролобзик и т.п.). Упаковка плит PirroСтена имеет габариты, удобные для перевозки легковым автотранспортом.

Плита PirroКрафт является универсальным теплоизолятором для применения в частном домостроении и при ремонте квартир. Используется для внутреннего утепления стен, потолков, полов. Подходит для утепления балконов, лоджий и т.п. небольших размеров за счет экономии полезной площади под сухую отделку (гипсокартон, вагонка и т.п.), в том числе при доутеплении стен изнутри.

Oxford University Press. xlviii + 358 с. Таблички, карты, рисунки, библиография, указатель. 995 (в твердом переплете).

100 / Вклад в индийскую социологию 52, 1 (2018): 97–127

фантомная история расовых отношений после войны »(Hebdige 1979: 56).

Следуя, среди прочего, работе Ритти Лукосе о молодежных стилях

постлиберализации «граждан-потребителей» Кералы, Накассис выбрал демографию

- студенческую молодежь (в основном мужчины) из Тамил Наду, чей стиль

- портняжный. и лингвистический - он изучает подробное этнографическое описание

, оформленное в рамках широкого диапазона культурных и антропологических

теорий.Опираясь на лейтмотив мифа об Икаре, чьи восковые крылья

растаяли, когда он оказался слишком близко к солнцу, аргумент Накассиса заключается в танце

между стилем и сверхстилем, первое является предпосылкой прохлады и

. даже подрыв иерархии классов и каст, а последнее - как «избыток»

, который может одним махом избавиться от клейма носителя стиля от гетту (задира) до

. Разделенная на три раздела, а именно бренд, язык и фильм

, книга быстро переключается между личными рассказами о студенческой молодежи

на юге Индии и подробным описанием использованной аналитики, включая, среди прочего,

, «повторяемость», «запутанность». »и« цитируемость », а также мета-категории

« молодежь »и« стиль ».Если «молодость» - это пороговый статус между

зрелости и надвигающимся вступлением в кастовое общество, отмеченный давлением со стороны сверстников

, интимными отношениями и стильными подрывными действиями, тогда «стиль» - это сразу несколько вещей

: «местный дискурс», «этнографические данные» и, что наиболее важно,

после Джудит Батлер, «итеративный», «цитатный» и «перформативный».

Накассис опасно ступает между всеми этими абстракциями через конкретные

поверхностей «опосредованных и материализованных» практик портняжных и

лингвистических, поскольку они «переплетаются» с производством одежды, школьными ритуалами,

музыкальным телевидением и кино. производство.

В первом разделе, который исследует эстетику бренда и стиля

через их дизайн, производство и распространение, а также беспокойство, которое они вызывают

как для производителя, так и для владельца этого стиля, для достижения идеального баланса между поставками

Nakassis

делает решающее различие между «брендом» и «фирменностью», а также излишеством, стилем и излишним стилем. Он утверждает, что

посредством подробных описаний предпочтительных брендов студентов колледжей и стилей

, а также материального производства этих высококачественных и недорогих тканей

в тоттамах (буквально означает «сады» и в этом контексте

«составов») Северного Ченнаи, когда молодежь из колледжей занимается стилем,

они не обязательно выбирают оригинальные элитные бренды, но сознательно

спортивных дубликатов, которые ссылаются на оригинальные бренды; они «взаимодействуют» в зиммелийском смысле

с мировыми брендами, чтобы создать лиминальность, амбивалентность и ненадежность

местных стилей.

Обзор калиброванных стальных пластин для пауэрлифтинга Rogue

(плюс 2-летнее обновление)

Калиброванные стальные пластины для пауэрлифтинга Rogue - одни из лучших стальных пластин для соревнований, доступных сегодня. Обладая точным весом, тонкой, одинаковой шириной и диаметром, подходящим для большинства гильз штанги, эти стальные пластины должны быть на вершине любого списка стальных пластин для соревнований.

Калиброванные стальные пластины для пауэрлифтинга Rogue разработаны с учетом трех движений. Приседания, жим лежа и становая тяга, также известные как большая тройка пауэрлифтинга.

Значит ли это, что вы можете использовать их только для трех движений? Конечно, нет, вы можете использовать их во время обратного гипер, использовать их во время различных вспомогательных работ или даже сгибаться с ними в стойке для приседаний (преимущество наличия тренажерного зала у вас дома).

Эти пластины созданы для соревнований. Нет никаких сомнений в том, что все, от цветов до криков точного взвешивания, является излишним для владельца домашнего спортзала. Однако кто я такой, чтобы сказать вам, что они излишни, у меня есть тарелки на 1000 фунтов, и я их очень люблю.

Если вам нравятся такие вещи, как чистка, рывки и другие динамические движения, мы рекомендуем придерживаться пластин бампера. Но, если придерживаться «медленных» движений, то это идеальная тарелка.

Одна вещь, которую часто неправильно понимают в отношении пластин для соревнований по пауэрлифтингу, заключается в том, что, хотя они намного красивее традиционных стальных пластин, они все же являются чугунными.

Тем не менее, несмотря на то, что они чугунные, между спортивными пластинами и вашими стандартными стальными пластинами есть немало отличий.

Во-первых, наиболее очевидным отличием является то, что вместо серых или черных табличек для соревнований используется цветовая кодировка с использованием того же шаблона, который используется для бамперов для олимпийских соревнований по тяжелой атлетике.

Цвета позволяют легко определить, сколько веса приходится на гриф, а также просто выглядят лучше, чем черное железо (на мой взгляд, многие, скорее всего, не согласятся.) В дополнение к цвету, пластины для соревнований тоньше, чтобы позволить большему весу. быть загруженным на штангу. Хотя для большинства это не проблема, но если вы элитный пауэрлифтер с супертяжелым весом, вы оцените дополнительное пространство на штанге, которое предоставляют пластины.

Центральное отверстие пластин также традиционно намного более плотно прилегает к втулке штанги, чем более дешевые чугунные пластины. 50 мм - это диаметр центрального отверстия на пластинах для пауэрлифтинга Rogue Calibrated Steel, а также то, что используется на пластинах Eleiko и Ivanko.

Наконец, наиболее существенным отличием между силовыми плитами для соревнований и стандартными стальными плитами является точность указанного веса.

Сходите в любой тренажерный зал, возьмите тарелку со стойки, бросьте ее на весы, и вы увидите, как далеко она от веса, указанного на тарелке.Я видел тарелки, вес которых составляет +/- 5 фунтов от указанного веса. Это невероятно, но это реальность.

Одна из причин того, что калиброванные стальные пластины для пауэрлифтинга Rogue являются такими точными (+/- 10 грамм), заключается в том, что они откалиброваны на станке для обеспечения точности по весу и долговечности.

Rogue предпринял необходимые шаги для решения распространенной проблемы, связанной с неточным весом чугунных пластин. Один из шагов, предпринятых Rogue, - это производство всех своих пластин с помощью машинной калибровки.

По большому счету, большинство чугунных пластин производятся в Китае, даже стальные пластины Rogue, но, сделав их откалиброванными на станке, эти чугунные пластины будут иметь более высокую точность, чем другие конкуренты.

То, что делает Rogue, что похоже на многие другие соревновательные пластины, - это вырезание равного количества железа из каждой пластины. Затем они помещают их в машину, которая калибрует, сколько латуни необходимо вставить в каждую пластину, чтобы она соответствовала указанному номинальному весу.

Процесс достижения этого ни в коем случае не является коротким. Это одна из причин, по которой пластины стоят намного дороже, чем стандартные чугунные пластины. Дополнительные человеко-часы, необходимые для изготовления пластины для соревнований, значительно больше, чем для стандартной чугунной пластины.

Rogue сделает это для всех своих пластин и откалибрует каждую латунную заглушку индивидуально, чтобы закруглить каждую пластину. Я имею в виду, что не все латунные заглушки откалиброваны одинаково. Rogue оценивает каждую пластину индивидуально и вставляет подходящую латунную заглушку, чтобы гарантировать точность указанного веса пластины.

Одна вещь, которую Разбойник добавил на оборотную сторону каждой таблички, одобренной IPF, и наклеек Разбойника. Я слышал, что некоторым людям нравятся наклейки, но лично я не фанат. Они все равно отслаиваются и сдирают часть краски, поэтому я не думаю, что их следует добавлять.

Одна вещь, которая может случиться с откалиброванными пластинами, - это то, что латунные заглушки могут выпасть из своих отверстий и либо дребезжать, либо полностью выпасть. Я еще не испытал этого с пластинами Rogue, однако, если это произойдет, я обновлю обзор.

Центральное отверстие для каждой пластины имеет постоянный диаметр 50 мм. На самом деле, я бы сказал, что он даже меньше, потому что есть краска, которая в конечном итоге стирается, когда пластины сначала кладут на планку. Этого следовало ожидать, хотя я бы хотел, чтобы Роуг удалял краску с центрального отверстия, чтобы стержни не повредились, поскольку это неизбежно.

Если вы раньше использовали дешевые чугунные пластины (а я уверен, что у вас есть, поскольку большинство пластин в этом мире дешевые и изготовлены из чугуна), вы знаете, как раздражает центральное отверстие, которое слишком велико для стержня. быть. Пластины будут двигаться, не стоять прямо и вызывать чрезмерное повреждение гильзы шины.

Вы не испытаете этого с калиброванными стальными пластинами для пауэрлифтинга Rogue. На самом деле, если у вас более дешевая планка, тарелки могут вообще не поместиться на рукаве. При этом я настоятельно рекомендую вам купить штангу высокого класса, прежде чем покупать дорогие пластины.

Не только пластины имеют небольшой диаметр, но и калиброванные стальные пластины Rogue также намного тоньше стандартных. По словам Роуга, на гриф можно уместить до 700 кг веса, чего более чем достаточно для любого текущего или будущего рекорда.

Ширина пластин следующая:

  • 25 кг-27 мм
  • 20 кг-22,5 мм
  • 15 кг-21 мм
  • 10 кг-21 мм.

Особое внимание Rogue к деталям, чтобы сделать пластины настолько близкими по ширине, является выдающимся.

Каждая из пластин KG соответствует стандарту IPF: правильные цвета соответствуют правильным пластинам. 25 кг - красный, 20 кг - синий, 15 кг - желтый и 10 кг - зеленый. На всех пластинах разного цвета нанесены белые буквы. Буквы и нумерация выделены жирным шрифтом и имеют эксклюзивный бренд Rogue, поэтому нет проблем с чтением табличек.

Диаметр калиброванных стальных пластин для пауэрлифтинга Rogue в значительной степени соответствует заявленным.

Пластина 25 кг имеет диаметр 450 мм, 20 кг - 450 мм, 15 кг - 400 мм, 10 кг - 325 мм.Все эти диаметры также соответствуют стандартам IPF.

По сравнению с другими ведущими компаниями, такими как Eleiko и Ivanko, действительно не так много различий. На самом деле, я предполагаю, что почти все эти пластины производятся на одних и тех же заводах в Китае.

Как и Rogue, пластины для соревнований Eleiko - это чугунные пластины с такими же латунными заглушками.

Наконец, Rogue предлагает наборы как в фунтах, так и в килограммах, в зависимости от того, какую метрику вы используете. Я предпочитаю килограммы, но большинству в США нужны списки фунтов.

В целом, калиброванные стальные пластины для пауэрлифтинга Rogue являются одними из лучших доступных на сегодняшний день пластин, а среди лучших калиброванных пластин для пауэрлифтинга, несомненно, лучшая цена.

Rogue сделал все возможное, чтобы их стальные пластины были лучшими пластинами, которые можно купить за деньги для пауэрлифтинга. Благодаря калиброванной латунной пробке для точного веса, центральному отверстию диаметром 50 мм для плотной посадки на большинстве штанг и цветовой кодировке мы настоятельно рекомендуем эти пластины для тех, кто хочет получить самое лучшее.

Пирро Лигорио, Кассиано Даль Поццо и Республика писем на JSTOR

Абстрактный

Пирро Лигорио (ок. 1512 / 13-83), Питторе, архитектор и антиквариат, ha lasciato un enorme corpus di disgni, commentari e ricostruzioni dell'antica Roma, che sono stati in seguito saccheggiati uniscriminatamenatamente fantas fantoni. L'articolo considera la reputazione di Ligorio nella Roma di diciassettesimo secolo, quando materiale dai suoi manoscritti era cercato avidamente dagli accademici della cosiddetta Repubblica delle Lettere, che includeva Lorenzo Pignoolas (1571-1631), Гильдия Пигнория, 29, 1571–1674) Клод Фабри де Пайреск (1580-1637), Джованни Баттиста Дони (1594-1647), Хосе Мария Суарес (1599-1677), Лукас Холсте (1596-1661) и Клод Менестрие (Менетрие, об.1639). L'antiquario collezionista, Cassiano dal Pozzo (1588-1657), un membersro della famiglia del cardinale del Francesco Barberini, emerge come figura centrale tra questa rete di studiosi, e si argumentsce che il suo ruolo nella raccolta di informazioni ottencritio di manos Детерминанты, специальные предложения для копий парте-деи-маноскритти-лигорио, чей эрано, фарнезская коллекция для цыган. Come questo materiale è stato usato e distribution viene anche considerato atttività e le pubblicazioni del circolo erudito connesso a Dal Pozzo.

