Праймер расход: Праймер битумный 1 | Расход на м2

Предположим, что у нас есть 2000 кв. футов площади новой штукатурки стен и потолков как внутри, так и снаружи, и мы должны покрасить их.

Во-первых, на рынке есть различные виды шпаклевки для стен. Итак, чтобы ответить на этот вопрос, я предполагаю, что вы спрашивали о шпаклевке для стен на основе белого цемента, например; Шпаклевка для ухода за стенами Birla, J.K. Шпаклевка для стен, шпатлевка для стен Whitegold и т. д. .

Вторым по важности фактором для расчета потребности в шпаклевке является поверхность оштукатуренных стен. Если оштукатуренная стена имеет очень грубую отделку, вам может потребоваться нанести 3 слоя шпаклевки для идеальной отделки стен.

Если отделка поверхности приемлема и на ваших стенах нет значительных неровностей; вы можете примерно предположить, что расход составляет примерно 12–15 кв. футов на кг для 2 слоев шпаклевки для стен и 8–12 кв. футов на кг для 3 слоев шпаклевки для стен.

Расход шпатлевки строго зависит от оштукатуренной поверхности, навыков аппликатора и количества слоев. Таким образом, вы всегда можете подтвердить это, сделав образец на месте, купив 5-килограммовую упаковку на рынке и нанеся ее на стены.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ :-

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 4000 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 1800 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 2500 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 2000 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 1500 квадратных футов

составляет 12–15 кв. м на кг при нанесении 2 слоев и 8–12 кв. м на кг при 3 слоях.1 мешок шпаклевки для стен имеет вес 40 кг, поэтому площадь покрытия 1 мешком (40 кг) составляет 480-600 кв. футов для 2 слоев и 320-480 кв. футов для 3 слоев.

Сколько шпаклевки нужно на 100 кв.м? Мы знаем, что площадь покрытия шпаклевки для стен составляет 12–15 кв. футов на кг для 2 слоев, поэтому на 100 кв. футов требуется от 7 до 8 кг шпаклевки для стен.

1,86 – 2,04 на кв.м.

Birla составляет 20 – 22 кв. м/кг или 1,86 – 2,04 кв.м/кг.

Если говорить о площади покрытия шпаклевки в квадратных метрах на кг, то площадь покрытия шпаклевки равна 1.2 – 1,4 кв.м/кг для 2 слоев и 0,75 – 1,2 кв.м/кг для 3 слоев. В 1 мешке шпаклевки 40 кг, поэтому площадь покрытия 1 мешком (40 кг) шпаклевки составляет 45-56 м² при 2-х слоях и 30-45 м2 при 3-х слоях.

Для расчета стоимости и количества шпаклевки и их материальной сметы делаем следующие шаги:-

● Площадь = 2000 кв. футов

● расход шпаклевки для стен = 14 кв. футов/кг за 2 слоя

● требуется шпаклевка = 2000/14 = 143 кг

● 1 мешок шпаклевки = 40 кг, количество мешков шпаклевки в 143 кг = 143/40 = 3.58, поэтому 3,58 количества мешков шпаклевки требуют

● Стоимость 1 мешка шпаклевки = 800 рупий

● смета и стоимость материала шпаклевки = 800 × 3,58 = 2864 руб.

● учитывайте затраты на рабочую силу примерно 2 рупий за кв. м для 2-х слоев шпаклевки стен.

● Стоимость труда = 2000 × 2 = 4000 рупий

Смета и стоимость шпаклевки = стоимость материала для шпаклевки + стоимость рабочей силы

Стоимость работ по шпаклевке стен = 2864 + 4000 = 6864 руб. за 2000 кв.м.А за 1 кв.м = 6864/2000 = 3,5

Стоимость шпаклевки стен 3,5 рупий за кв.м, включая стоимость материалов и работ на 2 слоя.

Эмульсионная грунтовка для наружных работ, обеспечивающая превосходную адгезию ко всем поверхностным покрытиям для наружных работ. Наружная и внутренняя грунтовка для стен представляет собой грунтовку на водной основе, образующую прочную пленку и, как следствие, помогающую продлить срок службы всей системы окраски. Он не мелеет и может легко наноситься на затвердевшую свежую штукатурку.С помощью этой грунтовки для наружных работ вы получите дополнительную белизну и превосходную укрывистость стен.

Площадь покрытия грунтовкой для стен составляет 120–140 кв. футов на литр при нанесении 1 слоя и 90–100 кв. футов на литр при нанесении 2 слоев.

составляет 120–140 кв. футов на литр при нанесении 1 слоя и 90–100 кв. футов на литр при нанесении 2 слоев.

составляет 11 – 13 квадратных метров на литр при нанесении 1 слоя и 8,4 – 9,3 квадратных метра на литр при нанесении 2 слоев.

Если говорить о его квадратных метрах, то площадь покрытия цементной грунтовкой составляет 11.2–13 кв. м на литр в 1 слой и 8,4–9,3 кв. м на литр в 2 слоя

Расчет стоимости и количества грунтовки для стен и смета их материалов, мы делаем следующие шаги:-

● Площадь = 2000 кв. футов

● площадь покрытия грунтовки = 100 кв. футов на литр

● необходимое количество грунтовки = 2000/100 = 20 литров

● Стоимость грунтовки = 200 рупий за литр, тогда стоимость 20 литров грунтовки = 200 × 20 = 4000 рупий.

● затраты на оплату труда по грунтовке = 1 рупия за кв. фут, затем затраты на оплату труда по грунтовке 2000 квадратных футов = 2000×1 = 2000 рупий

Оценка и стоимость грунтовки стен = стоимость материала для грунтовки стен + стоимость рабочей силы

Стоимость грунтовки стен = 4000 + 2000 = 6000 р.

Итого стоимость грунтовки стен 6000р за 2000 кв.м работы по грунтовке, если говорить о стоимости установки за кв.м то будет 6000/2000 = 3

Цементная грунтовка стоит 3 рупии за квадратный фут, включая стоимость материалов и работы.

Площадь покрытия: 140–160 кв. футов на литр при нанесении 1 слоя и 70–80 кв. футов на литр при нанесении 2 слоев.

Если говорить в квадратных метрах, то для новых работ по оштукатуриванию площадь покрытия краской составляет 8 м2 на литр за 2 слоя, а для старых работ площадь покрытия 13,33 м2 на литр за 1 слой.

Расчет стоимости и количества гидроизоляционных красок и сметы их материала мы выполняем следующим образом:-

● Площадь = 2000 кв. футов

● площадь покрытия = 75 кв. футов на литр для 2 слоев

● необходимое количество краски = 2000/75 = 27 литров

● Стоимость краски = 400 рупий за литр, тогда стоимость 27 литров краски = 400 × 27 = 10800 рупий.

● стоимость труда на покраску = 2 рупии за кв. фут, затем стоимость труда на 2000 квадратных футов малярных работ = 2000×2 = 4000 рупий.

Оценка и стоимость краски для стен = стоимость материала для краски + стоимость рабочей силы

Стоимость краски для стен = 10800 + 4000 = 14800

Итого стоимость покраски стен 14800р за 2000м2 покрасочные работы, если говорить о стоимости монтажа за м2 то это будет 14800/2000 = 7,4

Стоимость краски для стен составляет 7,4 рупий за квадратный фут, включая стоимость материалов и работы.

ТАКЖЕ ЧИТАЙТЕ: –

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 4000 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 1800 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 2500 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 2000 квадратных футов

Сколько внутренней краски мне нужно для дома площадью 1500 квадратных футов

● вывод :-

●1) Стоимость шпаклевки = 3 руб.5 за квадратный фут, включая стоимость материалов и работы

● 2) Стоимость грунтовки стен = 3 рупии за кв. фут, включая стоимость материалов и работы

● 3) Стоимость краски для стен = 7,4 рупий за кв. фут, включая стоимость материалов и работы

Теперь общая смета и стоимость покраски дома за квадратный фут, включая стоимость материалов и работ = 3,5 рупий за шпаклевку + 3 рупии за грунтовку + 7,4 рупий за краску = 13. 9. рупий

Смета и стоимость покраски дома составляет 13,9 рупий за квадратный фут, включая материалы (2 слоя шпаклевки + 1 слой грунтовки + 2 слоя краски) и стоимость рабочей силы.

Потребление ИТ: Учебник для вашего бизнеса

По мере того, как предприятия сталкиваются с растущей необходимостью конкурировать в цифровой сфере и быстро адаптировать свои бизнес-модели к новым потребностям рынка, они ищут разумные способы повышения эффективности своей деятельности.

Эти компании часто поддерживают масштабные и сложные ИТ-инфраструктуры, включающие сочетание устаревших ИТ, облачных ИТ и локальных систем. Управление ими всеми может создать большую нагрузку на ИТ-отделы, особенно на те, ресурсы которых ограничены.

Столкнувшись с этой проблемой, многие предприятия переходят от традиционных ИТ-моделей к подходу, основанному на потреблении, который позволяет им упростить ИТ-операции, оплачивая только ИТ-услуги и ресурсы, когда они необходимы, и сокращая или даже устраняя дорогостоящие, трудоемкие капитальные вложения в оборудование.

Общая цель состоит в том, чтобы достичь баланса между стоимостью, эффективностью и производительностью. Компания работает с надежным ИТ-консультантом, который может поддержать и помочь улучшить ее ИТ-операции.Партнер также предоставляет доступ к последним инновациям и технологиям, которые необходимы предприятиям для получения конкурентного преимущества на рынке. Этот подход похож на гибкие модели потребления, предлагаемые поставщиками общедоступных облачных служб, такими как Amazon Web Services, но предлагает контроль, безопасность и надежность, характерные для локальных центров обработки данных.

Одной из самых насущных проблем для ИТ-руководителей сегодня является необходимость повышения операционной эффективности.По мере развертывания новых ИТ-услуг, чтобы воспользоваться преимуществами новых тенденций на рынке, вам необходимо обеспечить как можно более безболезненный переход к этим новым рабочим нагрузкам. Когда доверенный консультант использует опыт и навыки для координации ИТ-услуг и ресурсов для вашего бизнеса, он помогает вам перераспределить существующие ресурсы, чтобы сосредоточиться на функциях и методах, которые в большей степени соответствуют вашим основным бизнес-потребностям. Это может означать изменение набора навыков в вашей команде или переназначение сотрудников на новые должности.

Использование доверенного консультанта для управления вашей ИТ-инфраструктурой также позволяет вам повысить эффективность работы вашего ИТ-персонала, поскольку они тратят меньше времени на администрирование и обслуживание среды центра обработки данных или «поддержание света», а больше времени на ИТ-инновации и поддержку. бизнес. Согласно недавнему техническому документу IDC под названием «Бизнес-ценность благодаря HPE Datacenter Care Service», эффективность и экономия времени ИТ-персонала могут сэкономить в среднем 11 661 доллар США на 100 пользователей в год в течение трех лет, или 1 доллар США.06 миллионов на организацию.

ИТ, основанный на потреблении, также помогает снизить риск того, что ваши бизнес-направления самостоятельно внедряют облачные технологии. В прошлом, когда перегруженному ИТ-отделу приходилось отказываться от направлений бизнеса с новой инициативой, эти группы часто обращались за облачной поддержкой вне компетенции и контроля своих ИТ-отделов. Это повысило угрозу возможных утечек данных и потенциальных проблем с контролем затрат. Теперь, благодаря возможности быстрого расширения вычислительных ресурсов, время вывода проектов на рынок значительно сократилось, и у вас больше шансов иметь пропускную способность, чтобы взяться за эти новые проекты.

Повышенный контроль также является важным преимуществом. Хотя общедоступные облачные решения упрощают ИТ-операции, они также требуют, чтобы вы передали свои ИТ в чужие руки. Общедоступные облачные решения практически недостижимы, поэтому заказчик не может напрямую выбирать облачную инфраструктуру или управлять ею. Использование локального ИТ-подхода, основанного на потреблении, дает вам гораздо больший контроль над проблемами безопасности, конфиденциальности и задержек, которые могут возникнуть при использовании общедоступного облака. В то время, когда утечки корпоративных данных постоянно находятся в заголовках новостей, компании хотят контролировать риски и обеспечивать безопасность своих данных.

ИТ на основе потребления — это, по сути, партнерство между компанией и поставщиком услуг. Традиционно компании приобретали оборудование заранее, устанавливали эти активы и обслуживали их в течение долгого времени. Сегодня, со всеми быстрыми изменениями в технологиях и рыночных требованиях, это более рискованная перспектива. Используя ИТ на основе потребления, ваша компания теперь может разделить этот риск с поставщиком ИТ, который предлагает ИТ-ресурсы, масштабируемые вверх и вниз в соответствии с потребностями бизнеса. И от вас не требуется делать дорогостоящие вложения капитала.

Длительные циклы закупок приводят к необходимости избыточных резервов для многих предприятий. Возможность быстро наращивать мощности и заранее поддерживать необходимую мощность важна для любого предприятия, которое ожидает быстрого роста, имеет сезонные всплески спроса или хочет быстро реализовать новую бизнес-идею.

Например, представьте, что ваша компания только что запустила новую маркетинговую кампанию, которая снижает цены на несколько ключевых продуктов, продаваемых через ваш веб-сайт.Вы ожидаете, что кампания будет иметь огромный успех, повысит вашу прибыль и очистит ненужный инвентарь.

Кампания действительно увеличивает продажи, но ее успех — палка о двух концах. Продукты со скидкой настолько популярны, что создают огромную нагрузку на вашу ИТ-инфраструктуру, несколько раз приводя к сбою вашего веб-сайта. Когда маркетинговая команда разрабатывала рекламную кампанию, ИТ-команда не участвовала в планировании, поэтому у нее не было ресурсов, чтобы справиться с внезапным всплеском веб-трафика.В результате продвижение провалилось не из-за отсутствия интереса, а из-за отсутствия достаточных ИТ-мощностей.

Это ситуация, с которой сталкиваются многие компании: ИТ-мощности, в которых они нуждаются, и доступные ИТ-мощности часто не соответствуют друг другу. Это более распространенная проблема сейчас, когда предприятия вынуждены ускорять трансформацию бизнеса и быстро использовать возможности, связанные с технологиями. Нехватка мощностей помешает вам реализовать новую бизнес-идею, но избыточное выделение означает, что вы тратите на ИТ больше, чем нужно.

Благодаря такому решению, как HPE GreenLake Flex Capacity, вы можете масштабировать емкость по мере необходимости. Клиент имеет доступ к панели аналитики, показывающей, сколько ресурсов потребляется, и в режиме реального времени. Поставщик ИТ и заказчик регулярно встречаются, чтобы убедиться, что ресурсы оптимизированы для бизнеса, поэтому поставщик знает, есть ли на горизонте какие-либо потенциальные периоды высокого спроса, такие как запуск нового продукта или маркетинговая кампания. HPE предоставляет локальный буфер емкости, который можно использовать по мере необходимости.Активное управление емкостью в сочетании с буфером на месте гарантирует, что вы не исчерпаете емкость. Клиент платит только за то, что использует компания. Отсутствуют первоначальные капиталовложения.

Этот подход должен упростить ИТ в долгосрочной перспективе, поскольку ИТ-отделам больше не придется вкладывать большие средства в управление своей ИТ-средой. Вместо этого они могут доверить эту работу надежному поставщику с большим опытом и знаниями в этой области. У внутренней ИТ-команды компании будет больше времени, чтобы сосредоточиться на стратегических инициативах и основных бизнес-целях.ИТ-отдел снова может быть самым умным человеком в комнате и уделять больше времени созданию ИТ-решений для использования новых рыночных возможностей.

ИТ на основе потребления — отличный вариант для предприятий, которые хотят сократить капитальные затраты и согласовать расходы на ИТ с бизнес-инициативами. Компании платят только за те ИТ-ресурсы, которые они фактически используют, и могут увеличивать или уменьшать расходы в зависимости от своих потребностей.

Как правило, многим предприятиям теперь нужны такие же гибкие модели, основанные на потреблении, которые давно предлагали коммунальные и телекоммуникационные компании.Преимущества этого подхода включают финансовую предсказуемость и четкое представление о ваших расходах, что позволяет лучше принимать решения по бюджетам, помогая вам легче выполнять свои стратегии движения денежных средств и распределения капитала. Таким образом, ИТ, основанные на потреблении, позволяют перейти от дорогостоящей модели капитальных затрат к структуре переменных затрат. Общий эффект аналогичен общедоступному облаку, который позволяет вам лучше контролировать свои операции внутри компании.

А учитывая, что платежи на основе потребления обеспечивают гибкость ежемесячной корректировки расходов, они могут помочь уменьшить избыточное выделение ресурсов.По данным 451 Research, в среднем 59% предприятий выделяют избыточные ИТ-ресурсы. Но подход, основанный на потреблении, может помочь вам избежать этого излишка и создать четкую связь между потраченными долларами и бизнес-целями компании.

• ИТ на основе потребления предлагает гибкость облака с контролем, безопасностью и надежностью, присущими локальным центрам обработки данных.
• Модели потребления ИТ позволяют компаниям платить за ИТ-ресурсы и мощности, когда они им нужны, что приводит к сокращению или даже устранению капитальных и других затрат.
• Возможность быстрого расширения ресурсов ИТ-инфраструктуры означает, что ИТ-отдел может отвечать на большее количество бизнес-запросов.

Ссылки по теме:

5 шагов к улучшению управления идентификацией и доступом для гибридных ИТ

Что бы сказал Старый Макдональд о вашей ферме SharePoint?

Большие данные HPE GreenLake: раскрытие даров, которые приносят ваши данные

Пограничные вычисления стали проще с HPE GreenLake

HPE GreenLake Flex Capacity: новая парадигма для ИТ, ориентированных на потребление

Свобода творчества благодаря цифровой трансформации

Определение части гиперконвергентной инфраструктуры 1: Анатомия HPE Simplivity 380

Локальная ИТ-система, основанная на потреблении: 3 преимущества для вашего бизнеса

3 способа, которыми ИТ-потребление делает ваш бизнес умнее

Гибридная ИТ-математика: 1 + 1 не всегда = 2

Эта статья/содержимое были написаны указанным автором и не обязательно отражают точку зрения Hewlett Packard Enterprise Company.

Сократите расход материала и сэкономьте время с PPG GREYMATIC® Primer Systems

1. Дом
2. Новости

Никогда прежде на наших дорогах не было такого широкого ассортимента покрытий OEM. Из-за использования 2-х и 3-х ступенчатых перламутровых красок многие лакокрасочные покрытия автомобилей имеют прозрачные цвета, которые, естественно, не дают хорошей укрывистости; поэтому может потребоваться несколько затрат для достижения покрытия. Нанесение нескольких слоев требует много времени и затрат на краску в расчете на объем ремонта.Система праймеров PPG Greymatic обеспечивает эффективное решение этой проблемы.

С помощью системы PPG Greymatic Primer можно добиться эффективного покрытия всей цветовой гаммы, даже самых сложных цветов.

Рейматик G Концепт

Greymatic Воспринимаемая укрывистость лучше всего достигается при использовании грунтовки, которая сочетается по светлоте и темности с цветом верхнего покрытия.Цветные грунтовки пытаются достичь этого, предлагая широкий спектр цветов, которые редко соответствуют глубине светлоты или темноты верхнего слоя, и поэтому их эффективность ограничена. Исследования PPG показывают, что при использовании грунтовки нейтрального серого цвета можно подобрать интенсивность определенного цвета верхнего слоя, что сводит к минимуму количество слоев цвета, необходимых для достижения воспринимаемой укрывистости. Пять оттенков серого, доступные в грунтовках PPG Greymatic , обеспечивают максимальную укрывистость в широком диапазоне цветов, гарантируя, что высококачественные цветовые сочетания могут быть достигнуты быстро и легко с красками с низкой укрывистостью.

PPG Системы Greymatic

Система PPG Greymatic представляет собой ряд оттенков серого, доступных в системе PPG Primer System, предназначенных для того, чтобы вы могли использовать правильный оттенок серого для цвета, включая наполнитель greymatic и грунтовку «мокрым по мокрому». Система была разработана таким образом, чтобы включать в себя пять оттенков серого, подходящих для использования под всеми покрытиями, которые могут быть получены всего из трех продуктов: белого, серого и темно-серого (G1, G5, G7).

В настоящее время PPG предлагает грунтовку Greymatic в следующих продуктах:

• D8010/D8015/D8017 Rapid Greymatic HS Surfacer G1, G5, G7
• DP4000 2K грунтовка G1, G5, G7
• DP3000 Грунтовочная грунтовка Enviro G1, G5, G7

Преимущества для вашей автомастерской при использовании систем PPG Greymatic

• Системы просты в использовании, и каждая цветовая формула PPG рекомендует оптимальный оттенок серого грунта для использования
• Для смешивания всех пяти оттенков серого можно использовать всего два продукта
• Более быстрый ремонт, поскольку для достижения укрывистости требуется меньше слоев, что сокращает время распыления и высыхания
• Повышает прибыльность за счет экономии времени в покрасочной камере.
• Уменьшение расхода материала за счет использования меньшего количества слоев цветных финишных покрытий позволяет сэкономить на затратах, рабочем времени и объеме краски, используемой при ремонте.
• Избегайте дорогостоящих доработок при использовании неправильного оттенка грунтовки
• Общий окончательный внешний вид цвета не ухудшается, так как цветовое соответствие улучшается

PPG Greymatic Средство идентификации

Чтобы помочь автомастерской определить правильные серые оттенки для применения, компания PPG разработала инструмент идентификации Greymatic .Цель этого инструмента — помочь вам уменьшить количество материала базового покрытия, необходимого для достижения видимого покрытия. Использование инструмента идентификации PPG Greymatic поможет вам выбрать правильный оттенок грунтовки и избежать ситуаций, когда используется неправильный оттенок грунтовки.

Вы можете скачать инструмент ниже:

GREYMATIC® является зарегистрированным товарным знаком PPG Industries Ohio, Inc.

Обследования потребления и расходов домохозяйств (HCES): пособие для аналитиков в области пищевых продуктов и питания в странах с низким и средним уровнем дохода

Задний план: Нехватка 24-часовых отзывов и взвешенных данных о продуктах питания, которые большинство диетологов считают золотым стандартом данных о потреблении продуктов питания, уже давно является препятствием для научно обоснованной политики в области пищевых продуктов и питания.Неуклонно растет число исследований, в которых используются данные о приобретении и потреблении продуктов питания домохозяйствами из различных многоцелевых, репрезентативных на национальном уровне обследований домохозяйств в качестве косвенного показателя для преодоления этого фундаментального информационного пробела.

Цель: Описать ключевые характеристики этих все более доступных обследований потребления и расходов домохозяйств (ОПДД), чтобы помочь специалистам по анализу продуктов питания и питания ознакомиться с преимуществами и недостатками этих данных и, таким образом, поощрить их использование в странах с низким и средним уровнем дохода; и выявить общие недостатки, которые могут быть легко устранены в ближайшем будущем в индивидуальном подходе по мере развертывания новых HCES, тем самым начав процесс повышения потенциала этих обследований как источников полезных данных для лучшего понимания продуктов питания. и вопросы, связанные с питанием.