Информация о журнале

The Papers of the British School in Rome существует для публикации работ, связанных с археологией, историей и литературой Италии и других частей Средиземноморья вплоть до наших дней, в первую очередь сотрудниками Школы и ее настоящим и бывшие члены. Papers редактируется факультетом археологии, истории и литературы Совета Балтийского моря и является рецензируемым журналом.

Информация об издателе

Британская школа в Риме (BSR) - это центр исследований в области археологии, истории и культуры Италии, а также современного искусства и архитектуры.Он обслуживает потребности ученых и художников из Великобритании и Содружества. BSR - один из исследовательских институтов, спонсируемых Британской академией, и один из большой группы международных академий в Риме. BSR продвигает жилые награды за исследования в области археологии, истории, истории искусства, общества и культуры Италии; жилые награды для художников, художников и архитекторов; программа выставок, особенно в области современного искусства; междисциплинарная программа лекций и конференций; исследовательские проекты, включая полевые археологические работы; специализированная исследовательская библиотека; программа публикаций; короткие специализированные курсы.

Совместное ингибирование передачи сигналов SMAD и MAPK увеличивает поглощение 124I при мутантном BRAF раке щитовидной железы

Endocr Relat Cancer. 2021 г. 1 июня; 28 (6): 391–402.

, 1, * , 2, * , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 3 , 3 , 3 4 , 5, 6 , 5, 6 , 1, 2 , 1, 5 и 1, 5,

Кэтлин А. Лакетт

1 Программа по онкологии и патогенезу человека, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Дженнифер Р. Краккиоло

2 Отделение хирургии Мемориального центра Слоуна Кеттеринга Йорк, Нью-Йорк, США

Гнана П. Кришнамурти

1 Программа по онкологии и патогенезу человека, Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Луис Хавьер Леандро-Гарсия

1 Онкология человека Патогенез Программа, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Джеймс Нагараджа

1 Программа онкологии человека и патогенеза, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Махеш Саксена

1 Программа онкологии человека и патогенеза, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Рона Лестер

1 Программа онкологии человека и патогенеза, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Soo Y Im

1 Программа по онкологии и патогенезу человека, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Чжэнь Чжао

3 Программа биологии и генетики рака, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк Йорк, Нью-Йорк, США

Scott W Lowe

3 Программа по биологии и генетике рака, Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк k, Нью-Йорк, США

Элиза де Станчина

4 Основная лаборатория противоопухолевой оценки, Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Эрик Дж. Шерман

5 Департамент медицины, Мемориал Слоан Онкологический центр Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

6 Медицинский колледж Вейл-Корнелл, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Алан Л. Хо

5 Департамент медицины, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк Йорк, Нью-Йорк, США

6 Медицинский колледж Вейл-Корнелл, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Стивен Д. Лич

1 Программа онкологии человека и патогенеза, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк Йорк, США

2 Отделение хирургии, Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Джеффри А. Кнауф

1 Программа онкологии и патогенеза человека, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

5 Департамент медицины, Онкологический центр Мемориала Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

Джеймс А. Феджин

1 Программа по онкологии и патогенезу человека , Мемориальный онкологический центр им. Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

5 Департамент медицины, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

6 Медицинский колледж Вейл-Корнелл, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

1 Программа по онкологии и патогенезу человека, Мемориальный онкологический центр Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

2 Отделение хирургии, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

3 Программа по биологии и генетике рака, Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

4 Основной центр оценки противоопухолевых заболеваний, Мемориал Слоан Кетте кольцо онкологического центра, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

5 Департамент медицины, Мемориальный онкологический центр Слоуна Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

6 Медицинский колледж Вейл-Корнелл, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США

* (KA Luckett и JR Cracchiolo внесли равный вклад в эту работу)

Поступила в редакцию 19 марта 2021 г .; Принята к печати 23 апреля 2021 года.

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1: Список использованных грунтовок.

GUID: 47917C35-7C62-4A12-BA96-4B7845C85436

Supp Рисунок 1. Нацеливание на передачу сигналов Tgfβ в PTC, индуцированных BRAFV600E. A) Вестерн-блоттинг белковых лизатов из линии клеток, полученных из BrafV600EPTC, инкубированных в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обработанных TGFβ1 в течение 1 часа в отсутствие или в присутствии блокирующего TGFβ1 антитела 1D11 или ингибитора киназы TGFβR1 SD208 (1 мкМ ).B, C) Эффект блокады TGFβ1 на активацию SMAD и включение 124I in vivo. Мышам Braf вводили антитело IgGor 1D11 изотипического контроля один раз каждые 2 дня в течение 14 дней. B) Вестерн-блоттинг лизатов PTC, собранных на 14 день, с указанными антителами. C) Поглощение 124I щитовидной железой (% ID / г ± SEM) у мышей Brafmice до и после лечения с помощью 1D11 или изотипического контроля. Поглощение 124I измеряли с помощью микро-ПЭТ через 24 часа после введения 124I до и после 14 дней лечения. Каждая когорта состояла из 4 мышей. D, E) Скрининг эффективности нокдауна shRNAsto TgfβR1 (D) и TgfβR2 (E) в клетках Braf-PTC мыши.Вверху: количественная ОТ-ПЦР, проведенная в трех экземплярах. Внизу: Вестерн-блоттинг клеток, обработанных pSMAD TGFβ1. F) Сравнение TgfβR1 и TgfβR2shRNAson TGFβ1-индуцированной активации SMAD в клетках Braf-PTC. G) Количественная RT-PCR маркеров дифференцировки щитовидной железы в PTC от мышей Braf, Braf / TβR1 и Braf / shTβR1. Четыре ткани щитовидной железы мышей каждого генотипа анализировали в трех повторностях. Непарный t-критерий с поправкой Велча: * p <0,05, ** p <0,01 по сравнению с Brafmice.

GUID: 881CFD81-E7D7-43A1-B2F9-A628F208781B

GUID: C98821F0-51BA-41AF-94DB-8FB13F37674A

Supp Рис.A) Столбцы представляют собой среднюю винкулиннормированную экспрессию NIS ± SEM из вестерн-блотов, показанных на фиг. 4E. B) Иммуногистохимия для CD45 в PTC от Brafmice, обработанных носителем, CKI или CKI + EW7197. C) Мембранная экспрессия NIS (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) при коиммунофлуоресцентном окрашивании на фиг. 4F. * p <0,05, ** p <0,002

GUID: 1C99965B-9F19-4C1A-8865-D1E2A966E4C2

Abstract

Конститутивная активация MAPK подавляет гены, необходимые для поглощения йодида и биосинтеза тироидного гормона.Соответственно, большинство BRAF V600E папиллярный рак щитовидной железы (PTC) невосприимчив к терапии радиойодидом (RAI). Ингибиторы пути MAPK восстанавливают дифференцированные по щитовидной железе свойства и чувствительность к RAI у мышей и подгрупп пациентов с мутантным PTC BRAF V600E . TGFB1 также нарушает дифференцировку щитовидной железы и, как предполагается, опосредует эффекты мутантного BRAF. Мы создали мышиную модель BRAF V600E -PTC с тироид-специфическим нокаутом гена Tgfbr1 , чтобы исследовать роль TGFB1 в экспрессии дифференцированного тироидом гена и поглощении RAI in vivo. Несмотря на соответствующую потерю Tgfbr1 , уровни pSMAD оставались высокими, указывая на то, что лиганды, отличные от TGFB1, участвовали в этом пути. Было обнаружено, что субъединицы активинового лиганда Inhba и Inhbb сверхэкспрессируются при мутантном раке щитовидной железы BRAF V600E . Лечение фоллистатином, мощным ингибитором активина или вактосертибом, который ингибирует как TGFBR1, так и рецептор активина типа I ALK4, вызывало сильное ингибирование pSMAD в BRAF V600E -PTCs. Одного блокирования передачи сигналов SMAD было недостаточно для усиления захвата йодида в условиях конститутивной активации MAPK.Однако комбинированное лечение фоллистатином или вактосертибом и ингибитором MEK CKI увеличивало поглощение на 124 I по сравнению с одним CKI. Таким образом, лиганды семейства активинов сходятся, чтобы индуцировать pSMAD в Braf-мутантных ПТК. Дедифференцировку BRAF V600E -PTC нельзя приписывать в первую очередь активации SMAD. Однако нацеливание на индуцированный TGFβ / активином pSMAD усиливало эффекты ингибитора MAPK на включение йода в опухолевые клетки BRAF, указывая на то, что эти два пути оказывают взаимозависимое влияние на состояние дифференцировки клеток рака щитовидной железы.

Ключевые слова: щитовидная железа, TGF бета, BRAF, поглощение йода

Введение

Радиойод является ключевым методом лечения пациентов с рецидивирующим или метастатически дифференцированным раком щитовидной железы, а также широко применяется в послеоперационных адъювантных условиях. Большинство папиллярных раков щитовидной железы (PTC), которые являются наиболее распространенной формой заболевания, связаны с клональными неперекрывающимися активирующими мутациями генов, кодирующих эффекторы передачи сигналов пути MAPK, в первую очередь точечными мутациями BRAF и трех генов RAS . , а также слияния рецепторных тирозинкиназ (Fagin & Wells, 2016).Существует обратная корреляция между MAPK-сигнальным потоком PTC, измеряемым по его транскрипционному выходу, и экспрессией генов, необходимых для поглощения йода и биосинтеза тироидных гормонов (Cancer Genome Atlas Research Network 2014). BRAF V600E -мутантный рак щитовидной железы имеет высокий выход MAPK, потому что этот мутантный BRAF класса 1 сигнализирует как мономер и нечувствителен к негативным эффектам обратной связи ERK на активированных димерах RAF (Yao et ​​al. 2015). Соответственно, они также имеют наиболее сильно сниженный показатель дифференцировки щитовидной железы (TDS) (Сеть исследований атласа генома рака, 2014 г.), количественные интегрированные показания набора маркеров дифференцировки щитовидной железы и, как правило, более устойчивы к терапии RAI (Xing et ​​al. . 2005).

Обработка хорошо дифференцированных клеток щитовидной железы TGFB1 нарушает TSH-индуцированную экспрессию тироид-специфических генов, таких как Tg (тиреоглобулин) и Slc5a5 ( Nis ) (Colletta et ​​al. 1989). Лаборатория Сантистебана показала, что pSMAD2 / 3 связывается с фактором транскрипции тироидного происхождения PAX8 и нарушает его трансактивацию симпортера йодида натрия ( Nis ), и что это отменяется экспрессией SMAD7 (Costamagna et ​​al. 2004, Riesco-Eizaguirre et ​​al. 2009), который предотвращает активацию SMAD2 / 3, способствуя деградации рецептора TGFβ (Kavsak et ​​al. 2000). Более того, было показано, что индуцированное BRAF V600E подавление экспрессии Nis опосредуется аутокринной петлей, управляемой TGFB1, в PCCL3 (Riesco-Eizaguirre et ​​al. 2009). Эта группа также обнаружила, что ингибирование транскрипции Nis было MEK-независимым, подразумевая, что повторная дифференцировка достижима в условиях высокой конститутивной активации MAPK.Это не согласуется с доказательствами того, что ингибиторы RAF и MEK спасают уровни мРНК NIS и включение йода в линиях мутантных клеток BRAF , моделях мышей и пациентов (Knauf et ​​al. 2003, Liu et ​​al. 2007, Чакраварти и др. 2011, Ho и др. 2013, Ротенберг и др. 2015, Нагараджа и др. 2016). Тем не менее, BRAF V600E явно увеличивает экспрессию TGFB1 и pSMAD в клеточных линиях и PTC мыши (Riesco-Eizaguirre et ​​al. 2009, Knauf et ​​al. 2011), что побудило нас исследовать функциональную роль этого пути в генетически точном контексте in vivo .

Используя комбинацию генетических и фармакологических подходов, мы обнаружили, что активация pSMAD увеличивается при BRAF-мутантном раке щитовидной железы, и что это происходит из-за беспорядочного взаимодействия активина и лигандов семейства TGFβ с соответствующими рецепторами. Ингибирование активации pSMAD in vivo недостаточно для индукции повторной дифференцировки раковых клеток в контексте конститутивной активации MAPK.Однако подавление путей MAPK и pSMAD приводит к усилению захвата радиоактивного йода раковыми клетками, эффект, который можно использовать для получения терапевтического эффекта.

Материалы и методы

Мышиные модели

Животные, использованные в этом исследовании, содержались на фоне смешанного штамма. Уход за животными и все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных MSKCC. Линии мышей были генотипированы Transnetyx, Inc. (Кордова, Теннесси) с использованием количественной ПЦР или ПЦР с использованием праймеров, описанных в дополнительной таблице 1 (см. Раздел о дополнительных материалах, приведенный в конце этой статьи).