Методы: Описаны общие характеристики ключевой информации о пищевых продуктах и ​​питании, доступной в HCES, и некоторые основные общие этапы обработки данных HCES для анализа пищевых продуктов и питания.

Результаты: Задокументированы общие характеристики этих обследований и продемонстрирована их полезность в решении основных вопросов продовольствия и питания, а также их недостатки.

Выводы: Несмотря на свои ограничения, использование данных HCES представляет собой в целом неиспользованную возможность восполнить пробел в информации о потреблении продуктов питания с помощью данных обследований, которые большинство стран уже регулярно собирают.

Оптимизация методов отбора проб в полевых условиях и дизайн праймеров для высокопроизводительного секвенирования

Abstract

Выяснение рациона насекомых-хищников важно в фундаментальной и прикладной экологии, например, для повышения эффективности мер сохранения биологического контроля, направленных на продвижение естественных врагов вредителей сельскохозяйственных культур.Здесь мы исследовали диету тлей двух распространенных тлей-хищников в агроэкосистемах Центральной Европы, местной Coccinella septempunctata (Linnaeus) и инвазивной Harmonia axyridis (Pallas; Coleoptera: Coccinellidae) с помощью высокопроизводительного секвенирования (HTS). Для получения информации о диетах мобильных летающих насекомых в ландшафтном масштабе важно свести к минимуму систематическую ошибку, связанную с отловом, что создает методологические проблемы для HTS. Поэтому мы оценили пригодность трех методов отбора проб в полевых условиях (клейкие ловушки, лотковые ловушки и ручной сбор), а также новых праймеров для выявления тлей, поедаемых кокцинеллидами с помощью HTS.Новые праймеры для тлей облегчают идентификацию до видового уровня у 75% исследованных европейских родов тлей. Специфичность праймеров для тлей была высокой в silico и в лабораторных условиях , но низкой в ​​образцах из окружающей среды с использованием используемых методов, хотя это может быть улучшено в будущих исследованиях. Для отлова насекомых мы пришли к выводу, что липкие ловушки являются подходящим методом с точки зрения минимизации систематической ошибки выборки, риска заражения и успеха отлова, но снижают скорость восстановления ДНК. В рационе обоих видов божьих коровок, пойманных в полевых условиях, преобладала Microlophium carnosum , обыкновенная крапивная тля.Другой распространенной добычей был Sitobion avenae (злаковая тля), который чаще обнаруживался у C . septempunctata по сравнению с H . аксиридис . Около трети выявленных таксонов тлей были обычными вредителями сельскохозяйственных культур. Мы пришли к выводу, что методологии отбора проб нуждаются в постоянном пересмотре, но наши улучшенные праймеры для тлей в настоящее время являются одним из лучших решений для широкого скрининга хищничества кокцинеллид на тлях.

Образец цитирования: Ammann L, Moorhouse-Gann R, Cuff J, Bertrand C, Mestre L, Hidalgo NP, et al.(2020) Взгляд на потребление божьими коровками добычи тли: оптимизация методов отбора проб в полевых условиях и дизайн праймеров для высокопроизводительного секвенирования. ПЛОС ОДИН 15(7): е0235054. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235054

Редактор: Claude Loverdo, UPMC, ФРАНЦИЯ

Получено: 12 сентября 2019 г.; Принято: 8 июня 2020 г .; Опубликовано: 1 июля 2020 г.

Авторское право: © 2020 Ammann et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации или доступны в SRA GenBank под номером доступа PRJNA563315.

Финансирование: Это исследование финансировалось Швейцарским национальным научным фондом (SNSF, номер гранта 6571210; получатели наград LA, CB, FH, MA) и Немецким исследовательским фондом (DFG, номер гранта EN979/3-1; награжденные LM, MHE). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Насекомые, включая опылителей сельскохозяйственных культур и хищников сельскохозяйственных вредителей, обеспечивают важные экосистемные услуги для сельского хозяйства. Углубление нашего понимания потребностей в пищевых ресурсах обслуживающих насекомых имеет решающее значение для их эффективного продвижения с помощью управления сельскохозяйственными ландшафтами [1–3]. Для исследования рациона насекомых использовались различные методы, каждый из которых имел свои преимущества и недостатки [4].Высокопроизводительное секвенирование (HTS) все чаще принимается в качестве стандартного метода для анализа питания как добычи, потребляемой хищниками, так и растений, потребляемых травоядными, благодаря его высокой точности [5] и способности одновременно обнаруживать широкий спектр потребляемых видов [5]. 6,7]. Тем не менее, для анализа рациона на основе HTS остается несколько методологических ограничений, в частности, в отношении анализа рациона добычи насекомых-хищников. Во-первых, насекомые — это мелкие животные, которые выделяют незначительное количество содержимого кишечника, что затрудняет различие между загрязнением и фактической съеденной добычей.Во-вторых, особенно для этой системы, тесная таксономическая близость между хищниками и жертвами затрудняет специфическую амплификацию ДНК жертвы, что особенно важно, поскольку используется все животное, а не только образцы фекалий. Кроме того, сложно собрать большое количество отдельных насекомых-хищников, у которых можно выделить ДНК жертвы и избежать заражения. Например, широко используемые подходы, такие как ловушка в ловушку, вакуумный отбор проб или ловля сеткой, могут обеспечить сбор насекомых в достаточном количестве и в удовлетворительном состоянии для анализа ДНК [8–11], но эти методы отбора проб могут привести к перекрестному загрязнению за счет взаимодействия. насекомых в контейнерах для отбора проб [12–14].Кроме того, модели использования ресурсов, обнаруженные в исследованиях с использованием таких методов выборки, часто подвержены «предвзятости наблюдателя», т. е. они могут зависеть от выбора места отбора проб. Например, если хищников собирают вручную непосредственно с легкодоступных растений, выборки могут быть смещены в сторону добычи, связанной с выбранными растениями-хозяевами и самой местной средой обитания, а не адекватно отражать рацион питания или предпочтения мобильных насекомых во всем их кормовом ареале. Методы отбора проб с использованием ловушек, которые ловят насекомых за пределами непосредственного места ловушки, таких как ловушки-перехватчики, которые ловят насекомых во время полета [15,16], или ловушки, привлекающие насекомых на относительно большие расстояния с помощью цвета, запаха или света [16], могут быть более эффективными. подходит по этим причинам.Тем не менее, использование методов ловушки также сопряжено с трудностями: например, низкая эффективность отбора проб насекомых в течение коротких периодов отлова или риск низкой скорости извлечения ДНК из-за деградации ДНК, если периоды отлова более длительны и, таким образом, ограничены возможности для анализа ДНК. 17,18]. Кроме того, в анализе диеты на основе ампликона HTS выбор праймеров для ПЦР имеет решающее значение [9]. Чтобы увеличить вероятность амплификации ДНК-мишени, пара праймеров должна амплифицировать как можно более широкий спектр потенциально потребляемых пищевых таксонов, в идеале не амплифицируя сам вид-потребитель [19].Кроме того, созданные ампликоны должны позволять различать потребляемые таксоны с соответствующим таксономическим разрешением. Для таких исследований праймеры должны быть нацелены на ген с консервативными сайтами праймеров между целевыми видами, в то время как ампликоны должны быть достаточно короткими, чтобы выжить при переваривании, но достаточно длинными, чтобы предоставить необходимую таксономическую информацию.

Группоспецифичная пара праймеров против тлей, опубликованная Harper et al . [20] обещали амплификацию широкого круга видов тлей.Однако было неясно, насколько он подходит для HTS, насколько хорошо он может амплифицировать и различать разные виды тлей, а также в какой степени он также будет амплифицировать божьих коровок и другие таксоны членистоногих. Эффективность амплификации праймеров на ДНК окружающей среды может отличаться от результатов in silico и амплификации in vitro имитационных сообществ. Например, оба последних метода показали, что праймеры Кларка могут быть использованы для метабаркодирования ДНК насекомых [21,22].В исследовании Альберди и др. . [23], однако те же праймеры не смогли амплифицировать ДНК жертвы из образцов окружающей среды из-за обширной амплификации нецелевой ДНК. Поэтому важно проверить эффективность праймера на реальных образцах, взятых из ландшафта. Мы сосредоточились на Coccinella septumpunctata (Linnaeus) и Harmonia axyridis (Pallas), двух видах божьих коровок (Coleoptera: Coccinellidae), известных как основные хищники тли в умеренных сельскохозяйственных ландшафтах [24,25].Пока C . septempunctata произрастает в Европе, Азия H . axyridis был интродуцирован в европейские сельскохозяйственные системы в 1990-х годах [26]. Роль H . axyridis как естественного врага вредителей сельскохозяйственных культур, обусловило его внедрение во многие агроэкосистемы в качестве неместного агента биоконтроля, откуда он быстро распространился и вытеснил местные популяции божьих коровок [27,28]. Оба вида божьих коровок являются одними из самых многочисленных божьих коровок в изученных сельскохозяйственных регионах Германии и Швейцарии [29,30].Их высокая функциональная важность как естественных врагов тлей привела к нескольким исследованиям выбора добычи и пищеварения в искусственных условиях [31,32]. Однако гораздо меньше известно об использовании двух божьих коровок в качестве добычи тли в реальных сельскохозяйственных ландшафтах. Тем не менее, такие знания имеют решающее значение для целенаправленного продвижения этих двух видов как естественных врагов посевной тли, а также для информирования управленческих решений в отношении противоречивой роли инвазивного вида H . axyridis в качестве средства для борьбы с вредителями, с одной стороны, и хищника или конкурента местным видам насекомых, с другой.Поэтому мы исследовали жертву тли C . септемпунктата и H . axyridis , сравнили преимущества и недостатки различных методов отбора проб с использованием ловушек и ручного сбора с точки зрения эффективности отбора проб и возможности обнаружения ДНК тли в кишечнике божьей коровки. Мы модифицировали пару праймеров для тлей, разработанную Harper et al . [20] в отношении применимости HTS для исследования использования тлей в качестве добычи функционально важных видов божьих коровок в ландшафтном масштабе.В частности, мы сравнили: (I) специфичность праймеров между существующими и модифицированными парами праймеров, а также разрешение идентификации тли; (II) количество отобранных божьих коровок и их пригодность для анализа ДНК между методами отбора проб, и (III) кормовые рационы тлей C , отобранных в полевых условиях. септемпунктата и H . аксиридис .

Методы

Арфист и др. .[20] общая пара праймеров для тлей амплифицирует область 308 п.н. митохондриального гена оксидазы I (COI) цитохрома c . Чтобы оценить пригодность пары праймеров для этого исследования, была создана библиотека последовательностей путем загрузки и кластеризации последовательностей COI Coleoptera, Coccinellidae, Hemiptera, Hymenoptera, Aphididae, Neuroptera и Araneae из GenBank [33] с помощью PrimerMiner v.0.18 [34]. . Из них Coccinellidae и Aphididae имеют прямое отношение к настоящему исследованию, в то время как другие таксоны были включены для оценки любого более широкого потенциала модифицированных праймеров для других исследований.Последовательности были выровнены в Geneious Prime 2019.1.1. ([35] через MAFFT 1.3.7. [36]) и сайты связывания праймеров, визуально оцененные на подгруппе из тридцати видов тлей и кокцинеллид, представленных как минимум пятью последовательностями каждый. Впоследствии в последовательности праймеров было внесено несколько модификаций, чтобы усилить исключение ДНК божьей коровки из амплификации (таблица 1), тем самым максимизировав восстановление прочтений добычи [19]. PrimerMiner v.0.18 [34] использовали для визуализации различий в выравнивании как модифицированных праймеров, так и праймеров, разработанных Harper et al .[20] к целевым сайтам связывания по всей библиотеке (S1 Fig). Улучшение целевой специфичности праймера in silico визуализировали и сравнивали с использованием PrimerMiner v.0.18 [34] с таблицей по умолчанию для оценки несоответствия и штрафной оценкой >120.