Мыши TPO-Cre (Kusakabe et ​​al. 2004), полученные от доктора Шиоко Кимура (NCI), были скрещены с мышами LSL-Braf V600E (Mercer et ​​al. 2005), полученными от доктора Катрина. Притчард (Университет Лестера, Великобритания) для получения TPO-Cre / LsL-Braf V600E ( Braf ) мышей, что привело к специфическому для щитовидной железы включению онкогенного Braf (Franco et ​​al .2011. ). Tgfbr1 f / f ( TβR1 ) мышей (Larsson et ​​al. 2003), щедрый подарок от доктора Йосуке Мукоямы (NIH / NHLBI), были скрещены с LSL-Braf V600E и TPO-Cre для получения LSL-Braf V600E / Tgfbr1 70 f / Tgfbr1 70 f / Tgfbr1 70 f / и TPO-Cre / Tgfbr1 f / f соответственно. Экспериментальные мыши TPO-Cre / LSL-Braf V600E / Tgfbr1 f / f ( Braf / TβR1 ) были получены путем скрещивания TPO-Cre / Tgfbr1 f / f с Braf39 903 LSL. V600E / Tgfbr1 f / f .

Создание мышей Tre-shTgfbr1

shРНК для Tgfbr1 и Tgfbr2 были сконструированы с использованием splashRNA (splashrna.mskcc.org) (Pelossof et ​​al. 2017) и клонированы в вектор экспрессии pMSCV. Ретровирусные частицы, экспрессирующие shРНК, получали, как описано ранее (Dow et ​​al. 2012), и использовали для инфицирования клеточной линии TPO-Cre / Braf V600E PTC . Количественная RT-PCR использовалась для определения эффективности нокдауна и вестерн-блоттинга для pSMAD для оценки эффективности блокирования активации SMAD, индуцированной TGFB1 (дополнительный рис.1D, E и F). Tgfbr1 shRNA # 6, наиболее эффективная в блокировании pSMAD, индуцированного TGFB1 (дополнительные рис. 1D, E и F), была субклонирована в вектор TGMP и использована для нацеливания на Tre-shTgfbr1 в кассету с самонаводством Cola1 (CHC ) в ESC, полученных от мышей TPO-Cre / LSL-Braf V600E / RIK / CHC , с использованием опосредованного рекомбинацией обмена кассет (Premsrirut et ​​al. 2011, Dow et ​​al. 2012). Подтверждено, что клоны ESC имеют единственную копию Tre-shTgfbr1 , нацеленную на CHC, были микроинъектированы в бластоцисты, полученные от мышей NCI C57BL / 6-cBrd / cBrd / Cr (C57BL / 6 albino), и имплантированы псевдобеременным CD-1 матерям. производство химерных щенков.Химерные детеныши были выведены для получения мышей TPO-Cre / RIK / Tre-shTgfbr1 и экспериментальных TPO-Cre / Braf V600E / RIK / Tre-shTgfbr1 ( Braf / shTβR1 ) животных, полученных путем скрещивания их с LSL-Braf V600E . Животных кормили кормом, пропитанным доксициклином (TD01306, Envigo), чтобы вызвать экспрессию shРНК Tgfbr1 , и соответствующий нокдаун Tgfbr1 подтверждали количественной ОТ-ПЦР.

Получение клеточных линий папиллярного рака щитовидной железы мыши

PTC из Braf , Braf / TβR1 и Braf / shTβR1 мышей собирали, промывали 1 × PBS, измельчали ​​и помещали в среду для переваривания (MEM с 112 ед. / мл коллагеназы типа I, 1.2 Ед / мл диспаз и ручка / стрептококк). Измельченные ткани инкубировали при 37 ° C в течение 45-60 минут, а затем дважды промывали Coon’s F12, содержащим 0,5% экстракт бычьего мозга (BBE) (Hammond Cell Tech) и пен / стреп / глутамин (PSG) (Gemini Bio Products). Клетки ресуспендировали в Coon’s F12, содержащем 0,5% BBE и PSG, а затем высевали в планшеты CellBind (Corning). После культивирования в течение 7-10 дней культуральную среду заменяли на питательную среду (Coon’s F12, содержащую 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Omega Scientific), 0,5% BBE и PSG).Клетки пассировали в течение не менее 1 месяца, и происхождение рака щитовидной железы подтверждалось экспрессией BRAF V600E перед использованием.

Реагенты

EW7197 (Vactosertib, каталожный номер S7530) и SD208 (каталожный номер S7530) были приобретены у SelleckChem. CH5126766 (CKI) был от Chugai Pharmaceutical Co. Фоллистатин был приобретен у Shenandoah Biotechnologies Inc. Нейтрализующее антитело 1D11 к TGFB1 и его изотипический контроль были получены из MSKCC MAB Core.

Для экспериментов in vivo CKI растворяли в 2-гидроксипропил-β-циклодекстрине и вводили один раз в день через желудочный зонд в дозе 3.0 мг / кг. EW7197 растворяли в составе искусственной желудочной жидкости (95 мМ HCl, 38 мМ NaCl и 3,6 мг / мл пепсина) и вводили один раз в день через желудочный зонд в дозе 25 мг / кг. Фоллистатин растворяли в стерильном H 2 O и вводили один раз в день внутрибрюшинно. инъекция в дозе 25 мкг / кг. Нейтрализующее антитело 1D11 к TGFB1 и изотипический контроль суспендировали в стерильном физиологическом растворе и вводили один раз каждые 2 дня в дозе 10 мг / кг.

Выделение РНК и количественная ОТ-ПЦР

Доли щитовидной железы были удалены хирургическим путем и немедленно помещены в жидкость N 2 .Клеточные линии соскабливали в PBS, один раз промывали PBS и осадок клеток использовали для выделения РНК. РНК выделяли с использованием TRIzol (Invitrogen) или RNAeasy (Affymetrix) и 100–500 нг подвергали обратной транскрипции с помощью SuperScript III (Invitrogen) в присутствии случайных гексамеров для создания кДНК. Количественная ПЦР с использованием кДНК в качестве матрицы была проведена с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и пар праймеров для мышей β-actin , Tgfbr1 , Tgfbr2 , Tshr , Tg , Nis , Tpo , Pax8 и Dusp5 (дополнительная таблица 1).Пороговые значения цикла для β-актина и целевых генов были определены с помощью прибора для ПЦР в реальном времени 7500 (Applied Biosystems) и использованы для расчета нормализованной относительной экспрессии β-актина с помощью программы QGENE (Tomas et ​​al. 2012) .

124 I ПЭТ-визуализация

Визуализацию выполняли с использованием сканера R4 microPET (Concorde Microsystems), как описано ранее (Chakravarty et ​​al. 2011, Nagarajah et ​​al. 2016). Вкратце, мышам вводили 2.6–3,5 МБк (70–94 мкКи) Na 124 I и были визуализированы через 24 и 72 часа при ингаляционной анестезии изофлураном при 1,5 л / мин. Данные в режиме списка были получены в течение 5 минут с использованием энергетического окна 250-750 кэВ и временного окна совпадений 6 нс, гистограммы в 2D-проекционные данные с помощью ребининга Фурье и восстановлены с помощью фильтрованной обратной проекции с использованием частоты отсечки, равной к частоте Найквиста. Визуализация и анализ изображений выполнялись с использованием программного обеспечения ASIPro VM (Concorde Microsystems) путем рисования трехмерного объема целевых поражений для определения концентраций активности в двух различных временных точках, которые, в свою очередь, использовались для расчета максимальной концентрации активности путем применения эмпирических данных. модель, как описано ранее (Jentzen et ​​al. 2008 г.). Концентрация активности была скорректирована с учетом эффектов частичного объема с использованием коэффициента восстановления, полученного из ранее проведенных фантомных исследований.

Иммуноокрашивание

Щитовидные железы мышей, выделенные из окружающих тканей, фиксировали в 4% параформальдегиде, заливали парафином, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Срезы также подвергали иммуноокрашиванию на CD45. H&E и IHC для CD45 были выполнены Центром молекулярной цитологии MSK.

Коиммунофлуоресцентное окрашивание для NIS и пан-кадгерина

Для иммунофлуоресцентного окрашивания срезы тканей депарафинизированы и проницаемы с 0.3% Triton подвергали индуцированному нагреванием извлечению эпитопа с использованием раствора для демаскировки антигена на основе цитрата при pH 6 (H-3300; Vector Laboratories). Срезы блокировали в PBS, содержащем 3% BSA и 10% нормальной ослиной сыворотки (017-000-121; Jackson Labs), и инкубировали с кроличьим антителом против SLC5A5 крысы (любезно предоставленным доктором Нэнси Карраско, Школа медицины Вандербильта), а затем с A647. меченые ослиные вторичные антитела против кроликов ({"type": "entrez-protein", "attrs": {"text": "A31573", "term_id": "87384", "term_text": "pir || A31573») }} A31573; Invitrogen) и последовательно окрашивали совместно с меченным A546 антителом к ​​пан-кадгерину (Sc-515872; Santa Cruz).Сканирование слайдов в Z-стопке производили с помощью сканера Pannoramic P250 Flash (3DHistech, Венгрия) с линзой объектива 20 × / 0,8NA. Затем были нарисованы интересующие области вокруг тканей, и изображения максимальной проекции были экспортированы в виде файлов .tif с помощью Caseviewer (3DHistech, Венгрия). Изображения анализировали с помощью ImageJ / FIJI (NIH, США), где для сегментации ядер в канале DAPI использовались пороговые значения и водораздел. Экспрессию NIS на плазматической мембране определяли путем установления порога канала A647 / A546 и количественного определения интенсивности флуоресценции совместной локализации на мембране и нормализации ее к количеству DAPI / клеток в срезах.

Вестерн-блоттинг

Клеточные линии рака щитовидной железы мыши помещали в планшеты CellBind в Coon’s F12 с 5% FBS, 0,5% BBE и PSG и инкубировали в течение 24–48 часов. Затем среду заменяли на Coon’s F12 с 0,1% BSA и PSG и инкубировали в течение 24–48 часов. Затем клетки промывали ледяным PBS и собирали соскабливанием и центрифугированием (1000 г в течение 4 минут при 4 ° C). Осадки клеток ресуспендировали в буфере для лизиса, состоящем из 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ ETDA, 4 мМ EGTA, 1% тритона × 100, коктейля ингибиторов протеазы (Sigma) и коктейля ингибиторов фосфатазы I и II (Sigma ).Клетки помещали на лед на 10 мин и лизировали, пропуская через наконечник p200. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (18000 г в течение 15 минут при 4 ° C) и собирали супернатант. Замороженные ткани помещали в буфер для лизиса и затем измельчали ​​в гомогенизаторе Polytron. Лизаты центрифугировали для удаления остатков (18000 г в течение 15 минут при 4 ° C) и собирали супернатант. Концентрацию белка для всех лизатов определяли с помощью набора MicroBCA (Thermo Fisher Scientific).От десяти до пятидесяти микрограммов белкового лизата подвергали SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембраны (VWR). Мембраны зондировали указанным антителом, и целевой белок определяли путем инкубации с видоспецифическими флуорофорами IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (Santa Cruz) или IRDye, а затем с реагентом ECL (Amersham Biosciences). Блоты с зондированием HRP были проявлены с использованием реагента ECL (Amersham Biosciences), а сигнал регистрировался с помощью рентгеновских пленок или с помощью KwikQuantTM Imager (http: // kindlebio.com / index.php). Блоты, обработанные IRDye, получали с помощью системы визуализации LICOR Odyssey (Licor Biosciences). Были использованы следующие антитела: от Cell Signaling pERK (9101), ERK (9102), pSMAD2 S465 / 467 (3101S) и Винкулин (13901S), от Sigma β-actin (A2228), от Santa Cruz SMAD2 / 3 ( sc-8332), от Thermofisher pSMAD2 S465 / 467 (44-244G), от Abcam pSMAD T8 ; от Novus NOX4 (NB110-58849). ImageJ использовался для количественной оценки плотности полос.

Наборы данных и оценка лигандов семейства TGFβ (TLS)

Наборы данных NCBI GEO для людей {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE29265", "term_id": "29265"}} GSE29265, {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE33630", "term_id": "33630"}} GSE33630 (Dom et ​​al. 2012, Томас и др. 2012) и были загружены {"type": "entrez-geo", "attrs": {"text": "GSE65144", "term_id": "65144"}} GSE65144 (von Roemeling et ​​al. 2015) и импортированы в комплекты Partek Genomic для нормализации и анализа экспрессии. Данные нормализованной экспрессии, полученные из RNAseq PTC в наборе данных THCA TCGA (Cancer Genome Atlas Research Network 2014), были получены из архива GDAC Firehose: http://gdac.broadinstitute.org/runs/stddata__2016_01_28/data/THCA/20160128/ gdac.broadinstitute.org_THCA.Merge_rnaseqv2__illuminahiseq_rnaseqv2__unc_edu__Level_3__RSEM_genes_normalized__data.Level_3.2016012800.0.0.tar.gz. Оценка лиганда семейства TGFβ представляет собой среднее log2-кратное изменение Tgfb1 , Tgfb2 , Tgfb3 , Inhba и Inhbb по сравнению со средним значением для всех образцов. Показатель транскрипционного выхода TGFβ определяли путем вычисления среднего кратного изменения для всех мРНК в наборе генов. Набор генов TGFβ состоял из генов, регулируемых TGFβ (Coulouarn et ​​al. 2008), которые также были активированы в мышиных BRAF V600E -PTC по сравнению с нормальной щитовидной железой и включали следующие мРНК: GNG13, HMGA2, MOSPD3, PCDh2, PDLIM7, PRG4, TGFBR1, TNK2, UBR2 ZIM и 6.