Праймеры были дополнительно протестированы in vitro с ДНК, выделенной из нескольких образцов божьих коровок, тлей и альтернативных хищников, чтобы приблизительно соответствовать группам, протестированным in silico , с особым вниманием к разнообразию тлей.К ним относятся божьи коровки C . с точечной перегородкой и H . axyridis , тлей Aphis fabae , Myzus cerasi , Brachycaudus lychnidis , Sitobion avenae , Aphis rumicis и Microlophium carnosum , а также альтернативные хищников обыкновенная златоглазка , Loricera pilicornis , Pardosa pullata , Syrphidae sp . и Ichneumonidae sp .Для экстракции ДНК использовали наборы Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen, Манчестер, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя, но с увеличенным временем лизиса до 12 часов для лучшего проникновения в хитиновые ткани насекомых. Обе пары праймеров тестировали в реакционных объемах по 5 мкл, состоящих из 1 мкл ДНК, 2,5 мкл набора PCR Multiplex Kit (Qiagen) и прямых и обратных праймеров по 2 нг мкл ^-1 . Все ПЦР проводили следующим образом: 95°С в течение 15 мин, затем 35 циклов 94°С в течение 30 с, 51°С в течение 30 с и 72°С в течение 90 с, и конечное удлинение при 72°С в течение 10 мин. .Продукты ПЦР визуализировали с помощью гель-электрофореза в 2% агарозных гелях, освещенных УФ-светом, ДНК окрашивали SYBR ^® Safe (Thermo Fisher Scientific, Пейсли, Великобритания).

были рассчитаны с использованием анализатора праймеров ThermoFisher. Праймеры, разработанные Harper и др. . [20] сообщались нетрадиционным способом, который был исправлен в этой таблице для возможности сравнения с новыми модификациями.

Разрешение таксона области ампликона

В то время как для оценки специфичности праймеров необходимы справочные базы данных с широким охватом таксонов, исследование таксономического разрешения данного ампликона в основном зависит от правильно идентифицированных последовательностей.Особенно у тлей, морфологическая идентификация которых иногда невозможна [37], трудно получить последовательности из точно идентифицированных экземпляров. Тем не менее справочные базы данных должны быть максимально полными, чтобы обеспечить достаточное понимание как внутривидовой, так и межвидовой изменчивости. Для этого был использован лучший доступный в настоящее время набор данных для европейских тлей ([38]; он был депонирован в GenBank [33] (KF638720 до KF639739) и на веб-сайте PhylAphidB@se, http://aphiddb.supagro.inra.fr), который покрывает полную область штрих-кодирования Фолмера [39] COI длиной 658 п.н. В библиотеку из GenBank были добавлены виды тлей, ожидаемые в исследуемом регионе на основе растительности и отношений между тлей и растением-хозяином. Библиотечные последовательности, не идентифицированные до видового уровня и охватывающие менее 296 пар оснований области ампликона, были исключены. Полученная библиотека содержит 1160 последовательностей, включая 999 последовательностей из вышеупомянутой базы данных тлей [38] и 161 дополнительную последовательность из GenBank (таблица S1), всего 282 вида из 95 родов.Последовательности были выровнены в ClustalX [40], проверены вручную в BioEdit [41] и обрезаны в MEGA5 [42]. Для оценки приписываемости таксонов тлей к вышеупомянутой библиотеке был применен алгоритм Blastn в программе Blast+ [43] с порогом кластеризации 90%. После визуального скрининга совпадений пороговое значение было увеличено до 98,36%, что позволило максимальное количество совпадений на уровне видов и как можно более частое исключение совпадений с отклонениями. Если совпадающие последовательности происходили исключительно от одного и того же вида, таксон считался идентифицируемым до видового уровня.Если несколько видов совпадали, считалось, что они могут быть идентифицированы до уровня рода, поскольку не было неправильных совпадений для этого порога сходства на более высоких таксономических уровнях. Эта библиотека впоследствии использовалась в качестве справочной базы данных для идентификации видов тлей наших полевых образцов. Порог подобия последовательностей информировал о порогах кластеризации, необходимых для генерации центроидов при биоинформатической обработке полевых образцов (99%). Этот порог сходства довольно высок и приводит к большому количеству OTU в таксонах божьих коровок, что позволяет относить таксоны с более низкими порогами сходства.

Районы исследования и отбор проб божьих коровок

Полевые работы проводились в 2016 г. в сельскохозяйственных ландшафтах северной Швейцарии (в радиусе 50 км вокруг Цюриха) и южной Германии (в радиусе 20 км вокруг Ландау, Пфальц) (таблица S2). Всего было выбрано 23 самостоятельных участка агроландшафта радиусом 500 м (далее ландшафты) с различным составом землепользования. В каждом из ландшафтов были случайным образом выбраны пять (Швейцария, 12 ландшафтов) или три (Германия, 11 ландшафтов) точек отбора проб, которые были оснащены двумя типами ловушек (клейкая ловушка и комбинированная ловушка, см. ниже), что в сумме составило 186 ловушек.Чтобы свести к минимуму риск отбора проб непромысловых видов, представляющих большую природоохранную опасность, ловушки не устанавливались в природоохранных зонах или вблизи них. Отлов проводился в соответствии с национальным законодательством. Мы получили разрешение на отлов в Германии от «Struktur- und Genehmigungsdirektion Süd», AZ 42/553-254 486/16. В Швейцарии никаких разрешений не требовалось, поскольку отлов в охраняемых районах не производился. Точки отбора проб располагались на расстоянии не менее 200 м друг от друга. Пробы божьих коровок отбирались в каждой точке отбора проб каждые две недели с апреля по июль, что составило восемь циклов отбора проб (таблица S3).Комбинированные ловушки представляют собой комбинацию лотковых ловушек и ловушек с перекрестными окнами, имеющих два плексигласовых окна, расположенных крест-накрест над желтой воронкой с верхним диаметром 42,5 см [44] (S2, рис.). На дне воронки был прикреплен пакет-вихревой пакет ^® (Sigma-Aldrich), наполненный 95% этанолом, обеспечивающий сохранение отловленных божьих коровок сразу после отлова. Каждая липкая ловушка состояла из двух деревянных пластин (891 см x 210 см), окрашенных тремя продольными полосами УФ-отражающей краски (желтой, синей, белой; УФ-отражающая краска Sparvar от Spray-Color GmbH) для максимальной привлекательности (рис. S2).Прозрачную ацетатную фольгу (Folex Foils Laserptinter BG-64 от OfficeWorld Switzerland) прикрепляли к планшетам и наносили на них клей от насекомых (спрей-клей Soveurode от Witasek, Австрия). Фольгу и пакеты устанавливали с двухнедельными интервалами и собирали через четыре дня отбора проб. Это сравнительно длительный период для проб на липких ловушках, предназначенных для генетического использования, но он позволяет собрать достаточное количество особей при разумных усилиях по отбору проб [45]. В 11 немецких ландшафтах, в дополнение к этим двум методам отбора проб с помощью ловушек, пробы были отобраны вручную в местообитаниях в непосредственной близости от точек отбора проб: божьи коровки были собраны сачками из растительности основных типов местообитаний.Все пробы C . септемпунктата и H . axyridis визуально идентифицировали, собирали в отдельные пробирки, наполненные 95% этанолом, и хранили при -18°C до дальнейшей обработки.

Лабораторные процедуры

Чтобы уменьшить содержание ингибиторов ПЦР в телах божьих коровок и свести к минимуму риск потенциального заражения, перед выделением ДНК у божьих коровок удаляли надкрылья, крылья, ноги и головы. Выделение кишок божьих коровок оказалось невозможным из-за разрушения внутренней ткани при хранении в 95% этаноле.Экстракции проводили с помощью набора QIAGEN ^® Frozen Plant Tissue (DNeasy 96) на 619 божьих коровках после гомогенизации с помощью бисерной мельницы QIAGEN ^® TissueLyser II (Qiagen, Манчестер, Великобритания). На каждую экстракционную пластину (96 образцов) помещали от трех до шести отрицательных контролей. Пробирки, предназначенные для отрицательного контроля, обрабатывали точно так же, как и любой другой образец, начиная с выделения ДНК на всех лабораторных этапах до визуализации продукта ПЦР.Для амплификации ДНК тли использовали описанные выше модифицированные праймеры (табл. 1). Метки молекулярного идентификатора (MID-метки) были прикреплены к обеим парам праймеров, чтобы можно было идентифицировать отдельных божьих коровок после объединения во время биоинформатической обработки. Реакционный объем ПЦР 6,5 мкл состоял из 3,125 мкл смеси Multiplex (Quiagen) и 0,125 мкл раствора праймера на праймер, что дало концентрацию праймера 10 пмоль/мкл плюс 2,125 мкл воды и 1 мкл ДНК на реакционную пробирку. Все ПЦР проводились в системе ПЦР GeneAmp9700, выполняющей следующие циклы: 95°С в течение 15 мин, 40 х (94°С в течение 30 с, 51°С в течение 90 с, 72°С в течение 90 с) и терминальная фаза 72°С в течение 10 минут.Условия цикла ПЦР оптимизировали с использованием температурных градиентов ПЦР с последующим исследованием интенсивности продукта ПЦР после гель-электрофореза. Гель-электрофорез проводили в 2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ) в течение 40 мин при 140 В, окрашивали 0,5 мг мл ^-1 SYBR ^® Safe (Thermo Fisher Scientific, Пейсли, Великобритания). ) для выявления успешной ПЦР-амплификации и мониторинга возможного загрязнения отрицательных контролей, включенных в образцы.Все образцы, дающие положительный продукт ПЦР, были количественно оценены с помощью измерений Qubit (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, Великобритания) и объединены эквимолярно в два пула, чтобы обеспечить достаточную глубину считывания для секвенирования. Пулы очищали с помощью SPRIselect (© 2012 Beckman Coulter, Inc.; левая селекция с соотношением 0,8 для обоих пулов) для удаления димера праймера, а затем дополнительно обрабатывали с помощью набора NEXTflex ^® Rapid DNA-Seq Kit от BiooScientific. для здания библиотеки. HTS выполняли с помощью секвенатора Illumina MiSeq Sequencer в Исследовательском центре геномики Школы биологических наук Кардиффского университета с использованием набора реагентов MiSeq v3 от Illumina (600 циклов с 2 x 300 п.н.).Необработанные данные MiSeq для всех образцов, описанных в рукописи, были загружены в архив чтения последовательностей NCBI под номером доступа SRA PRJNA563315. Информацию о процедуре биоинформатики можно найти в разделе биоинформатики ниже и в (Приложении S1), а также подробные таксономические данные на индивидуальном уровне в файле S1 Data.