Статистический анализ

Статистическое программное обеспечение GraphPad-Prism (версия 8.0; GraphPad Software, Inc.) использовалось для анализа данных, вычисления коэффициентов корреляции Пирсона и вычисления значений P с использованием непарного двустороннего критерия Стьюдента t- тестов.Все данные для количественной ОТ-ПЦР, значений массива экспрессии Affy, количественной оценки иммунофлуоресцентного изображения и вестерн-блоттинга представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Результаты

Активация SMAD в BRAF

V600E - ПТК, управляемые , регулируются через MAPK

Чтобы определить, активирован ли путь TGFβ / SMAD в BRAF V600E -управляемый PTC in vivo, мы выполнили 9039AD с помощью программы Western pTC in vivo. блоты в опухолевых лизатах мышей TPO-Cre / LSL-Braf V600E , у которых к 5-недельному возрасту развивается рак щитовидной железы с высокой пенетрантностью (Franco et ​​al. 2011). Как показано в, было заметное увеличение pSMAD в BRAF V600E -PTCs по сравнению с нормальной щитовидной железой. Обработка мышей 1,5 мг / кг ингибитора MEK CH5126766 (CKI), который связывается с MEK и переводит его в неактивную конформацию, связанную с RAF (Ishii et ​​al. 2013), сильно блокирует передачу сигналов MAPK и снижает уровни pSMAD, поскольку а также экспрессия нижестоящей мишени TGFβ NOX4 () (Azouzi et ​​al. 2017). Ингибирование MEK также снижает уровни фосфо-SMAD T8 (), который, как было ранее показано, необходим для оптимальной передачи сигналов TGFβ в фолликулярных клетках щитовидной железы мышей (Knauf et ​​al. 2011). У людей PTC, управляемые BRAF V600E , имели повышенный транскрипционный выход SMAD по сравнению с нормальной щитовидной железой, который снижался при лечении ингибиторами RAF (2). Как было показано ранее, CKI увеличивает экспрессию генов, участвующих в биосинтезе гормонов щитовидной железы () (Nagarajah et ​​al. 2016). Следовательно, передача сигналов MAPK и pSMAD заметно увеличивается в PTC, управляемом онкогенным BRAF, и активность обоих этих путей зависит от MEK. Оба могут сходиться, чтобы нарушить дифференцированную функцию щитовидной железы раковых клеток, но их относительный вклад в эти эффекты не был установлен ().

Активация пути SMAD в PTC, индуцированных BRAF V600E . (A) Вестерн-блоттинг нормальных лизатов щитовидной железы и опухолей у мышей TPO-Cre / LSL-Braf V600E ( Braf ), зондированных антителами к указанным белкам. (B) Вестерн-блоттинг опухолевых тканей мышей Braf , получавших носитель или ингибитор MEK CKI127 (CKI), зондировал указанные мишени. Каждая дорожка соответствует отдельному мышиному PTC ( n = 4 на группу). (C) Показатели транскрипции TGFβ-SMAD нормальных тканей щитовидной железы по сравнению с образцами биопсии пациентов с RAI-резистентным раком щитовидной железы, взятыми до и во время лечения ингибиторами киназы RAF дабрафенибом (синий) или вемурафенибом (красный) в течение 2 недель.Каждая линия отображает результаты парной биопсии одного и того же поражения до и во время приема препарата. (D) Количественная RT-PCR маркеров дифференцировки щитовидной железы в опухолях из панели B. (E) Взаимодействие между путем MAPK и передачей сигналов TGFβ при раке щитовидной железы. Онкогенный BRAF индуцирует дедифференцировку частично посредством ERK-индуцированного подавления или инактивации клональных факторов транскрипции и путем вмешательства в индуцированную TSH передачу сигналов цАМФ (Mitsutake et ​​al. 2005) (не показано). BRAF V600E также увеличивает секрецию TGFB1 опухолевыми клетками, что приводит к нарушению SMAD трансактивации тироид-специфических генов с помощью клонального фактора транскрипции PAX8.Онкогенный BRAF также индуцирует фосфорилирование pERK по остатку T8 SMAD, способствуя его дополнительному фосфорилированию и активации рецептором TGFB1.

Роль TGFβ / SMAD в индуцированной BRAF

V600E дифференцировке щитовидной железы in vivo

Чтобы изучить роль TGFB1 в экспрессии генов, дифференцированных по щитовидной железе, при опухолях щитовидной железы мы сначала протестировали TGFB1-нейтрализующий MAB 1DBR1 и TGFB1-нейтрализующий MAB 1DBR1. Ингибитор киназы (TβR1) SD-208 в клеточных линиях, полученных из мышиного BRAF V600E -PTCs, где оба эффективно блокируют индуцированное TGFB1 фосфорилирование SMAD2 / 3 (дополнительный рис.1А). Для экспериментов in vivo мы решили протестировать антитело 1D11, поскольку SD-208 оказывает ингибирующее действие на другие киназы, помимо TβR1 (Tandon et ​​al. 2015). Обработка мышей схемой 1D11, которая, как известно, блокирует активность TGFB1 in vivo (Biswas et ​​al. 2011), не подавляла pSMAD в мышином BRAF V600E -PTC (дополнительный рисунок 1B) и не увеличивала поглощение радиоактивного йода ( Дополнительный рис. 1С). Поскольку это могло быть связано с PK антитела в опухоли, мы создали мышиные модели BRAF V600E -PTC с тироид-специфическим нокаутом гена TgfβR1 , TPO-Cre / LSL-Braf V600E / TβR1 fl / fl ( Braf / TβR1 ) или, чтобы избежать смешанных эффектов потери рецептора во время развития, посредством постнатальной dox-индуцируемой экспрессии кшРНК TβR1 .Мы проверили серию из TβR1 шпилек in vitro и выбрали TβR1 shRNA # 6 для создания модели мыши TPO-Cre / LSL-Braf V600E / TetO-GFP_shTβR1 / RIK 9039f (sh ) (и дополнительный рис. 1D, F). Пенетрантность и гистологические характеристики PTC у мышей Braf / TβR1 и Braf / shTβR1 неотличимы от таковых у мышей Braf (не показано). Несмотря на соответствующий нокдаун TβR1 любой из моделей (), уровни pSMAD оставались высокими в тканях рака щитовидной железы (), и не было значительного увеличения экспрессии маркеров дифференцировки щитовидной железы (дополнительный рис.1G). Используя клеточные линии, полученные из PTC мышей Braf / shTβR1 и Braf / TβR1 , мы обнаружили, что потеря TβR1 эффективно блокировала индуцированную TGFB1 активацию SMAD in vitro (). Мы пришли к выводу, что активация Smad в этом контексте in vivo была, по крайней мере, частично TβR1-независимой.

Нокаут TβR1 у мышей BRAF V600E -PTCs недостаточен для ингибирования активации SMAD in vivo . (A) Схематический дизайн трансгенных линий, используемых в этом исследовании, и их рекомбинации при скрещивании с мышами TPO-Cre : (1) Lsl-Braf V600E ; (2) TβR1 f / f и (3) tetO-shTβR1 / RIK .(B) -актин нормализованная экспрессия мРНК TβR1 в тканях щитовидной железы указанных линий мышей, как определено с помощью количественной ОТ-ПЦР ( n = 4 / группа). * P <0,05, ** P <0,005, нс = не значимо. (C) Вестерн-блоттинг для pSMAD и pERK в лизатах нормальной щитовидной железы или PTC от мышей Braf , Braf / TβR1 и Braf / shTβR1 мышей. (D) Вестерн-блоттинг клеточных линий, полученных из PTC мышей Braf , Braf / TβR1 и Braf / shTβR1 , обработанных носителем или 1 нг / мл TGFβ1 в течение 1 часа.Клетки, обработанные dox, инкубировали в течение 3 дней перед сбором.

Активины индуцируют SMAD при раке щитовидной железы, индуцированном BRAF

V600E

Отсутствие ингибирования SMAD путем блокирования TGFB1 или TGFBR1 in vivo предполагает, что другие лиганды семейства TGFβ могут участвовать в этом пути. Активины представляют собой гомодимеры или гетеродимеры с дисульфидной связью в основном двух β-субъединиц, βA и βB, которые транскрибируются с генов Inhba и Inhbb соответственно.Они активируют передачу сигналов SMAD2 / 3 через рецептор активина типа 1 ALK4. Данные массива экспрессии для нормальной щитовидной железы мышей и BRAF V600E -PTC показали, что экспрессия Inhbb увеличивается более чем в 15 раз по сравнению с <3-кратным увеличением в Tgfb1 (). В среднем ПТК человека имеют трех- или четырехкратную повышающую регуляцию мРНК лиганда семейства TGFβ, при этом INHBA , TGFB1 и INHBB являются наиболее заметными (и дополнительный рис. 2A).Анализ набора данных TCGA PTC обнаружил обратную корреляцию между экспрессией INHBA , INHBB , TGFB1 , TGFB2 или TGFB3 с показателем дифференциации щитовидной железы (TDS). Взаимная взаимосвязь с TDS была даже сильнее по сравнению с интегрированной оценкой лиганда TGFβ, охватывающей уровни экспрессии всех пяти членов семейства TGFβ ().

Блокировка как ALK4, так и ALK5 необходима для полного подавления активации SMAD в PTC, индуцированных Braf V600E .(A и B) Экспрессия лигандов семейства Tgfβ из экспрессионных массивов Affymetrix в (A) мыши и (B) нормальных щитовидной железе человека и PTC . (C) Коэффициент корреляции Пирсона между интегрированной оценкой лиганда семейства TGFβ (TLS) и TDS с использованием набора данных TCGA PTC (Сеть исследований атласа генома рака, 2014 г.). (D) Вестерн-блоттинг лизатов опухолей щитовидной железы от мышей Braf , получавших EW7197, и мышей Braf / TβR1 , получавших фоллистатин.

Обработка клеточных линий, полученных из ПТК Braf и Braf / TβR1 мыши активином AB, заметно индуцировала фосфорилирование SMAD.Следовательно, активация SMAD в клетках BRAF V600E -PTC может быть индуцирована через рецепторы TβR1 ( Alk5 ) или Acvr1b ( Alk4 ), которые блокируются двойным ингибитором ALK4 и ALK5 EW7197 (vacto ).

Для исследования роли активина и TGFB1 в активации SMAD in vivo , несущих опухоль мышей Braf и Braf / TβR1 лечили EW7197 или фоллистатином, мощным ингибитором нескольких лигандов семейства TGFβ (в первую очередь активина). и в меньшей степени BMP, миостатин и, возможно, TGFB3 - но не TGFB1 или 2) (Nogai et ​​al. 2008, Сеппорта и др. 2013). Обработка мышей Braf EW7197 или фоллистатином эффективно снижала pSMAD в PTC. Фоллистатин обладал более сильным ингибирующим действием на фосфорилирование SMAD в PTC от мышей Braf / TβR1 по сравнению с мышами Braf , что указывает на то, что и активин, и Tgfβ совместно регулируют этот путь в этих опухолях (2).

Для изучения роли SMAD в индуцированной BRAF V600E потере захвата йодида в PTC, мышей Braf лечили 10-дневным курсом EW7197 или фоллистатина.Количественное сканирование 124 I-PET было выполнено до терапии и на 7–10 дни (схема в). Монотерапия EW7197 или фоллистатином не влияла на 124 I поглощение в PTC мышей Braf или Braf / TβR1 . Соответственно, эти препараты не смогли восстановить экспрессию Nis или любого другого маркера дифференцировки щитовидной железы в PTC из любой мышиной модели ().

Совместное ингибирование ALK4 и 5 в сочетании с блокадой MAPK увеличивает поглощение 124 I у мышей Braf .(A) Схема экспериментов на мышах, тестирующих эффекты CKI и / или EW7197 или фоллистатина на включение 124 I в опухоли щитовидной железы из указанных моделей мышей. (B) Кратное изменение максимального поглощения 124 I у мышей Braf и Braf / TβR1 , получавших CKI, EW7197 или фоллистатин или указанные комбинации (* P <0,05, ** P <0,01 ). (C и D) Количественная RT-PCR (C) и вестерн-блоттинг (D) опухолевых тканей из B (собранных после второго исследования ПЭТ 124 I).(E) Иммунофлуоресцентное окрашивание на NIS и пан-кадгерин в опухолях мышей, обработанных, как указано в (A).