Биоинформатика

парных прочтений Illumina были отфильтрованы по качеству с использованием Trimmomatic v0.32 [46]. Команда ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 использовался для удаления адаптеров. Начальные и конечные базы низкого качества удалялись, если их показатель качества был ниже 3. Были указаны минимальная длина 250 п.н. и минимальный средний показатель качества базы 20 в скользящем окне из четырех оснований. Затем отфильтрованные чтения были выровнены с использованием FLASH v1.2.11 [47]. Команда trim.seqs использовалась в Mothur v1.37.1 [48] для назначения операций чтения соответствующим идентификаторам образцов на основе комбинаций последовательностей тегов MID (с S5_P1Oligos.txt и S5_P2Oligos.txt для соответствующих пулов, расположенных в файлах S2 и S3), и допуская одно несоответствие до удаления тега MID и праймера. Впоследствии чтения были демультиплексированы в один файл для каждого образца с использованием сделанных на заказ сценариев perl (приложение S1; демультиплексирование). Химерные последовательности наряду с появляющимися менее 10 раз в одном образце удалялись с помощью команд unoise2 и minuniquesize в Usearch v9.2.64 [49]. Это пороговое значение в 10 позже было скорректировано до 13 для пула 1 и 97 для пула 2 в качестве метода смягчения скачков тегов, загрязнения или ошибок секвенирования в соответствии с Dunn et al .[50] (Приложение S1; Предотвращение скачка тегов). Usearch v9.2.64 также использовался для кластеризации похожих последовательностей в центроиды с использованием порога идентичности 99% с использованием алгоритма cluster_fast. Строка заголовка для каждого центроида была затем аннотирована с идентификацией образца перед объединением всех центроидов в один файл, готовый для таксономического присвоения. Алгоритм Blastn в Blast+ [43] использовался для таксономического отнесения к библиотеке, описанной выше, для анализа таксономического разрешения.Параметры Blastn были идентичны тем, которые использовались для определения разрешения таксона в амплифицированной области, т.е. минимальная длина считывания 296 п.н. и минимальное сходство последовательностей 98,36%. Для центроидов, которые не соответствовали библиотеке, поиск Blastn был выполнен в GenBank.

Статистический анализ

Различия в эффективности отбора проб (т. е. количество отловленных божьих коровок на одну ловушку и интервал отбора проб) двух применяемых типов ловушек (клейкие ловушки и комбинированные ловушки) были проанализированы путем запуска обобщенных линейных смешанных моделей (GLMM) с распределением ошибок Пуассона с использованием пакета R. lme4 v1.1–17 [51]. Модели включали тип ловушки, виды божьих коровок ( C . septempunctata и H . axyridis ) и их взаимодействие в качестве фиксированных факторов, а также страну, ландшафт и точку отбора проб в качестве вложенных случайных факторов с 4 интервалами выборки в качестве случайного наклона. . Интервалы отбора проб включали два объединенных раунда отбора проб продолжительностью четыре дня каждый, при этом усилие отбора проб было стандартизировано для двух типов ловушек. Скорость извлечения ДНК (данные о наличии-отсутствии; т. е. количество особей божьих коровок, у которых ДНК тли была обнаружена (наличие) или не обнаружена (отсутствие) с использованием определенного метода отбора проб в точке отбора проб в течение интервала отбора проб) сравнивалась между пробами, отобранными вручную. божьи коровки и божьи коровки, взятые из ловушек.Образцы из двух типов ловушек (клейкие ловушки и комбинированные ловушки) были объединены в этой модели, поскольку не было обнаружено существенных различий в скорости извлечения (не показано). Была запущена GLMM с биномиальным распределением ошибок и такой же случайной структурой, как описано выше. В обеих моделях для статистического вывода использовались тесты логарифмического отношения правдоподобия [52]. Для изучения различий в видах добычи используется C . септемпунктата и H . axyridis , многовариантные различия в обнаруженном видовом составе потребляемых тлей были оценены с использованием функции адониса, реализованной в веганском пакете R (2.5–2) [53]. Функция адониса применяется к мерам расстояния, полученным из матрицы, которая в данном случае содержит доли обнаруженных видов тлей в ландшафте за раунд отбора проб. Перед вычислением евклидовых расстояний матрица была преобразована по методу Хеллингера для работы с относительным типом данных и высоким нулевым отношением [54]. Функция адониса включала виды божьих коровок в качестве фактора с использованием раунда отбора проб в качестве страты для 999 выполненных перестановок, поэтому различия в составе видов тлей не мешали бы различиям между раундами отбора проб.Визуализация данных выполнялась с помощью неметрического многомерного шкалирования (NMDS) преобразованных по Хеллингеру евклидовых расстояний с k = 2 с использованием функции metaMDS. Весь статистический анализ был выполнен в R версии 3.4.1 [55].

Результаты

Выравнивания показали явные несоответствия между последовательностями праймеров, разработанными для этого исследования, и последовательностями божьих коровок (S1 Fig). In silico оценка праймеров, разработанных Harper et al .[20] предположили об успешной амплификации 90,61% тлей и 29,55% кокцинеллид. Однако праймеры, модифицированные для этого исследования, успешно амплифицируют 91,78% тлей и 0% кокцинеллид. Модифицированная пара праймеров достигла повышенной амплификации для Hemiptera в целом и, за исключением относительно низкого процента перепончатокрылых, не амплифицирует ни одну из других оцениваемых хищных групп (рис. 1). Эти результаты были подтверждены в тестах in vitro (рис. S4) с Harper et al. .праймеры достигли широкого успеха в амплификации, при этом не амплифицируются только ихневмонидные осы, хотя некоторые божьи коровки и альтернативные хищники амплифицируются слабо. Модифицированные праймеры, однако, амплифицируют всех тлей (одну немного слабее), но не божьих коровок или альтернативных хищников.

Разрешение таксона области ампликона

Все 1160 последовательностей тлей, исследованных в базе данных GenBank, можно было отнести к роду со сходством последовательностей 98,36% или выше. Из 32 исследованных родов 24 допускали разрешение таксонов до уровня видов, что в общей сложности охватывает 69 видов.В восьми родах таксономическая резолюция к уровню видов было невозможно ( APHIS , Betulaphis , Brachycaudus , Dysaphis , MacrosiphonellaLELLELL , MACROSIPHOM , UROLOUCON , Wahlgreniellaellaellels ). Внутривидовое сходство составило 99,81% ± 0,05 для всех видов, представленных двумя последовательностями и более. Внутриродовая изменчивость рассчитывалась для последовательностей, которые можно было идентифицировать только до уровня рода и которые были представлены более чем двумя таксонами на род.Их среднее сходство последовательностей составило 99,74 ± 0,23%.

OTU извлечены из полевых образцов

Начальное число прочтений после HTS составило 5 668 854 и 2 772 817 в первом и втором циклах секвенирования соответственно, что дает в среднем 6 348 и 8 531 прочтение на образец в каждом пуле. После удаления адаптеров и чтения низкого качества с Trimmomatic v0.32 осталось 1 639 236 и 1 300 972 чтения. После выравнивания с FLASH v1.2.11 было сохранено 1 622 258 и 1 279 716 считываний.Наконец, 1 258 164 и 515 858 последовательностей остались после объединения выровненных последовательностей с соответствующими тегами MID в Mothur v1.37.1. Из 141 OTU (молекулярных операционных таксономических единиц), извлеченных из проанализированных божьих коровок, 43 могут быть отнесены к последовательностям ДНК тлей в библиотеке, а 89 были отнесены к божьим коровкам (данные S1). Восемь OTU не соответствовали ни одной последовательности в библиотеке, поэтому в GenBank был выполнен поиск Blastn. Еще одна OTU может быть отнесена к тле Laingia psammae , однозначно совпадающей с более чем 99% встречаемости у одной особи божьей коровки.В результате количество прочтений составило 83 815 прочтений для тлей и 848 353 прочтений для божьих коровок (см. также кривую разрежения OTU S3 на рис.). Учитывая 0% амплификацию божьих коровок в тестах in silico и in vitro , доля прочитанных божьих коровок, обнаруженная в полевых образцах, довольно высока. Всего у божьих коровок обнаружен 21 род тлей. Четыре таксона ( Aphis , Brachycaudus , Macrosiphum , Wahlgreniella ) можно отнести только к родовому уровню.В общей сложности 20 видов тлей были распределены по 17 другим родам, извлеченным из кишечника божьей коровки. Microlophium carnosum и Aphis spp. были выявлены наиболее распространенные таксоны. Они продемонстрировали как самые высокие числа прочтений (45 492 и 15 057 соответственно), так и самую высокую частоту в кишечнике божьих коровок (обнаружены у 51,1% и 22,6% божьих коровок, положительных на тлю, соответственно) (таблица S4, данные S1).

Сравнение полевых методов отбора проб

Всего 1040 C . септемпунктата и H . axyridis были отобраны двумя методами ловушки (данные S2). Всего при 720 (в среднем на ловушку = 0,53 ± 0,04) особях липкие ловушки дали значительно больше божьих коровок, чем комбинированные (320 особей, в среднем на ловушку = 0,25 ± 0,02). Значительно больше H . axyridis (854), чем C . septempunctata (186) были отловлены. Согласно интерактивному эффекту типа ловушки и видов божьих коровок, представление H . axyridis был сильнее в липких ловушках (88,6% особей), чем в комбинированных ловушках (67,5% особей; рис. 2, табл. 2). Ручной сбор в Германии дал больше божьих коровок, чем ловушка, в результате чего было получено 237 C . септемпунктата и 359 H . axyridis особи.

Рис. 2. Среднее (± SE) количество отобранных божьих коровок с двумя типами ловушек (комбинированные ловушки и липкие ловушки).

Кружки обозначают C . septempunctata и треугольники обозначают H . аксиридис . Раунды выборки указывают на двухнедельные интервалы выборки с апреля по июль. Подробное описание типов ловушек и схемы отбора проб см. в разделе «Методы».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0235054.g002

Восстановление ДНК тли

Генетический анализ был выполнен на подгруппе из 619 божьих коровок (213 C . septempunctata и 406 H . axyridis ), остальные образцы были использованы для палинологических анализов, опубликованных в другом месте [56].Из проанализированных здесь 330 были отобраны вручную, а 289 — с помощью ловушек. ДНК тли была обнаружена у 186 божьих коровок. Из отобранных вручную божьих коровок 167 оказались положительными на тлей, состоящих из 82 C . септемпунктата и 85 H . аксиридис . В общей сложности 19 божьих коровок, у которых была извлечена ДНК тли, были отобраны с помощью ловушек, состоящих из 12 H . axyridis и 7 C . семиточечная . Скорость восстановления ДНК у божьих коровок, отобранных вручную, была почти в восемь раз выше (50.6%), чем в пробах с ловушками (6,6%). Кроме того, восстановление ДНК тли было выше в H . axyridis (41,7%), чем у C . septempunctata (23,9%) (табл. 2, данные S1).

Диета для божьих коровок

Рацион ручной пробы C . septempunctata был более изменчив, чем H . axyridis (многомерная дисперсия: F = 12,03, P = 0,005). Несмотря на некоторое совпадение видового состава тлей, потребляемых двумя видами божьих коровок, анализ выявил значительные различия в видовом составе тлей, потребляемых C . септемпунктата и H . axyridis (рис. 3, F = 4,67, P = 0,020). Microlophium carnosum (крапивная тля, обнаруженная у 88 божьих коровок) и Aphis spp. (обнаружены у 25 божьих коровок) были наиболее распространенными таксонами, потребляемыми обоими видами божьих коровок. Однако М . carnosum чаще потреблялся H . axyridis (72,9%), чем у C . септемпунктата (36.6%, рис. 4, данные S1). Для С . septempunctata , Aphis spp. и S . avenae (злаковая тля) составлял большую долю в рационе (28,0% и 13,4%) по сравнению с H . axyridis (16,5% и 2,4%, рис. 4). Все остальные таксоны тлей были обнаружены только у нескольких особей божьих коровок. Количество божьих коровок, отобранных из ловушек с положительной реакцией на тлю, было слишком низким (всего 19 особей) для статистического сравнения жертв божьих коровок. В то время как божьи коровки, отобранные вручную, дали положительный результат на 18 таксонов тлей, 19 божьих коровок, отобранных с помощью ловушек, дали положительный результат на 12 таксонов, из которых шесть были обнаружены исключительно у божьих коровок, отобранных с помощью ловушек (рис. 4).Таким образом, таксоны тлей, наиболее часто потребляемые божьими коровками, отобранными вручную, также могут быть обнаружены у особей, отобранных из ловушек.