Затем мы исследовали, увеличивает ли ингибирование SMAD поглощение йодида, вызванное CKI. 124 I ПЭТ-визуализация выполнялась до и во время лечения только CKI или в комбинации с ингибиторами пути SMAD (). Лечение CKI вызывало большее увеличение поглощения 124 I у Braf / TβR1 по сравнению с Braf мышей (). EW7197, который глубоко ингибирует pSMAD в BRAF V600E -PTCs (), также усиливал эффекты CKI у мышей Braf .Соответственно, наблюдалась тенденция к более высокому потреблению йода у мышей Braf / TβR1 , получавших комбинацию фоллистатина и CKI, по сравнению с одним CKI. В совокупности комбинированная блокада ALK4 и ALK5 путем фармакологического нацеливания отдельно (EW7197) или в сочетании с генетической абляцией (фоллистатин + нокаут TβR1 ) взаимодействует с ингибированием MAPK для увеличения поглощения йода в Braf-мутантной PTC.

Сильное ингибирование pSMAD с помощью EW7197 у мышей Braf или фоллистатина у мышей Braf / TβR1 не увеличивало Nis , Tpo , Tg или Pax8 уровней мРНК влияние на поглощение йодида ().Напротив, лечение CKI заметно увеличивало все четыре маркера. Когда CKI был объединен с EW7197, наблюдалась тенденция к увеличению мРНК Nis и Tshr . CKI восстанавливал белок NIS до уровней, приближающихся к уровням, наблюдаемым в нормальной щитовидной железе, но добавление EW7197 не приводило к дальнейшему увеличению (и дополнительному рисунку 3A). Было показано, что TGFβ блокирует рекрутирование иммунных клеток в микроокружение опухоли (Tauriello et ​​al. 2018). Обработка мышей Braf EW7197 или CKI + EW7197 не увеличивала инфильтрацию клеток CD45 + (дополнительный рис.3B), что указывает на то, что снижение чистоты опухолевых клеток вряд ли может быть связано с отсутствием четкого увеличения маркеров дифференцировки щитовидной железы в экстрактах тканей. Было показано, что активация SMAD снижает локализацию NIS на плазматической мембране за счет активации NOX4 (Azouzi et ​​al. 2017). Мы проверили это с помощью IHC для NIS в опухолях от мышей Braf , получавших носитель, CKI или CKI + EW7197. CKI заметно увеличивал NIS, локализованный в мембране, по сравнению с носителем, который не был дополнительно усилен комбинацией CKI + EW7197 (и дополнительный рис.3С).

Обсуждение

PTC, управляемые BRAF V600E , имеют более высокую частоту узловых рецидивов и обычно не поддаются лечению RAI (Никифорова и др. 2003, Elisei и др. 2008, Xing и др. 2013 ). Они также чрезмерно представлены среди пациентов с метастазами, положительными на ФДГ-ПЭТ (Ricarte-Filho, и др., , 2009). Относительная устойчивость к 131 I объясняется нарушением экспрессии NIS и других тироид-специфических генов, необходимых для включения йода в клетки щитовидной железы (1; 2).Для объяснения этих эффектов было предложено множество механизмов, которые не исключают друг друга: (1) активация BRAF ингибирует экспрессию PAX8, фактора транскрипции парных доменов, который регулирует транскрипцию NIS и других генов, специфичных для щитовидной железы. (2) NKX2-1, фактор транскрипции, необходимый для экспрессии генов, дифференцированных в щитовидной железе, фосфорилируется ERK, что нарушает его способность трансактивировать гены-мишени (Missero et ​​al. 2000). (3) Экспрессия BRAF V600E увеличивает секрецию TGFB1 в клетках щитовидной железы крыс PCCL3, создавая аутокринную петлю, которая активирует SMAD (Riesco-Eizaguirre et ​​al. 2009), которые, в свою очередь, связываются с PAX8 и нарушают его трансактивацию промотора гена Nis (Costamagna et ​​al. 2004). Эта индукция аутокринной петли TGFB1 с помощью BRAF V600E в клетках PCCL3, как было показано, не зависит от MEK (Riesco-Eizaguirre et ​​al. 2009).

Целью этого исследования было определение роли пути передачи сигналов TGFβ в дифференцировке щитовидной железы в генетически точных моделях рака щитовидной железы, индуцированного BRAF V600E in vivo .Мы обнаружили, что фосфорилирование SMAD индуцировалось в мышином BRAF V600E -PTC, и что сигнатура транскрипционного выхода TGFβ присутствовала при распространенном RAI-резистентном человеческом BRAF-мутантном раке щитовидной железы. Мы использовали фармакологические и генетические подходы для нацеливания передачи сигналов TGFβ на мышиных моделях и обнаружили, что любой из подходов эффективно блокирует передачу сигналов TGFβ в клеточных линиях, полученных из мышиного BRAF V600 -PTCs, но не смог этого сделать in vivo . Мы обнаружили, что другие лиганды в семействе TGFβ активируют SMAD in vivo , что подтверждается данными о заметной повышающей регуляции Inhbb в BRAF V600E -PTC.Соответственно, фосфорилирование SMAD ингибировалось в PTC фоллистатином, ингибитором активина. Однако фоллистатин был способен полностью блокировать активацию pSMAD только у мышей с тироцит-специфическим генетическим устранением TβR1, что указывает на то, что как активин, так и TGFβ играют роль в активации SMAD, причем активин является доминирующим. Таким образом, мы выбрали ингибитор ALK4 / 5 EW7197 для изучения роли активации SMAD в поглощении йодида в мышиных ПТК, управляемых BRAF V600E , что привело к выводу, что сильного ингибирования SMAD недостаточно для восстановления экспрессии генов, участвующих в производство гормонов щитовидной железы или поглощение йодида.

Ранее мы показали, что как клетки BRAF V600E -PTC, так и ассоциированные с опухолью макрофаги вносят вклад TGFB1 в микросреду опухоли (Knauf et ​​al. 2011). RNAseq сортированных по потоку клеток PTC из модели TPO-Cre / LsL-Braf V600E , использованной в этой статье, показало, что уровни мРНК Tgfb1 и активина выше в клетках BRAF V600E -PTC по сравнению с нормальными клетками щитовидной железы. фолликулярные клетки (не показаны). Мы не знаем, какие типы клеток, кроме клеток BRAF V600E -PTC, вносят вклад во внутриопухолевый пул активина.

Мощная блокада пути MAPK способствует повторной дифференцировке и увеличению поглощения йодида при раке щитовидной железы, вызванном BRAF V600E (Nagarajah et ​​al. 2016). Здесь мы показываем, что это связано со снижением активации SMAD, что, вероятно, связано со снижением ERK-зависимого фосфорилирования остатка треонина 8 в SMAD. Фосфорилирование в этом сайте с помощью MAPK усиливает активацию SMAD связанными с лигандом рецепторами семейства TGFβ (Wrighton et ​​al. 2009, Knauf et ​​al. 2011). Эти конвергентные эффекты на SMAD могут объяснять увеличение поглощения йодида у мышей Braf, получавших комбинацию EW7197 и CKI, по сравнению с одним CKI. Однако активация MAPK подавляет программу дифференцировки в основном через SMAD-независимые механизмы, поскольку сильное ингибирование SMAD не может восстановить экспрессию генов, дифференцированных по щитовидной железе, в условиях постоянной активации пути MAPK. Это, вероятно, объясняет, почему комбинация лечения привела только к тенденции к увеличению мРНК Nis и Tshr по сравнению с только ингибированием MEK.

Таким образом, активация пути MAPK с помощью BRAF V600E способствует активации SMAD in vivo через TGFβ и пути, индуцированные активином. Повышенная экспрессия TGFβ и лигандов активина обычна в ПТК, и это обратно коррелирует с интегрированной оценкой транскрипционного выхода, связанной с дифференцировкой щитовидной железы. Было показано, что индуцированная TGFβ передача сигналов через SMAD подавляет экспрессию NIS и других маркеров дифференцировки щитовидной железы в клетках щитовидной железы BRAF-WT (Colletta et ​​al. 1989, Nicolussi et ​​al. 2003, Costamagna et ​​al. 2004). Однако передача сигналов через SMAD не является основным механизмом подавления экспрессии тироид-специфических генов или потери захвата йодида в контексте активации MAPK in vivo , поскольку только ингибирование SMAD не улучшает ни один из этих биомаркеров. Точный механизм, лежащий в основе аддитивного эффекта ингибирования SMAD и MEK на захват йодида, неясен. Это не было связано с четкими различиями в экспрессии NIS.Обилие NIS и локализация на мембране - это лишь некоторые из переменных, которые влияют на включение йодида (другие включают организацию йодида и отток йодида, которые мы не оценивали).

Увеличение поглощения йода может отражать тесное взаимодействие между этими двумя путями, которые взаимно усиливают перекрывающиеся эффекты на тироид-дифференцированное состояние во время динамических изменений в их соответствующих сигнальных выходах. Переводное значение этих открытий интригует и до сих пор не исследовано.Любые клинические испытания, изучающие синергетические эффекты блокирования путей SMAD и MAPK, должны выбрать агенты, которые нацелены как на ALK4, так и на ALK5, и рассмотреть возможность их использования в течение коротких интервалов времени из-за потенциальных опухолевых эффектов ингибирования SMAD при раке.

Заявление об интересах

JAF - консультант Loxo Oncology, получивший грантовую поддержку от Eisai, и соавтор интеллектуальной собственности, посвященной HRAS как биомаркеру для лечения рака с использованием типифарниба, лицензированного MSK для Kura.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США RO1-CA50706-23 (JAF), R01-CA 249663-01A1 (JAF, ALH), RO1-CA184724-01A1 (ALH, JAF), P50-CA 172012-01 (JAF) и P30-CA008748 / CA / NCI (Craig Thompson PI), Cycle for Survival (ALH), фонд Джейма и Питера Флауэрса, фонд Фрэнка Д. Коэна, Cycle for Survival и трансляционные исследования Программа обучения онкологии 5T32CA160001 (MS).

Дополнительный материал

Дополнительная таблица 1: Список использованных грунтовок. Supp Рис. 1: Нацеливание на передачу сигналов Tgfβ в BRAFV600E-индуцированных PTC. A) Вестерн-блоттинг белковых лизатов из линии клеток, полученных из BrafV600EPTC, инкубированных в бессывороточной среде в течение 24 часов, а затем обработанных TGFβ1 в течение 1 часа в отсутствие или в присутствии блокирующего TGFβ1 антитела 1D11 или ингибитора киназы TGFβR1 SD208 (1 мкМ ). B, C) Эффект блокады TGFβ1 на активацию SMAD и включение 124I in vivo. Мышам Braf вводили антитело IgGor 1D11 изотипического контроля один раз каждые 2 дня в течение 14 дней.B) Вестерн-блоттинг лизатов PTC, собранных на 14 день, с указанными антителами. C) Поглощение 124I щитовидной железой (% ID / г ± SEM) у мышей Brafmice до и после лечения с помощью 1D11 или изотипического контроля. Поглощение 124I измеряли с помощью микро-ПЭТ через 24 часа после введения 124I до и после 14 дней лечения. Каждая когорта состояла из 4 мышей. D, E) Скрининг эффективности нокдауна shRNAsto TgfβR1 (D) и TgfβR2 (E) в клетках Braf-PTC мыши. Вверху: количественная ОТ-ПЦР, проведенная в трех экземплярах. Внизу: Вестерн-блоттинг клеток, обработанных pSMAD TGFβ1.F) Сравнение TgfβR1 и TgfβR2shRNAson TGFβ1-индуцированной активации SMAD в клетках Braf-PTC. G) Количественная RT-PCR маркеров дифференцировки щитовидной железы в PTC от мышей Braf, Braf / TβR1 и Braf / shTβR1. Четыре ткани щитовидной железы мышей каждого генотипа анализировали в трех повторностях. Непарный t-критерий с поправкой Велча: * p <0,05, ** p <0,01 по сравнению с Brafmice. Supp. Рис. 3. Количественная оценка уровней белка NIS в вестерн-блотах мышей Braf, обработанных CKI и EW7197. A) Столбцы представляют собой среднюю винкулиннормированную экспрессию NIS ± SEM из вестерн-блотов, показанных на фиг. 4E.B) Иммуногистохимия для CD45 в PTC от Brafmice, обработанных носителем, CKI или CKI + EW7197. C) Мембранная экспрессия NIS (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) при коиммунофлуоресцентном окрашивании на фиг. 4F. * p <0,05, ** p <0,002:

Благодарности

Авторы благодарят доктора Йосуке Мукояма (Национальный институт сердца, легких и крови, США) за мышей Tgfbr1-flox, доктора Сиоко Кимура (Национальный институт рака, США). MD, США) для мышей Tpo-Cre и д-р Катрин Притчард (Университет Лестера, Великобритания) для мышей LSL-BrafV600E / +.Также выражаем благодарность Исследовательскому центру ресурсов животных, отделам молекулярной цитологии и визуализации мелких животных Института Слоуна Кеттеринга за их поддержку.