Рис. 3. График ординации NMDS для двух видов божьих коровок, отобранных вручную.

Сравнение видового состава жертв тли. Полная строка с точками C . septempunctata , серые треугольники с пунктирной линией обозначают H . axyridis (напряжение = 0,06), кружки обозначают 95% доверительный интервал.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0235054.g003

Обсуждение

Наши результаты позволяют получить представление о питании тлей двух функционально наиболее важных видов божьих коровок в сельскохозяйственных ландшафтах Центральной Европы, C . септемпунктата и H . axyridis , а также методические возможности и задачи ГТВ как средства исследования пищевого использования насекомых в реальных ландшафтах. Оценка модифицированной пары праймеров показала многообещающие результаты in silico в отношении охвата и специфичности, дополнительно ратифицировано in vitro , при этом модифицированные праймеры показали гораздо большую специфичность в отношении тлей.Широкий спектр таксонов тлей также был амплифицирован от божьих коровок, отобранных в полевых условиях, хотя и с потерей специфичности. Повышенная амплификация хищников для образцов содержимого кишечника может свидетельствовать о том, что идентифицирующие метки, использованные в этом исследовании, увеличивали амплификацию хищников, чего можно было бы избежать, прикрепляя метки с помощью адаптеров для секвенирования, а не до стадии ПЦР, хотя это может быть связано с различными предубеждениями. Область ампликона оказалась подходящей для идентификации тли до уровня вида в большинстве таксонов, что позволило получить представление о диетическом использовании божьих коровок, отобранных вручную.Отбор проб из ловушек в основном характеризовался низкой скоростью извлечения ДНК, в результате чего было получено слишком мало жуков, положительных на тлю, для надежного статистического анализа состава добычи, несмотря на разумное количество отловов в липких ловушках. М . carnosum и Aphis spp. были определены как наиболее часто потребляемая добыча в ручном отборе C . септемпунктата и H . axyridis , а также были распространены у особей, отобранных с помощью ловушек.

Подходит для грунтовки

In silico и in vitro оценка обоих праймеров, разработанных Harper et al .[20] и новые модификации из этого исследования продемонстрировали улучшенную специфичность, достигаемую модифицированными праймерами. Модифицированные праймеры позволили несколько увеличить охват тлей при значительном снижении амплификации кокцинеллид. Отсутствие амплификации многих распространенных групп сельскохозяйственных хищников, таких как пауки и жужелицы, также предполагает, что модифицированные праймеры могут быть более широко применимы к основанному на HTS исследованию хищничества тли другими видами. Доля 94% прочтений хищников, обнаруженных в нашем исследовании, безусловно, находится на верхнем уровне пропорций прочтений хищников, обнаруженных в исследованиях беспозвоночных хищников [9].Тем не менее, in silico , а также in vitro , тесты дают представление о потенциальном смещении праймеров в отношении конкретных таксонов в процессе ПЦР. Тот факт, что модифицированные праймеры имели 0% успеха с кокцинеллидами in silico , указывает на сильную предвзятость против них в ПЦР, что, вероятно, приводит к большей доле прочтений ДНК жертвы после секвенирования, чем было бы достигнуто с праймерами, разработанными Harper et al. . [20] независимо от амплификации хищника.

Случаи, в которых была идентифицирована ДНК божьей коровки, отличная от ДНК хищника, соответствующего каждому образцу, могут указывать на хищничество внутри гильдии. Известно, что божьи коровки занимаются хищничеством внутри гильдии, особенно поеданием яиц и личинок других божьих коровок [57]; хотя это, несомненно, имеет сельскохозяйственное значение, оно выходит за рамки данного исследования, но подчеркивает возможность будущих исследований этого аспекта динамики биоконтроля божьих коровок. В равной степени одновременное присутствие разных божьих коровок в образцах может указывать на перекрестное заражение божьих коровок во время отлова.Однако были предприняты попытки снизить риск этого путем удаления внешних надкрыльев и других второстепенных частей тела, что указывало на большую вероятность вышеупомянутого хищничества внутри гильдии. При амплификации ДНК хищника в диетическом метабаркодировании большой объем генерируемых прочтений хищника может также увеличить скорость скачка метки и неправильного назначения между образцами, что может привести к появлению прочтений хищника в других образцах. Хотя это было бы проблематично для более широких диетических исследований, фокус этого исследования на хищничестве тлей обходит проблему, хотя его, безусловно, стоит рассмотреть для будущих исследований, касающихся хищничества внутри гильдии.

Таксономическая идентификация для этой области ампликона была возможна вплоть до уровня вида в 75% родов европейских тлей на основе используемой библиотеки. Это хорошо, учитывая относительно короткую длину ампликона 308 п.н. и часто загадочную таксономию тлей [58], хотя разрешение может быть слабее в глобальном масштабе. Таксоны с более низким разрешением также оказались трудными для идентификации на уровне вида как морфологически, так и генетически, даже при использовании всей области штрих-кодирования Folmer COI [38].Сомнительно, может ли какой-либо фрагмент последовательности размера, подходящего для анализа содержимого кишечника, способствовать лучшему таксономическому разрешению в COI. Сообщалось о других парах праймеров, специфичных для тлей, для рибосомных 18S и митохондриальных областей штрих-кодирования COII [59, 60], но оба маркера не предоставили достаточных справочных данных по NCBI или BOLD, чтобы даже идентифицировать все виды, обнаруженные в проанализированных здесь кишках божьих коровок. В настоящее время, по-видимому, существует компромисс для широких таксономических оценок между рибосомными и митохондриальными областями штрих-кодирования.Пока неясно, какая область обеспечивает лучшее таксономическое разрешение [21], но в настоящее время наборы праймеров 16S, по-видимому, обеспечивают лучшее таксономическое покрытие, более равномерно амплифицируя таксоны, в то время как для COI доступно гораздо больше информации о последовательностях [21,22]. Обширная справочная база данных для идентификации последовательностей является необходимым условием для любого исследования, направленного на получение реалистичного представления о пищевых привычках изучаемых организмов. Особенно в глобальном масштабе доступность штрих-кода для любого региона ампликона тли все еще низка.Последний подсчет Ли и др. . [61] из примерно 5000 видов тлей, описанных в мире, показали, что только 10% имели штрих-код на одной из широко используемых платформ (BOLD или NCBI), что накладывает серьезные ограничения на HTS.

Методы ловушки и выделение ДНК

В настоящем исследовании липкие ловушки оказались более эффективными при отлове божьих коровок, чем комбинированные ловушки. Тем не менее, восстановление ДНК было одинаково ограничено для обоих типов ловушек, в результате чего очень немногие люди дали положительный результат на ДНК тли в кишках божьих коровок.Ручной отбор образцов в этом отношении кажется более эффективным, при этом скорость извлечения ДНК почти в восемь раз выше, чем у божьих коровок, взятых из ловушек. Несмотря на то, что липкие ловушки не дали достаточных данных для статистической оценки состава добычи тли, они все же дают ценную информацию, позволяющую оценить результаты божьих коровок, отобранных вручную. Доминирующие виды, обнаруженные у божьих коровок, отобранных вручную, были обнаружены и у божьих коровок, отобранных из ловушек. Однако из 12 таксонов, идентифицированных у божьих коровок, отобранных из ловушек, шесть не были обнаружены у божьих коровок, отобранных вручную.Примечательно, что два из этих видов питаются исключительно высокоствольными деревьями, до которых трудно добраться при ручном отборе проб: Chromaphis juglandicola на Juglans regia (грецкий орех) и Tuberculatus annulatus на Quercus spp. (Дуб). Напротив, ни один из видов тлей, обнаруженных у божьих коровок, отобранных вручную, не является специфичным для деревьев с высокими стволами. Еще один заметный результат касается количества таксонов тлей, обнаруженных путем ловушки и ручного отбора проб. Соотношение таксонов тлей, обнаруженных у божьих коровок, к количеству божьих коровок с положительным результатом на тлю было в шесть раз выше у божьих коровок, отобранных из ловушек (0.63), чем у божьих коровок (0,11). Это указывает на то, что информация о рационе, полученная в результате отбора проб вручную, смещена в сторону небольшого количества видов. Учитывая, что уровень обнаружения ДНК тли у особей, отобранных вручную, в восемь раз выше, использование ловушек может показаться высокой ценой за менее предвзятое и более широкое понимание рациона хищников. Тем не менее, скорость восстановления ДНК божьих коровок, пойманных в ловушку, может быть улучшена (например, за счет более коротких периодов активности ловушек), в то время как минимизация систематической ошибки выборки имеет решающее значение для получения информации о рационе божьих коровок в ландшафтном масштабе.Собирая эти результаты вместе, они предполагают, что отбор проб с помощью липких ловушек, вероятно, дает более репрезентативное представление о рационе божьих коровок за счет значительного уменьшения смещения выборки в сторону отобранной местной растительности. Еще одним преимуществом отбора проб с помощью липких ловушек является снижение потенциального перекрестного загрязнения, которое, как сообщается, проблематично при использовании методов, позволяющих взаимодействовать пойманным насекомым в контейнере для отбора проб, таких как комбинированные ловушки, подметание, взбивание или вакуумный отбор проб [12–12]. 14]. Таким образом, существуют некоторые ограничения для этого метода, в основном связанные с компромиссом между эффективностью отбора проб, скоростью извлечения ДНК и трудоемкостью отбора проб.Период полураспада ДНК зависит от многих факторов, но, как правило, для тлей в кишечнике членистоногих хищников он составляет менее суток [20,59]. Показатели обнаружения в полевых образцах, полученных с помощью наших праймеров, были неизвестны, но достаточные уровни отлова были необходимым условием для любого обнаружения ДНК тли и были обеспечены за счет увеличения периода отлова до четырех дней [45]. В будущем мы рекомендуем ежедневный сбор проб из липких ловушек с большим количеством раундов отбора проб и/или ловушек, чтобы обеспечить достаточный размер выборки.Это происходит за счет больших усилий по отбору проб, но представляется необходимым для репрезентативной картины рациона хищников.

Диета для божьих коровок

Из 18 таксонов тлей, идентифицированных в 167 отобранных вручную кишках божьих коровок, шесть таксонов-жертв были разделены между C . септемпунктата и H . аксиридис . М . carnosum было съедено почти в два раза больше, чем H . axyridis как C . семиточечная ; тем не менее, это была основная добыча у обеих божьих коровок.Точно так же процент восстановленных таксонов вредителей был сопоставим между видами божьих коровок (33,4% и 46,7% соответственно), но в отличие от H . аксиридис , С . septempunctata потребляет явно больше S . avenae , что согласуется с выводами Хонека и др. . [62], которые подчеркнули связь между C . septempunctata и зерновые культуры. Большинство других таксонов были обнаружены только у относительно небольшого числа особей божьих коровок обоих видов, с ограниченным перекрытием между C . септемпунктата и H . аксиридис . Соответственно, состав добычи у двух видов божьих коровок значительно различался. Обсуждается несколько причин быстрого увеличения доминирования инвазивного H . axyridis в европейских сообществах божьих коровок, преимущественно внутригильдийное хищничество, по-видимому, обычен в H . axyridis [63] и конкуренция за пищевые ресурсы [64,65]. Совместное использование часто потребляемых жертв тлей, которые специализируются на определенных видах растений-хозяев, как показано в нашем исследовании, безусловно, увеличивает потенциал конкуренции за ресурсы между двумя изученными видами божьих коровок.Получается C . septempunctata уязвимы для конкуренции и хищничества внутри гильдии со стороны H . axyridis и может быть причиной того, что H . axyridis настолько сильно доминирует в местных популяциях божьих коровок, что зафиксировано в этом и других исследованиях [65,66]. Несмотря на эти результаты в соответствии с предыдущими выводами, следует учитывать потенциальную погрешность наблюдателя, присутствующую в образцах божьих коровок, собранных вручную, учитывая, что здесь нельзя исключить влияние выбора местной растительности для отбора проб.По этой причине важно дальнейшее совершенствование методов отбора проб с использованием ловушек.