Ссылки

  • Azouzi N, Cailloux J, Cazarin JM, Knauf JA, Cracchiolo J, Al GA, Hartl D, Polak M, Carre A, El MM и др. 2017 г. НАДФН-оксидаза NOX4 является критическим медиатором индуцированного BRAF (V600E) подавления натрий / йодидного симпортера при папиллярной карциноме щитовидной железы. Антиоксиданты и редокс-сигналы 26 год 864–877.(10.1089 / ars.2015.6616) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Бисвас С., Найман Дж. С., Альварес Дж., Чакрабарти А., Эйрес А., Стерлинг Дж., Эдвардс Дж., Рана Т., Джонсон Р. , Перриен Д.С. и др. 2011 г. Лечение ss-антителами против трансформирующего фактора роста восстанавливает потерю костной массы и предотвращает метастазирование рака груди в кости. PLoS ONE 6 e27090. (10.1371 / journal.pone.0027090) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Сеть исследований атласа генома рака, 2014 г. Комплексная геномная характеристика папиллярной карциномы щитовидной железы.Клетка 159 676–690. (10.1016 / j.cell.2014.09.050) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Chakravarty D, Santos E, Ryder M, Knauf JA, Liao XH, West BL, Bollag G, Kolesnick R, тонкий TH, Rosen Net al. 2011 г. Низкомолекулярные ингибиторы MAPK восстанавливают включение радиоактивного йода при раке щитовидной железы мышей с условной активацией BRAF. Журнал клинических исследований 121 4700–4711. (10.1172 / JCI46382) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Colletta G, Cirafici AM, Di Carlo A.1989 г. Двойной эффект трансформирующего фактора роста бета на клетки щитовидной железы крыс: ингибирование пролиферации, индуцированной тиреотропином, и снижение маркеров дифференцировки, специфичных для щитовидной железы. Исследования рака 49 3457–3462. [PubMed] [Google Scholar]
  • Costamagna E, Garcia B, Santisteban P.2004. Функциональное взаимодействие между парным доменом фактора транскрипции Pax8 и Smad3 участвует в трансформации репрессии фактора роста-бета гена симпортера натрия / йодида. Журнал биологической химии 279 3439–3446.(10.1074 / jbc.M307138200) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Coulouarn C, Factor VM, Thorgeirsson SS.2008. Преобразование сигнатуры экспрессии гена фактора роста-бета в гепатоцитах мышей позволяет прогнозировать клинический исход рака человека. Гепатология 47 2059–2067. (10.1002 / hep.22283) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Dom G, Tarabichi M, Unger K, Thomas G, Oczko-Wojciechowska M, Bogdanova T, Jarzab B., Dumont JE, Объезды V, Maenhaut C.2012. Сигнатура экспрессии гена позволяет отличить нормальные ткани спорадической и радиационно-индуцированной папиллярной карциномы щитовидной железы.Британский журнал рака 107 994–1000. (10.1038 / bjc.2012.302) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Dow LE, Premsrirut PK, Zuber J, Fellmann C, McJunkin K, Miething C, Park Y, Dickins RA, Hannon GJ , Лоу С.В., 2012. Пайплайн для создания трансгенных мышей shRNA. Протоколы природы 7 374–393. (10.1038 / nprot.2011.446) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Dunn LA, Sherman EJ, Baxi SS, Tchekmedyian V, Grewal RK, Larson SM, Pentlow KS, Haque S, Tuttle RM , Сабра М.М. и др.2019. Редифференцировка вемурафенибом мутантного BRAF, резистентного к RAI раку щитовидной железы. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 104 1417–1428. (10.1210 / jc.2018-01478) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Elisei R, Ugolini C, Viola D, Lupi C, Biagini A, Giannini R, Romei C, Miccoli P, Пинчера А., Басоло Ф, 2008. Мутация BRAF (V600E) и исходы у пациентов с папиллярной карциномой щитовидной железы: среднее последующее исследование в течение 15 лет. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 93 3943–3949.(10.1210 / jc.2008-0607) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Fagin JA, Wells Jr SA, 2016. Биологические и клинические перспективы рака щитовидной железы. Медицинский журнал Новой Англии 375 2307. (10.1056 / NEJMc1613118) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Franco AT, Malaguarnera R, Refetoff S, Liao XH, Lundsmith E, Kimura S, Pritchard C, Marais R, Davies TF, Weinstein LSet al . 2011 г. Зависимость передачи сигналов рецептора тиротрофина от Braf-индуцированной инициации опухоли щитовидной железы у мышей. PNAS 108 1615–1620.(10.1073 / pnas.1015557108) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ho AL, Grewal RK, Leboeuf R, Sherman EJ, Pfister DG, Deandreis D, Pentlow KS, Zanzonico PB, Haque S , Gavane Set al. 2013. Селуметиниб увеличивает поглощение радиоактивного йода при распространенном раке щитовидной железы. Медицинский журнал Новой Англии 368 623–632. (10.1056 / NEJMoa1209288) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Исии Н., Харада Н., Джозеф Э. У., Охара К., Миура Т., Сакамото Х., Мацуда Й, Томии Й, Тачибана-Кондо Ю. , Иикура Хет др.2013. Усиленное ингибирование передачи сигналов ERK новым аллостерическим ингибитором MEK, CH5126766, который подавляет реактивацию обратной связи активности RAF. Исследования рака 73 4050–4060. (10.1158 / 0008-5472.CAN-12-3937) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Джентцен В., Фройденберг Л., Эйзинг Э. Г., Зонненшайн В., Кност Дж., Бокиш А. 2008. Оптимизированный протокол дозиметрии 124I ПЭТ для радиойодтерапии дифференцированного рака щитовидной железы. Журнал ядерной медицины 49 1017–1023. (10.2967 / jnumed.107.047159) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Kavsak P, Rasmussen RK, Causing CG, Bonni S, Zhu H, Thomsen GH, Wrana JL.2000. Smad7 связывается с Smurf2 с образованием убиквитинлигазы E3, которая нацелена на бета-рецептор TGF для деградации. Молекулярная клетка 6 1365–1375. (10.1016 / s1097-2765 (0000134-9) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Knauf JA, Kuroda H, Basu S, Fagin JA, 2003. RET / PTC-индуцированная дедифференцировка клеток щитовидной железы опосредуется посредством передачи сигналов Y1062 через киназу SHC-RAS-MAP.Онкоген 22 4406–4412. (10.1038 / sj.onc.1206602) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Knauf JA, Sartor MA, Medvedovic M, Lundsmith E, Ryder M, Salzano M, Nikiforov YE, Giordano TJ, Ghossein RA, Fagin JA .2011. Прогрессирование BRAF-индуцированного рака щитовидной железы связано с эпителиально-мезенхимальным переходом, требующим сопутствующей передачи сигналов MAP-киназы и TGFbeta. Онкоген 30 3153–3162. (10.1038 / onc.2011.44) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Кусакабэ Т., Кавагути А., Кавагути Р., Фейгенбаум Л., Кимура С.2004 г. Тироцит-специфическая экспрессия рекомбиназы Cre у трансгенных мышей. Бытие 39 212–216. (10.1002 / gene.20043) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ларссон Дж., Бланк Ю., Хельгадоттир Х., Бьорнссон Дж. М., Эхингер М., Гуманс М. Дж., Фан Х, Левин П., Карлссон S.2003. Гемопоэтические стволовые клетки с дефицитом передачи сигналов TGF-бета обладают нормальной самообновляющейся и регенеративной способностью in vivo, несмотря на повышенную пролиферативную способность in vitro. Кровь 102 3129–3135. (10.1182 / blood-2003-04-1300) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Лю Д., Ху С., Хоу П, Цзян Д., Кондурис С., Син М.2007 г. Подавление пути киназы BRAF / MEK / MAP восстанавливает экспрессию генов, метаболизирующих йодид, в клетках щитовидной железы, экспрессирующих мутант V600E BRAF. Клинические исследования рака 13 1341–1349. (10.1158 / 1078-0432.CCR-06-1753) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Mercer K, Giblett S, Green S, Lloyd D, DaRocha Dias S, Plumb M, Marais R, Pritchard C. 2005 г. Экспрессия эндогенного онкогенного V600EB-raf вызывает дефекты пролиферации и развития у мышей и трансформацию первичных фибробластов.Исследования рака 65 11493–11500. (10.1158 / 0008-5472.CAN-05-2211) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Missero C, Pirro MT, Di Lauro R.2000. Множественные нисходящие пути ras опосредуют функциональную репрессию продукта гена гомеобокса TTF-1. Молекулярная и клеточная биология 20 2783–2793. (10.1128 / mcb.20.8.2783-2793.2000) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мицутаке Н., Кнауф Дж. А., Мицутаке С., Меса-младший С., Чжан Л., Фэгин Дж. 2005. Условная экспрессия BRAFV600E вызывает синтез ДНК, апоптоз, дедифференцировку и хромосомную нестабильность в клетках PCCL3 щитовидной железы.Исследования рака 65 2465–2473. (10.1158 / 0008-5472.CAN-04-3314) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Nagarajah J, Le M, Knauf JA, Ferrandino G, Montero-Conde C, Pillarsetty N, Bolaender A, Irwin C. , Krishnamoorthy GP, Saqcena Met al. 2016 г. Устойчивое ингибирование ERK максимизирует реакцию рака щитовидной железы BrafV600E на радиоактивный йод. Журнал клинических исследований 126 4119–4124. (10.1172 / JCI89067) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Nicolussi A, D'Inzeo S, Santulli M, Colletta G, Coppa A.2003 г. TGF-бета контроль дифференцировки фолликулярных клеток щитовидной железы крыс. Молекулярная и клеточная эндокринология 207 1–11. (10.1016 / s0303-7207 (0300238-7) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Никифорова М.Н., Кимура Е.Т., Ганди М., Биддингер П.В., Кнауф Д.А., Басоло Ф., Чжу Зи, Джаннини Р., Сальваторе Дж., Fusco Aet al. 2003 г. Мутации BRAF в опухолях щитовидной железы ограничиваются папиллярными карциномами и анапластическими или низкодифференцированными карциномами, возникающими из папиллярных карцином. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 88 5399–5404.(10.1210 / jc.2003-030838) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Nogai H, Rosowski M, Grun J, Rietz A, Debus N, Schmidt G, Lauster C, Janitz M, Vortkamp A, Lauster R .2008. Фоллистатин противодействует индуцированному трансформирующим фактором роста-бета3 эпителиально-мезенхимальному переходу in vitro: последствия для развития неба у мышей подтверждены анализом на микроматрицах. Дифференциация: исследования биологического разнообразия 76 404–416. (10.1111 / j.1432-0436.2007.00223.x) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Pelossof R, Fairchild L, Huang CH, Widmer C, Sreedharan VT, Sinha N, Lai DY, Guan Y, Premsrirut PK, Tschaharganeh DFet al.2017 г. Прогнозирование мощных shRNA с последовательным алгоритмом классификации. Природа Биотехнологии 35 год 350–353. (10.1038 / nbt.3807) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Premsrirut PK, Dow LE, Kim SY, Camiolo M, Malone CD, Miething C, Scuoppo C, Zuber J, Dickins RA , Коган СЦ и др. 2011 г. Быстрая и масштабируемая система для изучения функции генов у мышей с использованием условной РНК-интерференции. Клетка 145 145–158. (10.1016 / j.cell.2011.03.012) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ricarte-Filho JC, Ryder M, Chitale DA, Rivera M, Heguy A, Ladanyi M, Janakiraman M , Solit D, Knauf JA, Tuttle RM и др.2009 г. Мутационный профиль распространенного первичного и метастатического радиоактивного йодорезистентного рака щитовидной железы выявляет различные патогенетические роли BRAF, PIK3CA и AKT1. Исследования рака 69 4885–4893. (10.1158 / 0008-5472.CAN-09-0727) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Riesco-Eizaguirre G, Rodríguez I, De la Vieja A, Costamagna E, Carrasco N, Nistal М, Сантистебан П. 2009. Онкоген BRAFV600E индуцирует секрецию трансформирующего фактора роста бета, что приводит к репрессии симпортера йодида натрия и увеличению злокачественности при раке щитовидной железы.Исследования рака 69 8317–8325. (10.1158 / 0008-5472.CAN-09-1248) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Rothenberg SM, Daniels GH, Wirth LJ.2015. Повторная дифференцировка метастатического папиллярного рака щитовидной железы, резистентного к йоду, BRAF V600E с дабрафениб-ответом. Клинические исследования рака 21 год 5640–5641. (10.1158 / 1078-0432.CCR-15-2298) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Sepporta MV, Tumminello FM, Flandina C, Crescimanno M, Giammanco M, La Guardia M, di Majo D, Leto G .2013.Фоллистатин как потенциальная терапевтическая мишень при раке простаты. Таргетированная онкология 8 215–223. (10.1007 / s11523-013-0268-7) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Тандон М., Саламун Дж. М., Кардер Е. Дж., Фарбер Е., Сюй С., Дэн Ф, Тан Х, Випф П., Ван Ц. Дж. 2015 г. SD-208, новый ингибитор протеинкиназы D, блокирует пролиферацию клеток рака простаты и рост опухоли in vivo, вызывая остановку клеточного цикла G2 / M. PLoS ONE 10 e0119346. (10.1371 / journal.pone.0119346) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Tauriello DVF, Palomo-Ponce S, Stork D, Berenguer-Llergo A, Badia-Ramentol J, Iglesias M, Sevillano M, Ibiza S, Canellas A, Hernando-Momblona Xet al.2018. TGFbeta вызывает ускользание от иммунной системы при метастазах рака толстой кишки, реконструированных генетически. Природа 554 538–543. (10.1038 / nature25492) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Tomas G, Tarabichi M, Gacquer D, Hebrant A, Dom G, Dumont JE, Keutgen X, Fahey TJ, Maenhaut C, Detours V.2012. Общий метод получения надежных индексов дифференцировки на основе экспрессии органоспецифических генов: приложение для диагностики рака щитовидной железы. Онкоген 31 год 4490–4498. (10.1038 / onc.2011.626) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • von Roemeling CA, Marlow LA, Pinkerton AB, Crist A, Miller J, Tun HW, Smallridge RC, Copland JA.2015 г. Аберрантный липидный метаболизм при анапластической карциноме щитовидной железы показывает, что стеароил-КоА-десатураза 1 является новой терапевтической мишенью. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 100 E697 – E709. (10.1210 / jc.2014-2764) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Wrighton KH, Lin X, Feng XH, 2009. Фосфоконтроль передачи сигналов суперсемейства TGF-бета. Клеточные исследования 19 8–20. (10.1038 / cr.2008.327) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Xing M, Westra WH, Tufano RP, Cohen Y, Rosenbaum E, Rhoden KJ, Carson KA, Vasko V, Larin A , Таллини Get al.2005 г. Мутация BRAF предсказывает худший клинический прогноз папиллярного рака щитовидной железы. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма 90 6373–6379. (10.1210 / jc.2005-0987) [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Xing M, Alzahrani AS, Carson KA, Viola D, Elisei R, Bendlova B, Yip L, Mian C, Vianello F, Tuttle RMet al. 2013. Связь между мутацией BRAF V600E и смертностью у пациентов с папиллярным раком щитовидной железы. JAMA 309 1493–1501. (10.1001 / jama.2013.3190) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Yao Z, Torres NM, Tao A, Gao Y, Luo L, Li Q, de Stanchina E, Abdel-Wahab O , Solit DB, Poulikakos PIet al.2015 г. Мутанты BRAF уклоняются от ERK-зависимой обратной связи с помощью различных механизмов, которые определяют их чувствительность к фармакологическому ингибированию. Раковая клетка 28 год 370–383. (10.1016 / j.ccell.2015.08.001) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

CD300b регулирует фагоцитоз апоптотических клеток посредством распознавания фосфатидилсерина

Клетки и антитела

L929 или HEK293 Клетки J774.1 культивировали в среде DMEM с 10% FBS. Антитело против CD300b мыши и козий IgG изотипического контроля были получены от R&D (Миннеаполис, Миннесота, США) и были помечены Alexa488 с использованием набора для маркировки моноклональных антител Alexa488 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) в соответствии с инструкциями производителя.Тег Anti-cMyc (9B11), anti-Akt, anti-pAkt (D9E), anti-pSyk, anti-Syk, anti-pErk (3A7), anti-Erk, anti-pPI3K (Y199) и антителами p85 были получены от Cell Сигнальные технологии (Данверс, Массачусетс, США). Антитело против cMyc (9E10) и вторичные антитела, конъюгированные с HRP (козлиные антикроличьи и козьи антимышиные), были получены от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния, США). Антитело против CD16 / CD32 мыши (93) было от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния, США). Специфические антитела к фрагменту Fc γ человеческого IgG были получены от Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA).

Реагенты ДНК

Для экспрессионных конструкций лентивирусов CD300b, DAP10 и DAP12 продукты ПЦР клонировали в вектор pCDH-EF1-T2A-puro (pCDH) (System Biosciences, Mountain View, CA, USA), используя EcoRI и сайты NotI; Тег cMyc добавляли на С-конец конструкций CD300b, если не указано иное. Замена тирозина на фенилаланин в мотиве активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM) в цитоплазматическом домене DAP12 (DAP12m) была получена путем сайт-направленного мутагенеза с использованием набора QuickChange Mutagenesis Kit (Stratagene, Санта-Клара, Калифорния, США), согласно инструкции производителя.Конструкции для Fc-части человеческого IgG1, слитые с CD300b (CD300b-Fc), CD300f (CD300f-Fc) или контрольным белком, NITR (NITR-Fc), внеклеточными доменами в скелете pcDNA были любезно предоставлены доктором Джоном П. Кэнноном. . 24 Конструкции для мышиного TIM1 или TIM4 в ретровирусном векторе pMX были любезно предоставлены доктором Шигеказу Нагата. 12 Вектор лентивирусной короткой шпилечной (sh) РНК против CD300b и контрольный вектор shРНК были приобретены в Santa Cruz Biotechnology.

Трансфекция и инфицирование клеток

Клетки HEK293T трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen).Лентивирусные частицы получали путем котрансфекции клеток HEK293T экспрессирующими векторами pCDH-puro или shRNA и вспомогательными плазмидами psPAX2 и pMD2G. Заражение клеток L929, J774.1 и Ba / F3 проводили путем инкубации клеток с лентивирусом в течение 24 ч при 37 ° C в присутствии 6 мкг мкг / мл сульфата протамина. Селекцию пуромицином (20 мкг, мкг / мл для L929 и 6 мкл мкг / мл для клеток J774) начинали через 48 часов после заражения. Клетки L929, экспрессирующие эквивалентные количества CD300b, клонировали с использованием метода предельного разведения.

Химерные белки

Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами pcDNA3.0, кодирующими конструкции CD300b-Fc, CD300f-Fc и NITR-Fc, с использованием липофектамина 2000, как описано выше. Через 48 часов после трансфекции собирали культуральный супернатант, содержащий химерные белки, и очищали слитые с Fc белки с использованием колонок Fast Flow с протеином A-сефарозой (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL, США). Экспрессию и чистоту белка подтверждали окрашиванием коллоидным кумасси синим и электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле с последующим вестерн-блоттингом.Белок TIM1, меченный His, был получен от R&D systems.

Получение липосом, содержащих фосфолипиды, и шариков, покрытых липосомами

1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1-пальмитоил-2-олеоил- sn - 3-фосфоэтаноламин (POPE), 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3-фосфо-L-серин (POPS), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1 , 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфосерин (DOPS), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) были от Avanti Polar Lipids (Алабастер, Алабастер, США).Триэтиламмониевая соль N- (биотиноил) -1,2-дигексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (меченый биотином DHPE) была получена от Invitrogen. Липосомы получали путем полного испарения хлороформа из желаемой смеси фосфолипидов с газообразным аргоном. Большие многослойные везикулы образовывались при перемешивании в дегазированном PBS (pH 7,4). Однослойные везикулы получали экструзией через фильтры с размером пор 100 нм с использованием мини-экструдера Avanti (Avanti Polar Lipids). Состав липосом был 80% DOPC: 20% POPC (PC), POPS (PS) или POPE (PE).Размер липосом был подтвержден как приблизительно 100 нм методом динамического рассеяния света (DLS). 49 Для экспериментов с использованием гранул, покрытых липосомами, липидный состав был 49% ДОФХ: 50% ДОФС: 1% меченого биотином ДОФЭ. Покрытые стрептавидином M-280 Dynabeads (Invitrogen) сначала предварительно инкубировали в PBS с 1% BSA (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) при 37 ° C в течение 2 часов, затем смешивали с липосомами в течение 2 часов при 37 ° C. C в дегазированном PBS с 1% BSA с последующими двумя стадиями промывки и повторным суспендированием в том же буфере.Присутствие PS на шариках подтверждали окрашиванием аннексином V-APC и анализом проточной цитометрии. Липосомы и покрытые липосомами шарики хранили в газообразном аргоне для предотвращения окисления липидов.

Анализ фагоцитоза

Апоптотические тимоциты были получены путем инкубации клеток при 37 ° C в течение 6 часов с 10 мкг M дексаметазона (Sigma), при этом по крайней мере 80% клеток были аннексином V + . Апоптозные клетки метили TFL-4 (Oncoimmunin Inc., Гейтерсбург, Мэриленд, США) или pHrodo (Invitrogen) и добавляли к фагоцитам в соотношении 1: 4 или 1:15, как указано в тексте.После инкубации фагоциты промывали, обрабатывали трипсином / ЭДТА, фиксировали и анализировали с помощью проточной цитометрии или визуализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии LSM710 (Carl Zeiss, Торнвуд, Нью-Йорк, США). Для экспериментов с использованием тимоцитов, меченных pHrodo, для микроскопического анализа или анализа проточной цитометрии, клетки промывали и ресуспендировали в основном буфере (pH 8,8) для гашения флуоресценции нефагоцитированных pHrodo-меченных апоптотических клеток. В экспериментах по блокированию с участием Fc-слитых белков или аннексина V в качестве блокирующего агента апоптотические клетки предварительно инкубировали с 50 мкг / мкг / мл белка в течение 10 минут при 37 ° C перед добавлением к фагоцитам.В экспериментах с липосомами в качестве блокирующего агента клетки L929 предварительно инкубировали с 10 мк М липосом в течение 10 мин при 37 ° C перед добавлением апоптотических клеток, меченных pHrodo. В экспериментах с использованием липосомных гранул, покрытых фосфолипидом, липосомные гранулы добавляли к фагоцитам на 15 мин при 37 ° C, после чего следовали три промывания PBS, фиксация и анализ с использованием конфокальной микроскопии. F-актин визуализировали с использованием фаллоидина, конъюгированного с Alexa568. Для экспериментов по блокированию с использованием антитела против CD300b первичные макрофаги выделяли из брюшной полости и культивировали в течение 24 часов при 37 ° C.Макрофаги (2 × 10 5 ) предварительно обрабатывали 25 мкг г анти-CD300b или анти-IgG-контрольных антител в течение 15 мин, совместно культивировали с апоптотическими тимоцитами, меченными pHrodo, в соотношении 1: 4 в течение дополнительных 30 минут. мин при 37 ° C. Клетки собирали, промывали PBS, содержащим 2% FBS, и окрашивали анти-F4 / 80-APC. Процент эффероцитоза оценивали методом проточной цитометрии. Клетки L929, окрашенные PKH67 (Sigma), инкубировали с липосомными гранулами, покрытыми PC или PS, в течение 30 мин. Клетки собирали и суспендировали в ледяном буфере для гомогенизации (0.25 M сахарозы, 10 мМ HEPES (pH 7,4), смесь ингибиторов протеаз в PBS), а затем гомогенизировали, пропуская через изогнутую иглу 27 ½ размера 20 раз. Нарушение целостности клеток подтверждено микроскопическим исследованием. Гранулы собирали из гомогенатов с использованием магнита Dynal, трижды промывали холодным PBS и анализировали на флуоресценцию PKH67 с помощью проточной цитометрии. Захваченные шарики показали более высокую флуоресценцию PKH67 из-за поглощения клеточной мембраны (фагосомы).

Проточная цитометрия

Alexa488-конъюгированные анти-CD300b антитела использовали для исследования экспрессии CD300b на поверхности клетки.В качестве контроля использовали козий IgG, конъюгированный с Alexa488. PE-конъюгированные антитела против TIM1 или против TIM4 использовали для исследования экспрессии TIM1 или TIM4 клетками Ba / F3. Клетки окрашивали антителом в течение 30 мин при 4 ° C, промывали и анализировали проточной цитометрией.

Для анализа связывания рецепторов 0,5 × 10 6 апоптотических тимоцитов или клеток Ba / F3 инкубировали с 5 мкМ мкг / мл антимышиных CD16 / CD32 для блокирования рецепторов Fc, а затем инкубировали с 0,05 или 0,1 мкл. мкг / мл химерных белков, CD300b-Fc или NITR-Fc, на льду в течение 40 минут с последующим окрашиванием FITC или APC-конъюгированными антителами против человеческого IgG Fc γ специфическими антителами (Jackson ImmunoResearch) в течение 15 минут.Клетки промывали 2% FBS в PBS и анализировали проточной цитометрией. В случае клеток Ba / F3 реакции окрашивали 7-AAD (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США) для исключения мертвых клеток. В экспериментах с использованием рекомбинантного немеченого аннексина V в качестве блокирующего агента апоптотические клетки или клетки Ba / F3 предварительно инкубировали с аннексином V в течение 20 минут на льду перед инкубацией с Fc-химерными белками или аннексином V-APC. В экспериментах с использованием липосом в качестве блокирующего агента липосомы инкубировали с Fc-химерными белками в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем образцы инкубировали с апоптотическими клетками.Для обнаружения связывания CD300b с липосомами, прикрепленными к клеткам, клетки Ba / F3 инкубировали с липосомами в течение 30 мин на льду, а затем клетки инкубировали с Fc-химерными белками. Стрептавидин-APC использовали для обнаружения липосом, связанных с клетками Ba / F3.