Выводы и выводы

В этом исследовании освещаются некоторые важные методологические проблемы, но также представлены потенциальные решения для улучшения отбора проб при использовании HTS для изучения использования добычи насекомыми-хищниками в ландшафтном масштабе. Наши модифицированные праймеры дали нам представление о том, как божьи коровки используют божьих коровок в качестве добычи, расширив широкий спектр таксонов тлей, которые можно было идентифицировать до видового уровня.Набор праймеров, использованный в этом исследовании, по-прежнему имеет ограничения как по специфичности, так и по разрешению таксонов, но, поскольку для праймеров, расположенных в более подходящих областях штрих-кодирования, недостаточно справочных данных, мы считаем, что этот праймер, вероятно, является одним из лучших текущих решений для широкого круга задач. таксономические скрининги тлей в кишечнике божьих коровок.

Для получения информации о рационе подвижных летающих насекомых в масштабах, выходящих за пределы местной растительности (например, в ландшафтном масштабе), мы рекомендуем липкие ловушки для будущих исследований.Наши результаты указывают на более полный спектр извлеченных таксонов добычи, включая таксоны из более широкого диапазона местообитаний, которые, вероятно, используются добычей, которые обычно недоступны при ручном отборе проб. Наши выводы относительно видового состава съеденных тлей инвазивным H . axyridis по сравнению с родным C . septempunctata указывают на значительные различия в сообществах жертв, а также на несколько общих жертв тлей, включая виды, специфичные для хозяина.Таким образом, последнее обеспечивает некоторую поддержку реальными сельскохозяйственными ландшафтными данными о конкуренции за ресурсы между инвазивными и местными видами, как это было предложено в предыдущих исследованиях. Доминирование крапивной тли у обоих видов божьих коровок подчеркивает роль крапивы как важного источника среды обитания полезных насекомых в сельскохозяйственных ландшафтах.

Дополнительная информация

S1 Рис. Визуализация сайтов связывания праймеров.

Праймеры, модифицированные для данного исследования, а также те, что использовались Harper et al .(2005) в соответствии с массовым выравниванием таксонов, загруженных через PrimerMiner. Прямой праймер слева, обратный праймер справа, оба выравнивания последовательностей ориентированы в направлении 5’–3’.

10.1371/journal.pone.0235054.s005

(TIF)

S2 Рис. Точка отбора проб с ловушками двух типов.

Комбинированная ловушка (желтая, верхний диаметр 42,5 см) оснащена вихревым пакетом ^® (Sigma-Aldrich), прикрепленным к нижней части, наполненным 95% этанолом, и крышкой сверху для предотвращения разбавления во время дождя.Для липкой ловушки (891 см x 210 см) фольга (Folex Foils Laserptinter BG-64 от OfficeWorld Switzerland) прикрепляется прищепками и/или лентой к цветной доске (желтая, синяя, белая; Sparvar UV-отражающий цвет Spray-Color GmbH) и затем были покрыты клеем (спрей-клеем Soveurode от Witasek, Австрия).

10.1371/journal.pone.0235054.s006

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Юлиуса Кребса, Джо Мари Райфф, Феликса Веделя, Катрин Маджин, Стефана Босхарта, Йонаса Рудина, Дагмави Дереже, Ивеса Нолле и Николаса Хефти за их вклад в полевые работы, а также фермеров, которые позволили нам работать на их земле.Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Ису-Риту Руссо, Анджелу Марчбэнк, Биргит Кляйншмидт и Мигеланхеля Куэнку за их поддержку в лаборатории и биоинформатике, советы Брюса Дигла по разработке праймеров, а также Луи Саттера и Филиппа Жаннере за их статистические консультации.

Каталожные номера

1. 1. Гурр Г.М., Враттен С.Д., Лэндис Д.А., Ю М. Управление средой обитания для подавления популяций вредителей: прогресс и перспективы. Анну Рев Энтомол. 2017; 62: 91–109. пмид:27813664
2. 2.Саттер Л., Альбрехт М., Жаннерет П. Ландшафтное озеленение и локальное создание полос диких цветов и живых изгородей способствуют множеству экосистемных услуг. 2017; 1–9.
3. 3. Чуми М., Альбрехт М., Энтлинг М. Х., Жакот К. Высокая эффективность цветочных полосок по индивидуальному заказу в снижении вредителей и повреждения сельскохозяйственных культур. Proc R Soc B Biol Sci. 2015;282:20151369.
4. 4. Биркхофер К., Билунд Х., Далин П., Ферлиан О., Гагич В., Хамбек П.А. и др. Методы идентификации жертв беспозвоночных хищников в наземных полевых исследованиях.Эколь Эвол. 2017;7: 1942–1953 гг. пмид:28331601
5. 5. Помпанон Ф., Дигл Б.Е., Симондсон ВОК, Браун Д.С., Джарман С.Н., Таберлет П. Кто что ест: оценка диеты с использованием секвенирования следующего поколения. Мол Экол. 2012; 21: 1931–1950. пмид:22171763
6. 6. Эйцингер Б., Абрего Н., Гравел Д., Хуотари Т., Вестеринен Э.Дж., Рослин Т. Оценка изменений во взаимодействии членистоногих хищник-жертва с помощью анализа содержимого кишечника на основе ДНК – изменчивая среда, стабильная диета. Мол Экол. 2019; 28: 266–280.пмид:30230073
7. 7. Пирсон К.Э., Саймондсон В.О.К., Клэр Э.Л., Ормерод С.Дж., Ипаррагирре Боланьос Э., Воан И.П. Влияние пастбищной интенсификации на пищевые взаимодействия хищников широкого профиля в ручьях. Мол Экол. 2018; 27: 590–602. пмид:29219224
8. 8. Berkvens N, Landuyt C, Deforce K, Berkvens D, Tirry L, de Clercq P. Альтернативные корма для разноцветной азиатской божьей коровки Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae). Евр Дж Энтомол. 2010; 107: 189–195.
9. 9. Пиньол Дж., Сан-Андрес В., Клэр Э.Л., Мир Г., Саймондсон ВОК. Прагматичный подход к анализу рациона универсальных хищников: использование секвенирования нового поколения без блокирующих зондов. Мол Эколь Ресурс. 2014; 14: 18–26. пмид:23957910
10. 10. Томас А.П., Тротман Дж., Уитли А., Эби А., Зиндел Р., Браун П.М.Дж. Поедание местных кокцинеллид инвазивным пришельцем Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae): обнаружение в Великобритании с помощью анализа кишечника на основе ПЦР.Дайверы по сохранению насекомых. 2013;6: 20–27.
11. 11. Triltsch H. Содержимое кишечника взрослой особи Coccinella septempunctata (Col.: Coccinellidae), отобранной в полевых условиях. Энтомофаги. 1997; 42: 125–131.
12. 12. Атей К.Дж., Чепмен Э.Г., Харвуд Д.Д. История о двух жидкостях: вызывает ли совместное хранение образцов в жидком консерванте перекрестное загрязнение ДНК при молекулярном исследовании содержимого кишечника? Entomol Exp Appl. 2017; 163: 338–343.
13. 13. Greenstone MH, Weber DC, Coudron TC, Payton ME.Ненужная грубость? Проверка гипотезы о том, что хищников, предназначенных для молекулярного анализа содержимого кишечника, необходимо собирать вручную, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Мол Эколь Ресурс. 2011; 11: 286–293. пмид:21429135
14. 14. Кинг Р.А., Дэйви Дж.С., Белл Дж.Р., Рид Д.С., Бохан Д.А., Симондсон ВОК. Всасывающие пробы как существенный источник ошибок в молекулярном анализе рационов хищников. 2012 г.; 261–266. пмид:22040612
15. 15. Чепмен Дж. А., Кингхорн Дж. М. Оконные ловушки для насекомых.Можно Энтомол. 1955; 87: 46–47.
16. 16. Дуэлли П., Обрист М.К., Шматц Д.Р. Оценка биоразнообразия агроландшафтов: наземные насекомые. 1999;74: 33–64.
17. 17. Gagnon AÈ, Doyon J, Heimpel GE, Brodeur J. Успех обнаружения ДНК жертвы после переваривания хищниками внутри гильдии: влияние видов добычи и хищника. Мол Эколь Ресурс. 2011; 11: 1022–1032. пмид:21749673
18. 18. Харпер Г.Л., Шеппард С.К., Харвуд Д.Д., Рид Д.С., Глен Д.М., Бруфорд М.В. и др.Оценка гель-электрофореза в температурном градиенте для анализа ДНК добычи в кишечнике беспозвоночных хищников. Бык Энтомол Рез. 2006; 96: 295–304. пмид:16768818
19. 19. Дигл Б.Е., Ивсон Дж.П., Джарман С.Н. Количественная оценка повреждений ДНК, извлеченных из сильно разложившихся образцов — тематическое исследование ДНК в фекалиях. Фронт Зоол. 2006; 3: 1–10.
20. 20. Харпер Г.Л., Кинг Р.А., Додд К.С., Харвуд Д.Д., Глен Д.М., Бруфорд М.В. и др. Быстрый скрининг беспозвоночных хищников на наличие нескольких мишеней ДНК жертв.Мол Экол. 2005; 14: 819–827. пмид:15723673
21. 21. Кларк Л.Дж., Субриер Дж., Вейрих Л.С., Купер А. Меташтрихкоды окружающей среды для насекомых: ПЦР in silico выявляет возможность таксономической предвзятости. Мол Эколь Ресурс. 2014; 14: 1160–1170. пмид:24751203
22. 22. Эльбрехт В., Таберле П., Дежан Т., Валентини А., Уссеглио-Полатера П., Бейзель Дж. Н. и др. Тестирование потенциала рибосомного маркера 16S для метабаркодирования ДНК насекомых. Пир Дж. 2016;4: e1966. пмид:27114891
23. 23.Альберди А., Айзпуруа О., Гилберт МТП, Бохманн К. Тщательное изучение ключевых шагов для надежного метабаркодирования образцов окружающей среды. 2018; 2018: 134–147.
24. 24. Symondson WOC, Sunderland KD, Greenstone MH. Могут ли редаторы Generalist P быть эффективными агентами биоконтроля? Анну Рев Энтомол. 2002; 47: 561–594. пмид:11729085
25. 25. Страуб К.С., Снайдер В.Е. Видовая идентичность доминирует в отношениях между биоразнообразием хищников и подавлением травоядных. Экология.2006; 87: 277–282. пмид:16637351
26. 26. Адрианс Т., Сан-Мартин И. Гомес Г., Маес Д. История вторжения, предпочтения среды обитания и фенология инвазивной божьей коровки Harmonia axyridis в Бельгии. От биологического контроля к вторжению: божья коровка Harmonia Axyridis как модельный вид. 2008.
27. 27. Brown PMJ, Adriaens AT, Bathon AH, Cuppen AJ, Goldarazena AA, Hägg AT, et al. Harmonia axyridis в Европе: распространение и распространение неместной кокцинеллиды. БиоКонтроль.2008; 53: 5–21.
28. 28. Эванс Э.В. Смещение мест обитания североамериканских божьих коровок интродуцированными видами. Экология. 2004; 85: 637–647.
29. 29. Эшен Р., Бабендрайер Д., Науэр С., Биглер Ф., Кенис М. Исследования божьих коровок (Coleoptera: Coccinellidae) в Швейцарии и подтверждение присутствия инвазивных чужеродных видов божьих коровок Harmonia axyridis (Pallas). Mitteilungen der Schweizerischen Entomol Gesellschaft. 2007; 80: 7–14.
30. 30. Клаузницер Б.Harmonia axyridis (Pallas, 1773) в Германии (Col., Coccinellidae). Энтомол Нахр Бер. 2002; 46: 177–183.
31. 31. Альхмеди А., Хаубрюге Э., Фрэнсис Ф. Роль ассоциаций растений-жертв и растений-хозяев в размножении и хищнической эффективности Harmonia axyridis и Episyrphus balteatus. Entomol Exp Appl. 2008; 128: 49–56.
32. 32. Посуда RL, Majerus MEN. Внутригильдийное хищничество неполовозрелых стадий британских и японских кокцинеллид инвазивной божьей коровкой Harmonia axyridis.От биологического контроля к вторжению: божья коровка Harmonia axyridis как модельный вид. Спрингер; 2007. стр. 169–188.
33. 33. Бенсон Д.А., Кларк К., Карш-мизрахи И., Липман Д.Дж., Остелл Дж., Сэйерс Э.В. ГенБанк. 2014; 42: 32–37. пмид:24217914
34. 34. Эльбрехт В., Лиз Ф., Эльбрехт В. Проверка и разработка праймеров метабаркодирования ИСП для биооценки пресноводных макробеспозвоночных. 2017; 1–17.
35. 35. Кирс М., Мойр Р., Уилсон А., Стоунз-Хавас С., Чунг М., Старрок С. и др.Geneious Basic: интегрированная и расширяемая настольная программная платформа для организации и анализа данных о последовательностях. Биоинформатика. 2012; 28: 1647–1649. пмид:22543367
36. 36. Katoh K, Misawa K, Kuma K, Miyata T. MAFFT: новый метод быстрого множественного выравнивания последовательностей, основанный на быстром преобразовании Фурье. 2002; 30: 3059–3066.
37. 37. Эй ОЭ. Aphidoidea (Hemiptera) Фенноскандии и Дании. Брилл; 1986.
38. 38. Clamens A, Coeur A, Cruaud A, Artige E, Pierre E, Hudaverdian S, et al.Штрих-кодирование ДНК и связанный веб-сайт PhylAphidB@se для идентификации европейских тлей (Insecta: Hemiptera: Aphididae). 2014;9. пмид: 24896814
39. 39. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R. Vrijenhoek (1994) ДНК-праймеры для амплификации субъединицы I митохондриальной цитохром-с-оксидазы из различных многоклеточных беспозвоночных. Мол Мар Биол Биотехнолог. 1994;3: 294. pmid:7881515
40. 40. Ларкин М.А., Блэкшилдс Г., Браун Н.П., Ченна Р., Макгеттиган П.А., Маквильям Х. и др.Clustal W и Clustal X версии 2.0. Биоинформатика. 2007; 23: 2947–2948. пмид:17846036
41. 41. Холл ТА. BioEdit: удобный редактор выравнивания биологических последовательностей и программа анализа для Windows 95/98/NT. Серия симпозиумов по нуклеиновым кислотам. [Лондон]: Information Retrieval Ltd., 1979–2000 гг.; 1999. С. 95–98. https://doi.org/10.1093/nass/42.1.95
42. 42. Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М., Кумар С. MEGA5: Молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии Исследовательский ресурс.2011; 28: 2731–2739. пмид:21546353
43. 43. Камачо С., Кулурис Г., Авагян В., Ма Н., Пападопулос Дж., Билер К. и др. BLAST+: архитектура и приложения. 2009; 9: 1–9. пмид:20003500
44. 44. Обрист М.К., Дуэлли П. Экспресс-оценка биоразнообразия членистоногих для мониторинга среднего местного видового богатства и соответствующих экосистемных услуг. Биодайверс Консерв. 2010;19: 2201–2220.
45. 45. Стивенс Э.Дж., Лоузи Дж.Э. Сравнение липких карт, визуальной и сплошной выборки популяций кокцинеллид в люцерне.Окружающая среда Энтомол. 2004; 33: 535–539.
46. 46. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательностей Illumina. Биоинформатика. 2014;30: 2114–2120. пмид:24695404
47. 47. Магоч Т., Зальцберг С.Л. FLASH: быстрая корректировка длины коротких считываний для улучшения сборки генома. Биоинформатика. 2011; 27: 2957–2963. пмид:21

    9

48. 48. Schloss PD, Westcott SL, Ryabin T, Hall JR, Hartmann M, Hollister EB, et al. Представляем mothur: открытое, независимое от платформы, поддерживаемое сообществом программное обеспечение для описания и сравнения микробных сообществ.Appl Environ Microbiol. 2009; 75: 7537–7541. пмид:19801464
49. 49. Эдгар РК. Поиск и кластеризация на несколько порядков быстрее, чем BLAST. Биоинформатика. 2010; 26: 2460–2461. пмид: 20709691
50. 50. Dunn JC, Stockdale JE, Moorhouse-Gann RJ, McCubbin A, Hipperson H, Morris AJ, et al. Упадок горлицы: диетические связи с состоянием тела и конкуренция с другими голубями проанализированы с использованием высокопроизводительного секвенирования. Мол Экол. 2018; 27: 3386–3407.
51. 51. Бейтс Д., Махлер М., Болкер Б., Уокер С., Кристенсен Р.Х.Б., Сингманн Х. и др. Пакет ‘lme4.’ Линейная модель смешивания с использованием версии S4 классов R Packag. 2011 г.; 1.
52. 52. Зуур А.Ф., Иено Э.Н., Уокер Н.Дж., Савельев А.А., Смит Г.М. Требуемые предварительные знания: пример линейной регрессии и аддитивного моделирования; Использованная литература; Показатель. Смешайте Eff Model Extensions Ecol с R. 2009;1: 574.
53. 53. Оксанен Дж. Многофакторный анализ экологических сообществ в R: веганский учебник.Университет Оулу, Оулу. 2007.
54. 54. Лежандр П., Лежандр Л. Численная экология, 2-е изд. Модель среды разработки. 1998; 20: 870 стр.
55. 55. Пинейро Дж., Бейтс Д., Деброй С., Саркар Д. Р. Основная группа (2017) nlme: линейные и нелинейные модели смешанных эффектов. Пакет R версии 3.1–131. Программное обеспечение для вычислений] Получено с https://CRAN.R-project.org/package=nlme. 2017.
56. 56. Бертран С., Эккертер П.В., Амманн Л., Энтлинг М.Х., Гобет Э., Херцог Ф. и другие. Сезонные сдвиги и дополнительное использование источников пыльцы двумя видами пчел, златоглазкой и божьей коровкой в ​​европейских сельскохозяйственных ландшафтах.2019; 1–12.
57. 57. Гардинер М.М., О’Нил М.Е., Лэндис Д.А. Внутригильдийное хищничество и местная божья коровка приходят в упадок. ПЛОС Один. 2011;6.
58. 58. Ортис-Ривас Б., Мартинес-Торрес Д. Комбинация молекулярных данных подтверждает существование трех основных линий в филогении тлей (Hemiptera: Aphididae) и базальное положение подсемейства Lachninae. Мол Филогенет Эвол. 2010; 55: 305–317. пмид:20004730
59. 59. Чен Ю., Джайлз К.Л., Пейтон М.Э., Гринстоун М.Х.Выявление основных хищников злаковых тлей с помощью молекулярного анализа кишечника. Мол Экол. 2000; 9: 1887–1898 гг. пмид:110
60. 60. Staudacher K, Jonsson M, Traugott M. Диагностические анализы ПЦР для выявления взаимодействий пищевых цепей в зерновых культурах с акцентом на биологическую борьбу с тлей. J Pest Sci (2004). 2016; 89: 281–293. пмид:26924957
61. 61. Lee Y, Lee W, Kanturski M, Foottit RG, Akimoto S-I, Lee S. Загадочное разнообразие подсемейства Calaphidinae (Hemiptera: Aphididae), выявленное с помощью комплексного штрих-кодирования ДНК.ПЛОС Один. 2017;12: e0176582. пмид:28448639
62. 62. Хонек А., Мартинкова З. Долгосрочные изменения численности Coccinella septempunctata (Coleoptera: Coccinellidae) в Чешской Республике. Евр Дж Энтомол. 2005; 102: 443–448.
63. 63. Пелл Дж. К., Баверсток Дж., Рой Х.Е., Уэр Р.Л., Майерус МЕН. Хищничество внутри гильдии с участием Harmonia axyridis: обзор текущих знаний и перспективы на будущее. БиоКонтроль. 2008; 53: 147–168.
64. 64. Рой Х., Браун П., Майерус М.Harmonia axyridis: успешный агент биоконтроля или инвазивная угроза? Экологический и социальный подход к биологическому контролю. Спрингер; 2006. С. 295–309.
65. 65. Хонек А., Мартинкова З., Диксон А.Ф.Г., Рой Х.Е., Пекар С. Долгосрочные изменения в сообществах местных кокцинеллид: колебания популяции и влияние конкуренции со стороны инвазивных неместных видов. Дайверы по сохранению насекомых. 2016;9: 202–209.
66. 66. Альхмеди А., Хаубрюге Э., Фрэнсис Ф. Влияние среды обитания двудомной крапивы на хищников-афидофагов и паразитоидов на полях пшеницы и зеленого горошка с особым вниманием к захватчику Harmonia axyridis Pallas (Coleoptera: Coccinellidae).Энтомол науч. 2009; 12: 349–358.

Передовые методы измерения, применяемые в Центре поддержки исследований Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии: Учебник по наборам данных об измеренном и смоделированном потреблении энергии за 2011 год

Современные здания представляют собой сложные энергетические системы, которые необходимо контролировать для обеспечения энергоэффективности. Центр поддержки исследований (RSF) в Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии (NREL) имеет сотни контроллеров — компьютеров, которые взаимодействуют с различными системами управления зданием — для управления зданием на основе десятков тысяч переменных и точек датчиков.Эти стратегии управления были разработаны для систем RSF, чтобы эффективно поддерживать исследовательскую деятельность. Многие события, влияющие на использование энергии, невозможно надежно предсказать, но определенные решения (например, стратегии управления) необходимо принимать заранее. Исследователи NREL смоделировали системы RSF, чтобы предсказать, как они могут работать. Затем они контролируют эти системы, чтобы понять, как они на самом деле работают и реагируют на динамические условия погоды, занятости и обслуживания.

4 Ресурсы данных

История версий ресурса данных

История версий ресурса данных

История версий ресурса данных

История версий ресурса данных

Отправлено

•  март  • 25 2016

Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии

Информация об авторе

Майкл Шеппи, Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии

А.Пляж, Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии

Шанти Плесс, Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии

Процитировать этот набор данных

Шеппи, Майкл; Бич, А .; Плесс, Шанти (2016): Передовые методы измерения, применяемые в Центре поддержки исследований Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии: Учебник по наборам данных об измеренном и смоделированном потреблении энергии за 2011 год.Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии. https://data.nrel.gov/submissions/40

Об этом наборе данных

я бы 40

Статус Общественный

Последнее обновление 25.03.2016

МЭ Проект

GO28308 Поддерживать полную доступность существующей научной и вспомогательной инфраструктуры

Финансирующая организация

Министерство энергетики (DOE)

Спонсорская организация

Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии

Области исследований

Эффективность зданий

Энергетический анализ