Для анализа фагоцитоза образцы готовили, как описано выше. Фагоциты и апоптотические клетки различали по характеристикам прямого и бокового рассеяния. Появление флуоресценции pHrodo в популяции фагоцитов отслеживали как индикатор поглощения апоптозными клетками: популяция фагоцитов, характеризующаяся высокой флуоресценцией (i.е. pHrodo high ) рассматривали как клетки, поглощающие апоптотические клетки. Сбор и анализ данных выполняли с использованием проточного цитометра FACSort (BD Bioscience) с программным обеспечением Cell Quest (версия 3.3) и анализировали с помощью FlowJo (v.7.6; Tree Star, Ashland, OR, США).

Вестерн-блот-анализ

Клетки J774 (1 × 10 6 ) инкубировали с 4 × 10 6 апоптотических тимоцитов в течение 10 минут при 4 ° C, а затем переносили при 37 ° C на указанное время.Экстракты готовили в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия и коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Sigma). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 10 000 × g в течение 15 мин при 4 ° C. Лизаты клеток разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA). Мембраны блокировали 5% BSA (Sigma) в TBST (20 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20) в течение 1 ч, а затем зондировали антителами, как указано в тексте.Были использованы вторичные антитела, конъюгированные с HRP, и иммуноблоты были разработаны с помощью набора West Pico SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, USA) и визуализированы на Hyperfilm (Amersham Biosciences).

Конфокальная микроскопия

Для определения клеточной локализации CD300b во время фагоцитоза клетки, экспрессирующие CD300b-cMyc, инкубировали с апоптотическими клетками, меченными TFL4, или без них. Клетки высевали на стеклянные чашки номер 1,5 (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA), фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.Чтобы пометить F-актин, клетки фиксировали, как описано выше, пермеабилизировали 0,4% сапонином в PBS в течение 15 минут и окрашивали фаллоидином, конъюгированным с Alexa568 (разведение 1: 200), в течение 1 часа. В случае непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания клетки фиксировали и повышали проницаемость, как описано выше, а затем блокировали 10% BSA в PBS с последующей инкубацией с первичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитело против cMyc использовали в соотношении 1: 2000. Наконец, образцы инкубировали в течение 1 ч с козьими антимышиными антителами (разведение 1: 500), конъюгированными с Alexa488, 569 или 647, как указано в подписях к рисункам.Клетки помещали в среду ProLong Gold (Invitrogen) и визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 710 (Zeiss) с объективом Zeiss Plan-Apochromat 63 × и анализировали с помощью программного обеспечения Imaris (v 7.4; Bitplane, South Windsor, CT, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

SPR

Взаимодействие Fc-химерных белков с различными фосфолипидами измеряли с использованием системы BIAcore 2000 (Biacore Inc., Питтсбург, Пенсильвания, США) в соответствии с нашим предыдущим отчетом. 17 Для взаимодействий липосом и Fc-слитых белков 1 мМ липосомы были захвачены на сенсорном чипе L1 с последующим воздействием на Fc-слитые белки в концентрации 10 мк мкг / мл.Для измерения взаимодействия между TIM1 и CD300b, TIM1 был связан с сенсорным чипом CM5 с использованием стандартной связи NHS-EDC. Затем различные слитые с Fc белки вводили в концентрации 10 мкМ мкг / мл для анализа их связывания с TIM1. Для измерения связывания CD300b-Fc с TIM1 плюс различными фосфолипидсодержащими липосомами TIM1 иммобилизовали на сенсоре CM5; с последующей инъекцией липосом (300, мкМ, М). После этого определяли связывание слитых с Fc белков.

Выделение РНК и количественная ОТ-ПЦР в реальном времени

Общую РНК выделяли с использованием набора RNAquous-4PCR (Ambion, Grand Island, NY, USA) в соответствии с инструкциями производителя.кДНК синтезировали с помощью набора для синтеза кДНК Qscript (Quanta Biosciences, Гейтерсбург, Мэриленд, США), и количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили, как описано ранее. 50 Олигонуклеотидные праймеры для амплификации мышиных CD300b, CD300f, MerTK, Axl, BAI1, Stabilin 2 и GAPDH были приобретены у Qiagen. Кратное изменение экспрессии (относительное число копий (RCN)) выбранных генов было нормализовано по экспрессии гена домашнего хозяйства, GAPDH, и рассчитано по уравнению: RCN = E -ΔCt , где E = эффективность ПЦР, а Ct = Ct мишень -Ct GAPDH. Анализ кривой плавления выполнялся в конце каждого цикла, чтобы гарантировать, что амплифицирован только один продукт.

Статистический анализ

Статистическую значимость оценивали, используя ANOVA с пост-тестом Бонферрони или двусторонним непарным тестом Стьюдента t (программное обеспечение GraphPad Prism, версия 6.0). Данные представлены как среднее значение + стандартная ошибка среднего, если не указано иное. Уровень альфа был установлен на 0,05.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

БИТ НОВОСТИ PIT & PADDOCK Воспоминания 7 октября 2001 г. ДЖИММИДЖОНСОН'SSPRINTCUPDEBUT Пятикратный чемпион финишировал шестым в Sprint Cup в этом году - его самое низкое место с тех пор, как он перешел на полную ставку.Но в 2001 году он был 52-м, когда сыграл три матча. Первый, в Шарлотте, закончился плохо ... ПЯТЕРКА ЛУЧШИХ Новички 2011 года 50% 40% 30% Ди Реста снялся в дебюте F1 Разница в процентах между первым и вторым в основной серии 2011 г. Ромен Грожан 48.96% Себастьян Феттель 36.88% СТЕПЕНИ ДОМИНИРОВАНИЯ Мартин Томчик 34,15% Кто был самым доминирующим чемпионом в 2011 году? Вот их итоговое отставание от занявших второе место в процентах от набранных ими очков. СЛЕДУЮЩАЯ НЕДЕЛЯ МЕЖДУНАРОДНЫЕ ОБЗОРЫ 2011 г. IndyCar, GP2, GP3, Sportscars, WRC, DTM, WTCC, British F3, F2, Renault 3.5. получите сезонный обзор WORLDOF SPORT2011 Что произошло в NASCAR, V8 Supercars и других топовых сериях 1auldiResta P 20% Впечатляющее возвращение бывшего чемпиона DTM Force India в области одноместных автомобилей. 10% 0% F1 GP2 Дарио Франкитти 3,19% Indycar DTM Мэтт Нил 3,6% BTCC Тони Стюарт 0% НАСКАР Джейми Уинкап 1,11% V8 Суперкары Иван Мюллер 0,7% WTCC 2эймс Джей Хинчклифф ФОТО: STALEY, GIBSON, HONE, WEBB, KINRADE, LEVITT / LAT, WWW.МАККЛЯЙН.ДЕ, РОБЕРТ ЛЕСЬЕР «Мэр» неизменно фигурировал в образе Ньюмана / Хааса в его первом сезоне IndyCar. Мексиканец оказался сильным противником Камуи Кобаяши в составе Sauber F1. В своем первом сезоне в DTM он взял Audi более старой модели на два подиума. топтвиты @WadeCunningham Простите меня, я отказываюсь от жизни на следующие 20 часов путешествия, вы не можете скучать по мне, я шар депрессии застрял на сиденье 46J @maxpapis Они украли мой кошелек с паспортом внутри, теперь я нахожусь в консульство выясняет, как вернуться в США после теста на острове Филиппа @simonpagenaud Хорошо, раз уж некоторые из вас спрашивали меня; давай начнем с правильной ноги: Саймон SIGH-MON @Teixeira_Angola (RicardoTeixeira) Возможно, лучше отведи мою кошку в жирный лагерь @AllWaltrip (DarrellWaltrip), ты знаешь, я не слишком беспокоюсь о том, где закончится #KurtBusch, он будет в порядке , что меня беспокоит, так это сотни членов экипажа, уволенных на этой неделе[email protected] Сожалею, что долго не парковался. Я никогда не переживу этого. 3ergioPerez S 4doardoMortara E Лучшее в национальном гоночном сезоне, включая BRSCC, BARC, 750MC, MSVR, HSCC и CSCC. PLUS 5altteriBottas V Выиграл серию GP3 в своем дебютном сезоне и попал в поле зрения F1 вместе с Уильямсом. ДЕКАБРЬ 29 В ПРОДАЖЕ ]]> Итог - Себастьян Феттель. активизировал свою игру и заставил остальных задыхаться » Дэвид Култхард в этом сезоне говорили, что Марку Уэбберу не хватает скорости.И Себастьян был так быстр, что в этом году он несколько раз выставлял Марка в роли актера поддержки. Суть в том, что Феттель активизировал свою игру и заставил остальных задыхаться. И единственные два гонщика, которые, судя по форме в этом году, выглядят так, будто могут бросить вызов этому, - это Алонсо и Баттон. VETTEL: ВСЕГДА ВЕЛИКОЛЕПНЫЙ ПРОГРЕСС Я не сомневаюсь, что Себастьян, по крайней мере, выгравировал свое христианское имя на трофеях величайших игроков Формулы-1.Дальнейшее путешествие решит, увидите ли вы Феттеля вместе с такими, как Фанхио, Брэбэм, Стюарт, Прост и Сенна, и я думаю, что он на правильном пути к этому. Его способность повернуть круг, когда ему нужно, безупречна. Он доказал, что может гонять колесо к колесу с лучшими из них - помните тот ход на траве Алонсо в Монце? Он НОВЫЙ НОМЕР МАКЛАРЕНА ОДИН Стоит учесть, что если бы вы клонировали Марка Уэббера в Red Bull, вместо того, чтобы иметь там Себастьяна, то McLaren стал бы чемпионом мира с Баттоном.Я не думаю, что есть какие-либо аргументы в пользу того, что Дженсон стал лучшим гонщиком сегодня, чем когда он выиграл чемпионат с Брауном в 2009 году. Его акции никогда не были такими высокими, и его положение в этой команде отражает это. Его благополучие, здоровье и счастье никогда не были лучше. Он выиграл команду. У Дженсона было несколько шатаний в квалификации, но он показал невероятные гоночные характеристики. Дженсон и Льюис Хэмилтон в общении похожи на мел и сыр. Льюис очень открыт, Баттон был на высоте, чтобы занять второе место 44 автоспорта.com 15-22 декабря 2011 г. ФОТО: GILHAM, GETTY / LAT ]]> Летние месяцы были действительно трудно пройти. Я думаю, что теперь мы на правильном пути »» Гамильтон на Гран-при Абу-Даби На Гамильтона действительно повлияли таинственные проблемы с выездом на трассу - а об их природе ходило множество слухов - действительно, но он прямо ссылался на них как на фактор. Когда в Абу-Даби спросили, не усложнило ли ему жизнь Баттона улучшенная форма, Хэмилтон ответил, что «у меня проблемы были гораздо серьезнее - они были более личными».После гонки он ясно дал понять, насколько важна его блестящая победа для того, чтобы вернуться на трассу. «Учитывая, насколько тяжело это было и насколько плох был этот сезон, было очень важно ответить критикам, а также ответить самому себе», - сказал он. «Летние месяцы были действительно тяжелыми. Думаю, мы на правильном пути. Со мной здесь были члены моей семьи, и это очень хорошо. На этой неделе я прояснил свой мыслительный процесс ». Есть надежда, что такое отношение сохранится и в следующем сезоне.Все признаки говорят о том, что после минимумов второй половины сезона 2011 года Хэмилтон восстанавливается. Не слышите зла? Было много критики 15–22 декабря 2011 г. autosport.com 65 ]]> У меня было столько ссор в этом году что в некоторых вы будете делать ошибки - и все мы их делаем » поскольку критика - это количество столкновений на трассе, которые у него были. В течение 2011 года он дважды сталкивался с Виталием Петровым - один раз непростительно, когда возвращался на трассу после выхода из боксов в Валенсии.Он также перебил Серхио Переса в Сингапуре, после того, как подрезал другого Sauber Камуи Кобаяши во время Гран-при Великобритании. Это вряд ли квалифицирует его как чрезмерно подверженного несчастным случаям, но это тревожная тенденция. Как ни соблазнительно отвергнуть это как уклончивость старика, не обладающего пространственным восприятием, его потрясающая форма на первых кругах предполагает, что гоночный инстинкт и способность находить брешь остаются такими же острыми, как и прежде. «Одна часть состоит в том, что я участвовал во многих боях, гораздо больше, чем в предыдущие годы», - объясняет Шумахер.«У меня их было так много, что в некоторых вы совершите ошибку - мы все совершаем такие. Другая его часть - переднее крыло. Оно широкое и находится перед передним колесом, и увидеть этот предел труднее, чем когда крыло было узким. То, что случилось со мной в Валенсии, было именно этим. Я неправильно оценил длину крыла шрифта. То же самое и со столкновением Льюиса Хэмилтона и Фелипе Масса в Сингапуре ». Конечно, вы также можете предположить, что его относительное отсутствие в бою между колесами, когда он в своей пышности, возможно, играет определенную роль в его ржавости.Возможно, эта способность к странным случайным столкновениям присутствовала всегда. Как бы то ни было, это еще один симптом водителя, который вернулся в Формулу 1, чтобы обнаружить, что ему нужно узнать об элементе, который когда-то был его собственным. Он признал, что это сложнее, чем он ожидал, но, как и все великие чемпионы, это только оставило его более решительным.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *