Влагостойкая пгп: Пазогребневая плита (ПГП) полнотелая KNAUF влагостойкая 667х500х80 мм

Влагостойкие пазогребневые плиты – описание, размеры, производители, использование

 

Вступление

В любом жилом помещении есть комнаты с повышенной влажностью. В квартирах и частных домах это, прежде всего ванная комната. Специально для подобных помещений выпускают влагостойкие пазогребневые плиты. О них пойдет речь в этой статье.

Влагостойкие пазогребневые плиты

По определению влагостойкие пазогребневые плиты это строительный материал для устройства перегородок и других конструкций во влажных помещениях: ванной, туалете, душевой. Посмотреть душевую с обогревом можно на сайте.

В физике, есть понятие гидрофобность. Это свойство вещества отталкивать воду на молекулярном уровне. Если более точно, то молекулы этого вещества боятся вступления в реакцию с водой и избегают её.

Водоотталкивающие вещества используются при производстве строительных материалов, чаще в виде специальных гидрофобных добавок. Добавление их в тот или иной строительный материал, делает его влагостойким.

Именно на этих принципах производят влагостойкие пазогребневые плиты. Благодаря гидрофобным добавкам гипс являющейся основой ПГП приобретает водоотталкивающие свойства и сама плита может использоваться во влажных помещениях.

Производители

Основным производителем влагостойких ПГП была и остается компания Кнауф. Компания выпускает полнотелые влагостойкие плиты размерами 500×667×80 мм и  500×667×100 мм. Вес первой плиты 29 кг, второй 37 кг.

«Наступает на пятки» компании Кнауф, компания Волма. Они выпускают как полнотелые, так и пустотелые влагостойкие плиты. Вес последних облегчён за счет сделанных в конструкций плиты круглых поперченных полостей. Размер плит Волма 500×667×80 мм, вес 22 кг. Волма Гидро полнотелая размером 667х500х100 мм, весит 36,6 кг.

Есть влагостойкие пазогребневые плиты (ПГП) в ассортименте компаний Магма и Русеан, а также Пешеланский и Пермский гипсовые заводы и наверняка другие заводы.

Как отличить?

Отличить влагостойкую плиту компаний Волма и Кнауф очень просто. Как и в варианте влагостойких листов гипсокартона, у которых зеленая картонная облицовка, влагостойкие плиты имеют визуально заметный зеленый оттенок.

Использование

Применяются влагостойкие пазогребневые плиты в помещениях с влажностью до 60%. Монтируются влагостойкие плиты по общим правилам монтажа ПГП на монтажную смесь или плиточный клей.

Аккуратный монтаж позволяет не штукатурить стены из ПГП, а сразу проводить шпаклёвку поверхности и её последующую отделку или сразу укладывать керамическую плитку.

Это экономит время и условно снижает затраты, которые вы производите на покупку плит ПГП.      

Еще одно использование влагостойких ПГП, о которых мало упоминают, это неотапливаемые помещения дома. В отличие от простых плит они не восприимчивы к конденсату, который образуется на стенах неотапливаемых помещений из-за перепадов температур.

Итог

В статье я описал влагостойкие пазогребневые плиты (ПГП), их размеры, общие характеристики, места использования и основных производителей.

©gipsokart.ru

Еще статьи

 

Влагостойкие пазогребневые плиты оптом и в розницу

Пазогребневые влагостойкие или гидрофобизированные плиты отличаются особыми характеристиками, позволяющие использовать их в помещениях с повышенной влажностью. Это достигается наличием в их составе особых водоотталкивающих веществ, в частности, силиконов. Эти вещества, а не специальное окрашивание, придает водостойкой пгп зеленоватый оттенок.

Основной областью применения водостойких пгп – монтаж стен и перегородок в помещениях с повышенной влажностью, например, кухнях и санузлах. Пустотелые и полнотелые водостойкие пгп также применяют в промышленном строительстве, и даже для монтажа стен в неотапливаемых помещениях: сельскохозяйственных комплексах, складах и гаражах.

Стоимость влагостойких пгп несколько больше, чем обычных, хотя их характеристики позволяют применять в любом помещении, рекомендуется целевое применение для влажных помещений. Несмотря на высокие водостойкие характеристики, для качественной эксплуатации материала требуются некоторые условия, в частности, удовлетворительная вентиляция, необходимая для того чтобы материал отдавал накопленную влагу. Если влагостойкая пгп подвергается прямому действию капиллярной воды или пара, требуется надежная гидроизоляция наружного слоя. При соблюдении данных условий стена, сложенная из влагостойкой пазогребневой плиты, прослужит много лет, сохраняя целостность и хороший внешний вид.

Пазогребневый стык и небольшой размер позволяет сделать сборку любой конструкции из ПГП быстрым и простым процессом, а ровная поверхность облегчает дальнейшую обработку стены и отделку. Среди главных производителей водостойких пазогребневых плит можно отметить бренды Кнауф (Германия) и Волма (Россия).

Почему стоит приобрести влагостойкие ПГП на нашем сайте?

Купить любое количество водостойких пгп по наиболее выгодной стоимости можно у официального поставщика строительных и отделочных материалов, в компании Центр Строительной Комплектации. Компания предлагает высококачественную продукцию компании Knauf и занимающего второе место на рынке Волгоградского гипсового завода, который производит водостойкие пгп под брендом Волма.

Каждый клиент Центра Строительной Комплектации при первом же обращении получает в свое распоряжение персонального консультанта, который всегда на связи. Материалы в достаточных количествах хранятся на складах компании, поэтому будут доставлены совершенно бесплатно на объект в день поступления заказа. Вы можете оформить заявку на любые объемы водостойких полнотелых и пустотелых пгп, получить скидку и воспользоваться специальными акциями на отдельные виды товаров.

Пазогребневая плита ПГП 667*500*100 мм влагостойкая Кнауф

Описание

Плита пазогребневая гипсовая блок ПГП пазогребневый Кнауф полнотелая влагостойкая  представляет собой монолитное изделие в форме прямоугольного параллелепипеда с пазогребневым стыком с повышенной влагостойкостью. Гипсоплита Кнауф изготавливается из гипсового вяжущего по литьевой технологии с добавлением в формовочную массу специальных добавок, уменьшающих водопоглощение. Современные технологии позволяют получить плиты с отличным качеством лицевой поверхности и высокой точностью размеров.

 

Преимущества

•  Гипсоплита КНАУФ обладает повышенной влагостойкостью.
•  Высокое качество
•  Использование плит снижает затраты на штукатурные работы.
•  После обработки швов поверхность пригодна под окраску, оклейку обоями и облицовку плиткой.
•  Материал негорючий.
•  Плиты не содержат токсичных компонентов и веществ.
•  Изделия имеют высокую паро- и газопроницаемость.
•  Легко поддаются механической обработке.

 

Пазогребневая гипсовая плита ПГП Кнауф влагостойкая  длиной 66,7 см и высотой 50 см заменяет 14 полуторных силикатных кирпичей или 20 штук одинарных красных (250х120х65мм). Перегородки пазогребневый блок предназначены для установки в жилых и общественных зданиях с высотой потолка не более 4,2 м.

Строительный гипс — экологически чистый и дышащий материал. Поэтому перегородки из него соответствует жестким санитарно-гигиеническим нормам, регламентирующим качество отделочных материалов. Для улучшения эксплуатационных и прочностных характеристик в гипс добавляют пластифицирующие добавки.

Для снижения водопоглощения в исходное сырье добавляют гранулированный доменный шлак и портландцемент. Для того, чтобы отличать такие плиты от обычных, их окрашивают в зеленый цвет.

По уровню теплоизоляции пазогребневая гипсовая плита толщиной 100 мм равноценна бетонной стене толщиной 600 мм. Коэффициент шумоизоляции у нее  составляет от 34 до 40 дб, что является хорошим показателем для перегородочных конструкций.

Огнестойкость полнотелых гипсовых блоков очень высока. Они способны в течение 3 часов выдерживать прямое воздействие огня (температура около +1100 С) без потери несущей способности.

Перегородки, построенные из гипсовых пазогребневых плит (ПГП), характеризуются достаточно высокой несущей способностью. Поэтому на них можно вешать полки, кухонные шкафчики, умывальники и другие бытовые конструкции.

 

Продукция Кнауф на нашем сайте

Сайт производителя сертификат соответствия

 

Плита пазогребневая влагостойкая пустотела 667х500х80мм ПГП Гипсополимер

Описание товара:

ПГП пустотелая 667х500х80 влагостойкие очень современная версия влагостойкой плиты, которая представляет собой ровный параллелепипед, со специальными пазами для стыковки. Изготовлен ПГП из экологичного материала. Материал очень устойчив к внешней среде и имеет множество способностей. Является негорючим, а также не имеет запаха. Его удивительные свойства способствуют звукоизоляции в помещении.

Область и способы применения:

ПГП влагостойкие пустотелые используют повсеместно. Специальный состав и метод изготовления по литьевой технологии делает ПГП 8-ку одним из лидеров для устройства перегородок в помещениях. Хорошо подходят в помещениях с практически любым уровнем влажности, т.

к. они влагостойкие. Для удобства использования, плиты имеют маркировку в местах крепления.

Технические характеристики и преимущества:

ПГП пустотелая имеет ряд значительных преимуществ, благодаря которым их выбирают многие профессионалы. Материал не содержит токсичных веществ. Немаловажно, что ПГП обладают высокой паропроницаемостью, что важно для квартирных и общественных помещений. Выбрал Пустотелые плиты ПГП 667х500х80 вы получите явную экономию в транспортировке материала, ведь он намного легче его аналогов. Он легко монтируется и без специального оборудования. Установкой можно заниматься даже одному. Не требует специальных штукатурных работ.

Согласно ТУ 5742-003-05287561-2003

Плиты изготавливаются из гипсового вяжущего с добавлением пластифицирующих и гидрофобных добавок по литьевой технологии и предназначены для устройства перегородок в зданиях и помещениях различного назначения с сухим, нормальным и влажным влажностным режимом по СНиП II-3-79*.

Пазогребневые плиты влагостойкие пустотелые имеют маркировочную подкраску зеленоватого оттенка. Предназначены для устройсва перегородок в зданиях и помещениях различного назначения с сухим, нормальным и влажностным режимом по СНиП 23-02-2003.

Изготовлены из экологически чистого природного материала, являются негорючими, не содержат токсических веществ, не имеют запаха, обладают высокой звукоизолирующей способностью и высокой паро-, газопроницаемостью. Водопоглощение влагостойких пустотелых пазогребневых плит Гипсополимер – 5%.

Идеальная поверхность и точность геометрических размеров пазогребневых плит позволяют не проводить штукатурных работ. Сам процесс сборки стены из такой плиты похож на принцип детского конструктора ЛЕГО, где изделия скрепляются между собой путем сцепления паза и гребня.

Использование пазогребневой перегородочной плиты Гипсополимер в строительстве – это реальная возможность снижения себестоимости жилья за счет экономии на рабочей силе и строительных материалах, а также – сокращение сроков строительства.

Преимущества применения влагостойких пустотелых пазогребневых плит Гипсополимер при возведении перегородок:

Пустотелая плита ПГП при всех достоинствах полнотелой имеет явные преимущества:

Она на 25% легче своей предшественницы, а по прочностным характеристикам отнюдь не уступает.
Использование пустотелой плиты дает экономию на транспортной доставке, т.к. позволяет увеличить количество единоразовой перевозки.
Легко монтируется высокая производительность устройства перегородок без специального оборудования: один человек выполняет от 20 до 30 кв.м в смену.

Экономия полезной площади за счет более тонкой, но прочной перегородки.
Возможность возводить как одинарные, толщиной 80мм, так и двойные межквартирные перегородки.
Дверные и оконные проемы до 900 мм можно монтировать без закладных (перемычек).
Не требуется оштукатуривание (нет мокрых процессов) перегородка сразу после возведения готова к облицовке плиткой, оклейке обоями, а для проведения малярных работ(покраске) требуется только финишное шпаклевание.

“ВОЛМА-ПГП”, пазогребневая плита пустотелая ВЛАГОСТОЙКАЯ

ПГП – Пазогребневые плиты «ВОЛМА»  пустотелые  ВЛАГОСТОЙКИЕ

Пазогребневая влагостойкая пустотелая плита ВОЛМА представляет собой прямоугольный параллелепипед, с пазами и гребнями по опорной и стыковочной поверхностям.

Плиты изготавливаются из гипсового вяжущего с добавлением пластифицирующих и гидрофобных добавок по литьевой технологии и предназначены для устройства перегородок в зданиях и помещениях различного назначения с сухим, нормальным и влажным влажностным режимом.

Пазогребневые плиты влагостойкие пустотелые имеют маркировочную подкраску зеленоватого оттенка. Изготовлены из экологически чистого природного материала, являются негорючими, не содержат токсических веществ, не имеют запаха, обладают высокой звукоизолирующей способностью и высокой паро-, газопроницаемостью. Водопоглощение влагостойких пустотелых пазогребневых плит ВОЛМА – 5%.

Идеальная поверхность и точность геометрических размеров пазогребневых плит позволяют не проводить штукатурных работ. Сам процесс сборки стены из такой плиты похож на принцип детского конструктора ЛЕГО, где изделия скрепляются между собой путем сцепления паза и гребня. Для фиксации плит используется гипсовый клей «ВОЛМА-МОНТАЖ» или «ВОЛМА-МОНТАЖ МОРОЗ» при отрицательных температурах.

Использование пазогребневой перегородочной плиты ВОЛМА в строительстве – это реальная возможность снижения себестоимости жилья за счет экономии на рабочей силе и строительных материалах, а также – сокращение сроков строительства.

Преимущества применения влагостойких пустотелых пазогребневых плит ВОЛМА при возведении перегородок:

Пустотелая плита ПГП при всех достоинствах полнотелой имеет явные преимущества:

Она на 25% легче своей предшественницы, а по прочностным характеристикам отнюдь не уступает.

Легко монтируется высокая производительность устройства перегородок без специального оборудования: один человек выполняет от 20 до 30 кв.м в смену.

Экономия полезной площади за счет более тонкой, но прочной перегородки.

Возможность возводить как одинарные, толщиной 80мм, так и двойные межквартирные перегородки.

Дверные и оконные проемы до 900 мм можно монтировать без закладных (перемычек).

Не требуется оштукатуривание (нет мокрых процессов) перегородка сразу после возведения готова к облицовке плиткой, оклейке обоями, а для проведения малярных работ или покраске требуется только финишное шпаклевание.

Выпускается на европейском оборудовании.

Технические характеристики:

Вес: не более 22 кг

Толщина: 80 мм

Длина: 667 мм

Высота: 500 мм

ТЕПЛОПРИБОР в Иркутске, дополнительная информация по телефонам: 22-77-55, 22-77-11.

Пазогребневая плита ВОЛМА полнотелая влагостойкая 667*500*80 мм

Пазогребневые плиты ПГП ВОЛМА полнотелые

Пазогребневая плита ВОЛМА представляет собой прямоугольный параллелепипед, с пазами и гребнями по опорной и стыковочной поверхностям.

Согласно ТУ 5742-003-05287561-2003 Плиты изготавливаются из гипсового вяжущего с добавлением пластифицирующих и гидрофобных добавок по литьевой технологии и предназначены для устройства перегородок в зданиях и помещениях различного назначения с сухим, нормальным и влажным влажностным режимом по СНиП II-3-79*.

Пазогребневые плиты влагостойкие имеют маркировочную подкраску зеленоватого оттенка. Предназначены для устройсва перегородок в зданиях и помещениях различного назначения с сухим, нормальным и влажностным режимом по СНиП 23-02-2003.
Изготовлены из экологически чистого природного материала, являются негорючими, не содержат токсических веществ, не имеют запаха, обладают высокой звукоизолирующей способностью и высокой паро-, газопроницаемостью.
Идеальная поверхность и точность геометрических размеров пазогребневых плит позволяют не проводить штукатурных работ. Сам процесс сборки стены из такой плиты похож на принцип детского конструктора ЛЕГО, где изделия скрепляются между собой путем сцепления паза и гребня. Для фиксации плит ипользуется гипсовый клей «ВОЛМА-МОНТАЖ» или «ВОЛМА-МОРОЗ» при отрицательных температурах.
Использование пазогребней перегородочной плиты ВОЛМА в строительстве – это реальная возможность снижения себестоимости жилья за счет экономии на рабочей силе и строительных материалах, а также – сокращение сроков строительства.

Преимущества применения пазогребневых плит ВОЛМА при возведении межкомнатных перегородок:

1. легко монтируется высокая производительность устройства перегородок без специального оборудования: один человек выполняет от 20 до 30 кв.м в смену
2. экономия полезной площади за счет более тонкой, но прочной перегородки.
3. возможность возводить как одинарные, толщиной 80 мм, так и двойные межквартирные перегородки с воздушным зазором 40 мм.
4. у перегородок из пазогребневых плит отличная звукоизоляция – 42 дБ.
5. проемы до 900 мм иожно монтировать без усиления верха проема.
6. не требуется оштукатуривание (нет мокрых процессов) перегородка сразу после возведения готова к оклейке обоями, а для проведения малярных работ требуется только финишное шпаклевание.

Технические характеристики
вес 26-28
звукоизоляция 42
толщина 80
высота 667
ширина 500

границ | Засухоустойчивые ризобактерии, способствующие росту растений, связанные с просо лисохвостом в полузасушливой агроэкосистеме, и их потенциал в снижении стресса от засухи

Введение

Стресс из-за засухи – одна из основных сельскохозяйственных проблем, снижающих урожайность в засушливых и полузасушливых регионах мира. Изменения средней глобальной температуры воздуха и режима осадков приводят к увеличению продолжительности периодов засухи и увеличению числа чрезвычайно засушливых лет, а более суровые засушливые условия будут препятствовать производству продуктов питания в некоторых странах (Lau and Lennon, 2012).В настоящее время стратегии повышения способности растений противостоять стрессу засухи включают использование водосберегающего орошения, традиционную селекцию и генную инженерию устойчивых к засухе трансгенных растений. К сожалению, эти методы являются высокотехнологичными и трудоемкими, поэтому их сложно применять на практике.

Одной из альтернатив для выращивания растений в засушливых условиях является использование ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR). PGPR – это группа бактерий, которые могут быть обнаружены в ризосфере в ассоциации с корневыми системами растений, как на поверхности корня, так и в эндофитных ассоциациях, и которые могут прямо или косвенно способствовать росту растений в условиях оптимального, биотического или абиотического стресса ( Башан и Ольгин, 1998; Кассан и др., 2009). Известные механизмы, используемые PGPR, включают фиксацию азота для использования в растениях, производство фитогормонов (включая ауксины, цитокинины и гиббереллины), солюбилизацию минеральных фосфатов и секвестрацию железа бактериальными сидерофорами (Glick et al., 1999). Кроме того, PGPR связаны с катаболизмом молекул, связанных с передачей сигналов стресса, таких как бактериальная 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АСС) дезаминаза. Было показано, что многие PGPR смягчают эффекты стресса от засухи у растений за счет снижения уровней этилена в растениях, которые обычно повышаются из-за неблагоприятных условий (Mayak et al., 2004; Аршад и др., 2008). Однако способность инокулированных бактерий выживать, конкурировать с местной микрофлорой и колонизировать ризосферу остается критическим шагом для успешного применения (Bashan, 1998), особенно в почвах, подверженных засухе, поскольку микроорганизмы, не адаптированные к высокому напряжению воды, будут погибают в этих неблагоприятных условиях (Van Meeteren et al., 2008). Таким образом, засухоустойчивые ризобактерии могут иметь преимущество перед другими для процветания в новой засушливой среде в достаточном количестве, чтобы оказывать благоприятное воздействие на растения.

Были изучены сообщества ризобактерий многих сельскохозяйственных культур, и использование PGPR является многообещающим для стимулирования роста растений и снижения стресса от засухи (Mayak et al. , 2004; Zahir et al., 2008; Sandhya et al., 2009). ). Однако засухоустойчивые бактерии, связанные с видами сельскохозяйственных культур, которые естественным образом адаптированы к засухе, такие как просо лисохвоста, не исследовались.

Просо лисохвост ( Setaria italica L.) – особенно важная продовольственная и кормовая зерновая культура, выращиваемая на засушливых, невозделываемых и маргинальных землях (Lata et al., 2013). Он имеет высокое содержание углеводов, белков, крахмала, жиров и клетчатки, устойчив к засухе и солевому стрессу. Таким образом, это подходящая культура для районов, которые постоянно подвергаются засухе, таких как западный Ляонин в Китае, который имеет полузасушливый климат и годовое количество осадков от 424 до 613 мм (Liu et al., 2013). Адаптация проса к недостатку воды была приписана его относительно небольшой площади листа, расположению клеток в его эпидермисе, его толстым клеточным стенкам и его способности образовывать плотную корневую систему (Li, 1997). Эти характеристики эволюционировали в течение длительного периода времени в результате естественного отбора. Засухоустойчивые растения также выигрывают от связи с взаимодействующими видами, особенно с теми, которые входят в состав разнообразных почвенных микробных сообществ, которые быстро реагируют на изменения окружающей среды (Lau and Lennon, 2012). Ризобактерии, связанные с просо лисохвостом в этой области, постоянно сталкиваются с недостатком воды и, по-видимому, адаптировались к стрессовым условиям засухи и, вероятно, способствуют адаптации связанных с ними растений-хозяев к стрессу засухи.Недавние исследования с ампликонами 16S / 18S / ITS и метагеномное секвенирование показали, что просо лисохвоста обогащает определенные бактерии и функционирует в ризоплане (Jin et al., 2017). Просо лисохвост может быть полезным источником эффективного засухоустойчивого бактериального инокулянта с потенциалом стимулирования роста растений в засушливых почвах.

Здесь мы сообщаем о выделении засухоустойчивых растений, способствующих росту ризобактерий, связанных с просо лисохвостом, на полузасушливых землях в западной провинции Ляонин, Северо-Восточный Китай, и оценке их активности PGP в условиях засухи. Результаты показывают, что PGPR имеют большой потенциал для биотехнологического применения в сельскохозяйственных системах, подверженных засухе.

Материалы и методы

Отбор проб и выделение корневых бактерий

Образцы здоровых растений проса лисохвоста ( Setaria italica L.), собранные в июле в полузасушливом районе местности Цзяньпин (41 ° 40’28 ”с.ш., 119 ° 63’34” в.д.) на западе провинции Ляонин (северо-восток Китая. ). Район характеризуется полузасушливым средиземноморским климатом со среднегодовым количеством осадков от 424 до 613 мм (Liu et al., 2013). Почва была классифицирована как типичная почва цвета корицы. Основные характеристики почвы были следующие: pH = 8,8, общий органический углерод = 12,15 г кг ^-1 , доступный азот = 40,11 мг кг ^-1 , доступный фосфор = 356,07 мг кг ^-1 и доступный калий = 221,40 мг кг ^-1 . Влажность (H%) почвы на момент отбора проб составляла 6,2%. Каждый образец растения немедленно помещали в стерильный пластиковый пакет, транспортировали в лабораторию в холодильнике со льдом и хранили при 4 ° C.

Для выделения бактерий, ассоциированных с корнями, большую часть почвы удаляли путем осторожного встряхивания растений, а образцы корней в асептических условиях измельчали ​​на более мелкие фрагменты и мацерировали с использованием стерильной ступки и пестика в стерильной дистиллированной воде. Экстракты тканей были серийно разбавлены, и соответствующие разведения были распределены по различным средам для выделения следующим образом: питательный агар, среда King’s B (King et al., 1954), среда R ₂ A (агар Reasoner’s 2A) (van der Linde et al. др., 1999).Планшеты инкубировали при 28 ± 2 ° C, репрезентативную колонию отбирали и переносили в свежую питательную агаровую среду для дальнейших исследований.

Скрининг активности АЦК дезаминазы

Активность бактериальных изолятов 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдезаминазы проверяли на основании способности использовать АСС в качестве единственного источника азота. Изоляты инокулировали точечно на минимальную агаровую среду с солями DF (Dworkin and Foster, 1958) с добавлением 3 мМ ACC вместо (NH ₄ ) ₂ SO ₄ в качестве источника азота. Дезаминазную активность ACC бесклеточных экстрактов в условиях отсутствия стресса или засухи (-0,30 МПа) определяли путем измерения продукции α-кетобутирата (α-KB), который образуется при расщеплении ACC дезаминазой ACC (Penrose and Глик, 2003). После определения количества белка и α-KB активность фермента выражали в микромолях α-KB на мг белка в час.

Проверка на устойчивость к засухе

Триптиказо-соевый бульон с разным водным потенциалом (0, -0.05, -0,30 и -0,73 МПа) получали добавлением соответствующих концентраций ПЭГ 6000 (Michel and Kaufmann, 1973), инокулировали 1% экспоненциально выращиваемых бактериальных культур и затем инкубировали на шейкере (120 об / мин) при 28 ° C. Рост клеток оценивали каждые 3 часа путем измерения оптической плотности при 600 нм с помощью спектрофотометра (SP-721; Shanghai Spectrum Instruments Co., Ltd., Китай).

Амплификация 16S рРНК и

acdS Гена

Ген 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров 27F 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ‘и 1492R 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ в стандартных условиях. Ген acdS амплифицировали с помощью ПЦР с использованием вырожденных праймеров ACCf2 (5′-GCA ACA AGA CGC GCA AGY TNG ART AYN T-3 ‘) и ACCr (5′-GTG CAT CGA CTT GCC CTC RWA NAC NGG RT-3’ ) (Ли, 2011). Праймеры, отожженные в положениях 146 и 900 эталонной нуклеотидной последовательности acdS Pseudomonas putida WU4, что соответствует ожидаемому продукту амплификации размером приблизительно 754 п.н. Реакции ПЦР проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл, содержащей 1 × реакционный буфер, 2.Смесь 5 мМ dNTP, 10 пМ каждого праймера, ДНК-полимераза Taq (1 ед.) (Tiangen Biotechnology Ltd., Пекин, Китай) и 25 нг матричной ДНК. Последовательности гена 16S рРНК и acdS определяли прямым секвенированием ПЦР (Sangon Biotechnology Ltd., Шанхай, Китай). Полученные последовательности 16S рРНК и acdS сравнили с опубликованными последовательностями и отправили в GenBank. Филогенетический анализ последовательностей гена acdS был выполнен с помощью MEGA версии 4. 0 (Tamura et al., 2007). Филогенетическое дерево было построено с использованием метода объединения соседей, и были выполнены бутстрап-анализы ( n = 1000).

Определение других PGP-признаков изолятов

Четыре засухоустойчивых изолята, продуцирующих дезаминазу АСС, были протестированы in vitro на другие свойства PGP. Способность к N-фиксации определяли, наблюдая за ростом на полутвердой среде JNFb, не содержащей N (Baldani et al., 1992; Döbereiner et al., 1995), и ген nif H был также амплифицирован с использованием праймеров PolF (5 ′ -TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC-3 ′) и PolR (5′-ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA-3 ′) (Qin et al., 2014). Для определения солюбилизации фосфата 5 мкл ночной бактериальной культуры наносили на чашки с агаром Пиковской (Пиковская, 1948), содержащими 2% трикальцийфосфат, и инкубировали при 28 ° C в течение 24–72 ч и появления зоны солюбилизации вокруг бактериальных колоний не наблюдалось. Продукция ИУК была исследована с использованием колориметрического метода, описанного Sheng et al. (2008). Выработку полисахаридов наблюдали с использованием метода точечных пластинок на среде RCV-сахароза (дрожжевой экстракт, 0,1 г литр ^-1 ; раствор суперсолей, 50 мл литр ^-1 ; фосфатный буфер, 15 мл литр ^-1 ) ( Amellal et al., 1998), содержащий 40 г L ^-1 сахарозы. Для подробного количественного определения производства EPS протокол, описанный Ali et al. (2014). Продукция EPS выражалась в мг общих углеводов на мг белка, и эксперимент проводился пять раз. Для производства сидерофоров 1 мкл бактериальной культуры, выращенной в течение ночи в бульоне Лурия, наносили на чашки с агаром Chrome Azurol S (Ames-Gottfred et al., 1989). Появление оранжевого ореола вокруг бактериальных колоний наблюдали после инкубации в течение 48 ч при 28 ° C (Ali et al., 2014).

Влияние выбранных сортов на прорастание семян при стрессе засухи

Семена

проса лисохвоста ( Setaria italica L. cv. Liaogu 2) промывали в водопроводной воде, затем стерилизовали поверхность 1% гипохлоритом натрия в течение 20 мин. Для посева бактерий ночные культуры центрифугировали при 11000 × g в течение 20 минут, осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и оптическую плотность доводили до 0,6 (~ 10 ⁸ колониеобразующих единиц, КОЕ) .Стерилизованные на поверхности семена замачивали при комнатной температуре в течение 10 ч в бактериальных суспензиях (1 мл) и высаживали в 0,8% (вес / объем) водный агар с различным потенциалом воды (0, -0,30, -0,49, -1,03 МПа), приготовленный добавление ПЭГ 6000 в соответствующих концентрациях. Контрольные семена обрабатывали только стерильной дистиллированной водой. Высаживали в пяти повторностях по 50 семян. Семена инкубировали при 27 ± 1 ° C и измеряли всхожесть через 3 дня.

Влияние бактериальной инокуляции на рост растений в условиях стресса, вызванного засухой

Семена проса лисохвоста ( Setaria italica L.резюме. Liaogu 2) стерилизовали поверхность и предварительно проращивали на стерильной фильтровальной бумаге в чашках Петри. Через 3 дня были отобраны проростки одинакового размера и высажены в автоклавированные культуральные ящики (7 см × 8 см), содержащие 200 г высушенной воздухом просеянной почвы, как описано выше. Через 1 неделю сеянцы однократно удобряли средой 1/5 Murashige and Skoog (MS) (Murashige and Skoog, 1962). Через три дня после оплодотворения часть проростков обрабатывали 40 мл бактериальной суспензии (OD ₆₀₀ = 0.6), другие обрабатывались дистиллированной водой. Как инокулированные, так и неинокулированные обработки повторяли 20 раз, и каждая обработка содержала по три растения на горшок. Проростки поддерживали в камере для выращивания при цикле свет: темнота 16 ч: 8 ч при соответствующих температурах 25 и 18 ° C. Через три недели после инокулирования проростков водный стресс вызывали в пяти повторностях путем прекращения полива. После того как неинокулированные растения начали проявлять симптомы (увядание), саженцы собирали (после 9 дней водного стресса).

Сбор, подсчет инокулированных бактерий и определение отношения RAS / RT

Пятнадцать проростков на обработку удаляли из ящика для выращивания, колонизацию ризосферной почвы инокулированными штаммами определяли через 10 дней, 21 день или 30 дней после инокуляции с использованием методики посева с последовательными разведениями. Всю почву-корневую систему извлекали из горшка и осторожно встряхивали для удаления основной массы почвы. Корни промывали, погружая в стерильную воду, чтобы отделить приставшую к корню почву (RAS) от ткани корня (RT).Аликвоту надосадочной жидкости объемом 1 мл последовательно разбавляли дистиллированной водой и высевали на минимальную среду DF, содержащую АСС в качестве единственного источника азота. Планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 4–5 дней и подсчитывали колонии. Для проверки того, что подсчитанные колонии представляют инокулированный штамм, случайным образом были отобраны 12 колоний и проверены на предмет их генетического отпечатка пальца с помощью энтеробактериального повторяющегося межгенного консенсуса (ERIC) -PCR. Численность культивируемых бактерий, продуцирующих дезаминазу АЦК, выражали в виде логарифма колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм ризосферной почвы.Сухую массу почвы корня, побега и ризосферы регистрировали после сушки оставшихся образцов при 105 ° C, влажность почвы (SM) рассчитывалась как SM = (W1 – W2) / W1 × 100%, где W1 и W2 – влажность почвы. свежий вес и сухой вес почвы, а также соотношение RAS / RT были рассчитаны в соответствии с Sandhya et al. (2009).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием пакета статистического анализа дисперсии для программного обеспечения социальных наук 19.0, а средние значения сравнивались с использованием теста множественных диапазонов Дункана; P ≤ 0.05 считалось значительным. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение.

Результаты

Выделение и скрининг ACC дезаминазы

Всего из корней и ризосферной почвы проса лисохвоста было выделено 110 штаммов бактерий, из которых 14 штаммов росли на среде с минимальными солями DF, где АСС служил единственным источником азота, что указывает на активность дезаминазы АЦЦ. Ферментативную активность ACC дезаминазы этих изолятов анализировали путем количественного определения количества α-KB, продуцируемого во время дезаминирования ACC.Эти изоляты показали разные уровни активности дезаминазы АСС на основании результатов количественных анализов (таблица 1). Наибольшую активность АЦК дезаминазы продемонстрировал изолят DR11 (39,40 ± 0,68 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h), за ним следуют DR7 (24,56 ± 2,24 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h), DR30 (9,66 ± 1,57 мкмоль α -KB / мг Pr⋅h) и DR16 (9,19 ± 0,81 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h).

ТАБЛИЦА 1. АСС дезаминазная активность изолированных бактерий, ассоциированных с просо.

После выделения ДНК и ПЦР-амплификации 14 штаммов, продуцирующих дезаминазу АСС, были идентифицированы путем секвенирования гена 16S рДНК.Сходство последовательности гена 16S рДНК (99–100%), разделяемое штаммами ближайшего типа, представлено в таблице 1. На основе последовательности гена 16S рРНК эти штаммы представляют шесть разных родов: Pseudomonas (шесть изолятов), Enterobacter (два изолята), Pantoea (два изолята), Arthrobacter (два изолята), Klebsiella (один изолят) и Ochrobactrum (один изолят).

Рост изолированных штаммов в условиях стресса, вызванного засухой

14 бактерий, продуцирующих дезаминазу АСС, были проверены на устойчивость к засухе с использованием полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ 6000). Рост всех 14 изолятов был затронут из-за матричного стресса, вызванного ПЭГ 6000, из которых четыре изолята ( Pseudomonas fluorescens DR7, Pseudomonas fluorescens DR11, Enterobacter гормухи DR16 и Pseudomonas migulae DR35) были способны к растут при минимальном водном потенциале (-0,30 МПа) (Рисунок 1). Оптическая плотность снижалась по мере увеличения матричного стресса, но все штаммы, кроме DR11, сохраняли плотность клеток, аналогичную плотности клеток, равной -0,05 МПа, которая наблюдалась в условиях отсутствия стресса.Было удивительно, что Pseudomonas fluorescens DR7 достиг более высокой плотности клеток при -0,05 МПа, чем в условиях отсутствия стресса, и поддерживал эту максимальную плотность клеток на уровне -0,3 МПа (рис. 1).

РИСУНОК 1. Образцы роста четырех ризобактерий в нестрессированных (NS) и засуху стрессовых условиях с различным матричным потенциалом. (A) DR7, (B) DR11, (C) DR16, (D) DR35. Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Все четыре изолята дополнительно оценивали на активность дезаминазы АСС как в условиях отсутствия стресса, так и в условиях стресса засухой (-0,3 МПа). Активность АЦК дезаминазы всех штаммов была ниже в условиях стресса засухи и снизилась на 30,42–55,38% (рис. 2).

РИСУНОК 2. Активность АСС дезаминазы в изолированных бактериях в условиях отсутствия стресса (NS) и стресса засухой (–0,30 МПа). Значения с разными буквами значительно различаются в соответствии с тестом Дункана с множеством диапазонов ( P = 0.05). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Амплификация гена АСС дезаминазы

Ген АСС дезаминазы ( acdS ) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием вырожденных праймеров. Ожидаемый продукт размером примерно 755 п.н. наблюдали со всеми четырьмя засухоустойчивыми изолятами, подтверждая результаты анализов АСС дезаминазы. Поиск BLAST был выполнен с использованием амплифицированной последовательности, и заметное сходство последовательностей наблюдалось с генами acdS в GenBank (дополнительный рисунок 1).Некоторые консервативные домены АСС дезаминазы также были обнаружены в транслированных амплифицированных частичных последовательностях acdS . Частичные последовательности acdS Pseudomonas fluorescens DR7, Pseudomonas fluorescens DR11, Enterobacter гормоны DR16 и Pseudomonas migulae DR35 были представлены в GenBank под номером доступа. KY352308, KY451713, KY352309 и KY451712 соответственно.

Филогенетический анализ частичных последовательностей четырех изолятов с существующими последовательностями в базе данных выявил значительный полиморфизм между этими последовательностями.Созданное филогенетическое дерево показало, что последовательности АСС дезаминаз изолятов Pseudomonas DR7 и Enterobacter изолятов DR16 попали в ту же кладу, что и штамм Pseudomonas putida Bm3 (AY604533. 1), в то время как DR11 и DR35 более тесно связаны с дезаминазой АСС. последовательности других видов Pseudomonas (рис. 3).

РИСУНОК 3. Филогенетический анализ четырех бактерий, продуцирующих АСС дезаминазу, на основе последовательностей гена acdS , доступных из базы данных NCBI GenBank.Анализ расстояния и кластеризации был выполнен с использованием метода объединения соседей с использованием MEGA ver. 4.0. Значения начальной загрузки ( n = 1000) указаны в процентах в точках ветвления.

Характеристика других PGP свойств изолятов

Четыре засухоустойчивых штамма бактерий, продуцирующих дезаминазу АСС, были протестированы на другие свойства PGP (таблица 2). Pseudomonas migulae DR35 вырабатывает значительное количество ИУК (4,66 ± 0,05 мг / л).Этот изолят также был положительным по амплификации гена nif H и рос на полутвердой среде JNFb, не содержащей азота, что позволяет предположить, что он обладает азотфиксационной активностью. Pseudomonas fluorescens DR7 и DR11 были положительными по солюбилизации фосфата, на что указывало появление хорошо развитых прозрачных зон на агаризованной среде Пиковской с 2% трикальцийфосфата. Все четыре штамма были отрицательными по продукции сидерофоров.

ТАБЛИЦА 2. Признаки выделенных бактерий, способствующие росту растений.

Все четыре штамма показали рост слизи на среде RCV-сахароза, содержащей 40 г сахарозы L ^-1 , и присутствие капсульного материала под микроскопом. Эти изоляты дополнительно оценивали на продукцию EPS. Pseudomonas fluorescens DR7 продуцировал наибольшее количество EPS (11,63 ± 0,51 мг / мг белка), за ним следует изолят DR16 (5,44 ± 0,24 мг / мг белка), DR35 (3,33 ± 0,29 мг / мг белка) и DR11 (2,91 мг / мг белка). ± 0,19 мг / мг белка) (таблица 2).

Влияние штаммов PGP на прорастание семян при стрессе засухи

Инокуляция Pseudomonas fluorescens DR7, Pseudomonas fluorescens DR11, Enterobacterormaechei DR16 и Pseudomonas migulae DR35 увеличивала процент семян проса, прорастающих в условиях стресса засухи, между -0. 30 МПа и -1,03 МПа (таблица 3). Процент прорастания семян (как в зараженной, так и в контрольной группах) постепенно снижался с увеличением концентрации ПЭГ 6000. При водном потенциале -0,49 МПа и -1,03 МПа, Pseudomonas fluorescens DR7 и Pseudomonas fluorescens DR11 показали значительную активность, способствующую прорастанию семян (повышение на 13,68–141,82%). Между тем, Enterobacter гормэчей DR16 продемонстрировал значительный эффект стимуляции прорастания семян только при сильном стрессе засухи (-0.49 МПа и -1,03 МПа), и Pseudomonas migulae DR35 не оказали значительного влияния на процент прорастания семян в испытанных условиях. Роль бактерий в устойчивости растений к стрессу, вызванному засухой, была дополнительно оценена с использованием проростков проса лисохвоста (обсуждается ниже).

ТАБЛИЦА 3. Влияние инокуляции четырьмя бактериями, продуцирующими АСС дезаминазу и ЭПС, на прорастание семян проса песочного.

Рост проростков проса, инокулированных штаммами PGP

Четыре бактерии использовали для инокуляции 13-дневных проростков проса, и сухой вес проростков, обработанных бактериями, сравнивали с необработанными контрольными растениями (таблица 4). В условиях отсутствия стресса не было обнаружено значительной разницы в росте между инокулированными бактериями и необработанными проростками, кроме DR35. Стресс засухи серьезно повлиял на рост проростков проса лисохвоста, о чем свидетельствует снижение сухой массы как инокулированных, так и контрольных сеянцев в условиях водного стресса. Однако инокуляция всех штаммов значительно ( P ≤ 0,05) увеличивала сухой вес подвергнутых стрессу проростков на 70,4–122,2% по сравнению с неинокулированными растениями, что указывает на способность инокулированных бактерий ослаблять стресс от засухи.Среди четырех штаммов наибольшее влияние оказал Pseudomonas fluorescens DR7, увеличив сухой вес на 122,2%, что соответствует его высокой активности дезаминазы АСС.

ТАБЛИЦА 4. Влияние инокуляции четырьмя бактериями, продуцирующими АСС дезаминазу и EPS, на параметры роста проростков проса лисохвоста.

Инокуляция Pseudomonas fluorescens DR7 и Pseudomonas migulae DR35 оказала положительное влияние на СМ, ​​которое было увеличено на 95. 27 и 45,76% соответственно в ненагруженных условиях. Однако только инокуляция Pseudomonas fluorescens DR7 значительно увеличила SM (на 42,57%) в условиях засухи.

Отмечено положительное влияние инокуляции Pseudomonas fluorescens DR7, Enterobacterormaechei DR16 и Pseudomonas migulae DR 35 на соотношение RAS / RT, которое увеличилось на 42,49 – 75,58% и 44,54 – 67,47% соответственно. , в условиях отсутствия стресса и засухи, и эффект положительно коррелировал с производством пенополистирола (Таблица 2).

Популяцию инокулированных бактерий в почве, связанной с корнями, оценивали путем подсчета колоний на минимальной агаризованной среде с солями DF с добавлением АСС в качестве единственного источника азота. После 21 дня инокуляции все бактериальные инокуляты могли успешно колонизировать ризосферу, о чем свидетельствует значительно увеличенная плотность клеток (рис. 4). Популяция Pseudomonas fluorescens DR7 и Pseudomonas migulae DR35 в УЗВ составляла до 6,36 ± 0,06 и 6,18 ± 0. 24 lg КОЕ г ^-1 почвы. Однако стресс засухи повлиял на колонизацию инокулированных бактерий в почве, связанной с корнями. В целом, стресс от засухи привел к значительному сокращению популяции ризосферных бактерий (Рисунок 4). После 30 дней инокуляции (после 9 дней водного стресса) популяция Pseudomonas fluorescens DR7 и Enterobacter гормухи DR16 в RAS уменьшилась на 8,49 и 8,71% соответственно. Однако численность популяций Pseudomonas fluorescens DR11 и Pseudomonas migulae DR35 в ризосфере уменьшилась на 34.54 и 18,93%. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что Pseudomonas fluorescens DR7 и Enterobacter гормэчей DR16 были более устойчивы к стрессу засухи, чем Pseudomonas fluorescens DR11 и Pseudomonas migulae DR35.

РИСУНОК 4. Плотность популяций различных бактерий, инокулированных в просо лисохвоста в разные промежутки времени в аксенических условиях. 10 DI, 10 дней после инокуляции; 21 DI, 21 день после инокуляции; 30 дней после инокуляции (9 дней после водного стресса). Значения с разными буквами значительно различаются в соответствии с тестом Дункана с множеством диапазонов ( P = 0,05). Планки погрешностей показывают стандартные отклонения средних значений.

Обсуждение

В данном исследовании мы выделили и охарактеризовали ризосферные бактерии, продуцирующие АЦК дезаминазу, связанные с просо лисохвостом. В общей сложности 14 штаммов, содержащих АЦЦ-дезаминазу, продуцирующих 1,89–39,40 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h, были выделены из проса лисохвоста, выращенного в полузасушливых условиях. Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что они принадлежали к шести родам: Pseudomonas, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Arthrobacter и Ochrobactrum . Pseudomonas был наиболее широко представлен (шесть изолятов). Хотя Pseudomonas sp. широко распространены в сельскохозяйственных почвах, и многие из них были широко изучены на предмет улучшения роста растений (Hol et al., 2013; Tiwari et al. , 2016), изоляты Pseudomonas в нашем исследовании продемонстрировали более высокую активность дезаминазы ACC (3,24–39,4 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h) по сравнению с ранее сообщенным Pseudomonas из других культур (157–972 нмоль α-KB / мг Pr⋅h) (Singh et al., 2015). Предыдущие исследования также обнаружили два штамма P. brassicacearum с высоким уровнем активности АЦК-дезаминазы (8,65 и 9,39 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h), которые были связаны с галофитами, адаптированными к среде с высоким уровнем стресса (Qin et al., 2014). Высокая активность АСС дезаминазы этих штаммов Pseudomonas может быть связана с высокострессовой средой обитания их растений-хозяев. Бактерии, обладающие активностью дезаминазы АСС, помогают растениям противостоять стрессу (биотическому и абиотическому) за счет снижения уровня стресса этилена.

Интересно, что изоляты DR59 и DR 95 принадлежат к роду Arthrobacter из Actinobacteria . Последовательность гена 16S рРНК изолята DR59 показала 100% сходство с последовательностью Arthrobacter siccitolerans 4J27, высокотолерантного к высыханию штамма, продуцирующего ксеропротекторы, который ранее был выделен из сухой почвы (Santacruzcalvo et al. , 2013). Представители Actinobacteria существуют в полном спектре экстремальных экосистем. Сообщалось о существовании кислотоустойчивых, алкалифильных, психротолерантных, термотолерантных, галотолерантных, алкалитолерантных, галогеналкалитолерантных и ксерофильных актинобактерий (Lubsanova et al., 2014). Acidobacteria было продемонстрировано как основной компонент микробиоты корней проса лисохвоста с помощью секвенирования ампликона гена 16S рРНК (Jin et al., 2017). Хотя известно, что активность дезаминазы АСС присутствует у различных бактерий и некоторых грибов, а также у Actinobacteria , включая Streptomyces, Amycolatopsis, Mycobacterium и , недавно сообщалось, что Arthrobacter обладают активностью дезаминазы АСС и / или геном acdS . и для увеличения роста растений (Barnawal et al., 2014; Массимилиано и др., 2015; Singh et al., 2015), было проведено немногочисленное исследование по скринингу Actinobacteria из стрессовой среды на предмет их способности продуцировать АЦК дезаминазу и усиливать рост растений. Насколько нам известно, настоящая работа является первым отчетом об активности дезаминазы у видов Arthrobacter , выделенных из засухоустойчивой культуры.

Четыре из 14 изолятов были способны расти при минимальном водном потенциале (-0,30 МПа). Примечательно, что все эти засухоустойчивые штаммы были способны продуцировать EPS.Толерантность этих бактериальных штаммов к низким осмотическим уровням (-0,30 МПа) и выработка ЭПС в настоящем исследовании, вероятно, были вызваны натурализацией в полузасушливых средах обитания. Производство пенополистирола было предложено как ответ на матричный стресс (Роберсон и Файерстоун, 1992). Микробный EPS обладает уникальными водоудерживающими и цементирующими свойствами, которые не только защищают бактерии от высыхания, но и защищают растения-хозяева от стресса засухи за счет улучшения структуры почвы (Sandhya et al., 2009). Действительно, увеличение производства EPS в A. brasilense Sp245 было признано ответственным за защиту в условиях экстремального высыхания (Konnova et al. , 2001). Высокая устойчивость четырех ризобактерий к стрессу засухи может быть объяснена производством EPS. EPS также помогает бактериям прикрепляться к корням растений и колонизировать их через сеть фибриллярного материала, который надолго связывает бактерии с поверхностью и предотвращает удаление с места (Bashan et al., 2004). Таким образом, инокуляция растений ризобактериями, продуцирующими ЭПС, обладающими множественной активностью, способствующей росту, может повысить эффективность бактериальных инокулянтов в засушливых или полузасушливых районах.

Активность АЦЦ Pseudomonas fluorescens DR11, Enterobacter гормухи DR16 и Pseudomonas migulae DR35 в условиях стресса засухи была снижена на 55,38, 49,12 и 48,69% по сравнению с условиями без стресса, соответственно. Особым случаем был Pseudomonas fluorescens DR7, который показал наименьшее снижение активности АЦК дезаминазы (30,42%). Этот результат соответствовал высокой засухоустойчивости и продукции EPS Pseudomonas fluorescens DR7. Тем не менее, все четыре штамма поддерживали активность АЦК дезаминазы от 2,75 до 17,86 мкмоль α-KB / мг Pr⋅h в условиях стресса засухи, сообщалось, что организмы с уровнем активности дезаминазы АЦК 20 нмоль α-KB / мг Pr⋅h или выше может способствовать росту растения-хозяина (Ali et al., 2014). Четыре засухоустойчивые бактерии, продуцирующие дезаминазу АСС, были дополнительно протестированы на их стимулирующую рост активность в условиях засухи. Обработка этими штаммами улучшала прорастание семян по сравнению с неинокулированными семенами проса лисохвоста при различных уровнях стресса засухи, причем DR7 и DR11 оказывали наиболее выраженное стимулирующее влияние на рост при высоких уровнях стресса засухи (-0.49 МПа и -1,03 МПа), что соответствовало их уровню активности дезаминазы АСС. Подобное улучшение прорастания семян при абиотическом стрессе было зарегистрировано у других растений, обработанных PGPR, продуцирующим АЦК-дезаминазу (Bal et al., 2013; Qin et al., 2014). Инокуляция проса лисохвоста любой из четырех засухоустойчивых бактерий, продуцирующих АЦК-дезаминазу, значительно увеличила сухую биомассу проростков в условиях стресса засухи. Наши результаты подтвердили выводы более ранней работы других исследователей, которые аналогичным образом продемонстрировали повышенную устойчивость к стрессу засухи (Mayak et al., 2004; Захир и др., 2008). Поскольку в наших экспериментах мы не измеряли напрямую уровни этилена, мы не знаем, являются ли уровни АЦК-дезаминазы достаточными, особенно по сравнению с уровнем растительного фермента АСО. Однако сообщалось, что бактериальная дезаминаза АСС действительно может смягчать неблагоприятные эффекты этилена, расщепляя предшественник синтеза этилена (Mayak et al., 2004). Стимулирующая рост активность этих штаммов может быть связана не только с АЦК-дезаминазой, и необходимы дальнейшие исследования для выяснения вовлеченных механизмов.Однако наши результаты подтвердили, что бактериальные штаммы, связанные с ризосферой проса лисохвоста, способствуют адаптации растений-хозяев к засухе. Сообщалось, что многие растения, растущие в естественных условиях в условиях хронического стресса, содержат полезные микробные сообщества, которые защищают от абиотического стресса (Rodriguez et al. , 2008; Jha et al., 2012; Qin et al., 2014). Ризобактерии, обитающие в местах, где вода регулярно ограничивается повторяющимися засушливыми периодами, вероятно, будут более адаптированы к матричному стрессу и более способны способствовать росту растений, чем бактерии, изолированные из мест, где источники воды более многочисленны (Mayak et al., 2004). Наше настоящее исследование согласуется с предыдущими выводами о том, что растения в условиях высокого стресса являются полезными источниками устойчивых к стрессу бактерий с потенциалом стимулирования роста растений.

Все штаммы, кроме DR11, увеличивали соотношение RAS / RT в стрессовых условиях засухи (Таблица 4). Вероятно, это связано с агрегационным эффектом EPS, продуцируемого инокулированными бактериями. Кроме того, размер популяции инокулированного штамма в ризосфере проса лисохвоста положительно коррелировал с продукцией EPS в инокулированных бактериях.Было высказано предположение, что бактериальный EPS может обеспечить микросреду, которая удерживает воду и сохнет медленнее, тем самым защищая бактерии от высыхания (Sandhya et al. , 2009). В настоящем исследовании изолят DR7 имел самую высокую продукцию EPS, показал лучшую выживаемость и устойчивость в ризосфере в стрессовых условиях засухи, что согласуется с его характеристиками в жидкой культуре. Примечательно, что инокуляция DR7 значительно увеличивала SM в условиях отсутствия стресса и стресса засухой, указывая на то, что этот штамм оказывает положительное влияние на удержание воды в почве ризосферы.Между тем, хотя изолят DR11 показал самую высокую активность дезаминазы ACC, он не оказал заметного влияния на соотношение RAS / RT или SM, а размер популяции ризобактерий инокулированного DR11 резко снизился в условиях стресса засухи (рис. 4). Стимулирующая рост растений эффективность PGPR в значительной степени зависит от их способности выживать и устанавливать эффективную корневую колонизацию (Lugtenberg, Kamilova, 2009; Bulgarelli et al., 2013). Более того, эффективная колонизация корней растений PGPR играет важную роль в стимулировании роста независимо от механизма действия (Davey and O’loole, 2000). Поэтому при скрининге PGPR следует учитывать их способность выживать и колонизировать ризосферу растений в неблагоприятных условиях, таких как обезвоживание.

Таким образом, наше настоящее исследование согласуется с предыдущими выводами о том, что растения в условиях естественной засухи являются полезными источниками засухоустойчивых бактерий с потенциалом стимулирования роста растений. Представленные здесь результаты также подтверждают гипотезу о том, что PGPR может способствовать адаптации таких растений, как просо, к засушливой среде обитания.Мы предполагаем, что бактерии, продуцирующие АЦК дезаминазу и ЭПС, в нашем исследовании могут быть полезны для разработки биоинокулянтов для управления абиотическим стрессом у растений.

Заключение

Настоящее исследование предполагает, что растения проса лисихвостого, культивируемые в засушливых районах, естественным образом связаны с различными ризобактериями, которые проявляют высокую устойчивость к стрессу засухи и обладают свойствами, способствующими росту растений. Таким образом, корни проса могут служить источником ризобактерий, которые способны напрямую защищать растения от стресса, вызванного засухой.Наши результаты показывают, что бактерии, продуцирующие АЦК дезаминазу и ЭПС, связанные с просо лисохвостом, могут облегчить стресс от засухи у растений, на что указывает улучшенное прорастание семян и рост проростков. Производство EPS бактериями, продуцирующими ACC-дезаминазу, по-видимому, повышает их эффективность в качестве PGP-бактерий в условиях засухи, возможно, за счет улучшения структуры почвы и колонизации. Эти результаты также предполагают, что следует учитывать несколько признаков PGP для определения более эффективных прививок PGPR для будущего использования в сельском хозяйстве.

Авторские взносы

XN задумал и разработал эксперименты. XN, WG и LS проводили эксперименты. LS проанализировал данные и стал соавтором статьи. WG, YX и XN предоставили реагенты / материалы / инструменты анализа.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Китайского национального фонда естественных наук [грант № 31401322] и Молодежного фонда естественных наук Шэньянского сельскохозяйственного университета.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.02580/full#supplementary-material

Список литературы

Али, С.З., Сандхья, В., и Рао, Л.В. (2014). Выделение и характеристика засухоустойчивой АСС дезаминазы и продуцирующей экзополисахариды флуоресцентной лампы Pseudomonas sp. Ann. Microbiol. 64, 493–502. DOI: 10.1007 / s13213-013-0680-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амеллал, Н., Буртин, Г., Бартоли, Ф., Хеулин, Т. (1998). Колонизация корней пшеницы EPS-продуцентом Pantoea agglomerans и ее влияние на агрегацию ризосферы почвы. Заявл. Environ. Microbiol. 64, 3740–3747.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Эймс-Готтфред, Н. П., Кристи, Б. Р., и Джордан, Д. К. (1989). Использование агаровой чашки Chrome Azurol S для дифференциации штаммов и полевых изолятов Rhizobium leguminosarum biovar trifolii . Заявл. Environ. Microbiol. 55, 707–710.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Аршад М., Шахаруна Б. и Махмуд Т. (2008). Инокуляция Pseudomonas spp. содержащий АСС-дезаминазу частично устраняет влияние стресса засухи на рост, урожай и созревание гороха ( Pisum sativum L.). Педосфера 18, 611–620. DOI: 10.1016 / S1002-0160 (08) 60055-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бал, Х.Б., Наяк, Л., Дас, С., и Адхья, Т. К. (2013). Выделение АСС-дезаминазы, продуцирующей PGPR, из ризосферы риса и оценка их активности, способствующей росту растений при солевом стрессе. Почва растений 366, 93–105. DOI: 10.1007 / s11104-012-1402-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Балдани В. Л., Балдани Дж. И., Оливарес Ф. и Доберейнер Дж. (1992). Идентификация и экология Herbaspirillum seropedicae и близкородственного ему Pseudomonas rubrisubalbicans . Симбиоз 13, 65–73.

Google Scholar

Барнавал Д., Бхарти Н., Маджи Д., Чанотия К. С. и Калра А. (2014). Содержащий АСС дезаминазу Arthrobacter protophormiae индуцирует толерантность к NaCl за счет снижения активности АСС-оксидазы и выработки этилена, что приводит к улучшению клубеньков и микоризации у Pisum sativum . J. Plant Physiol. 171, 884–894. DOI: 10.1016 / j.jplph.2014.03.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Башан, Ю.(1998). Инокулянт бактерий, способствующих росту растений. Biotechnol. Adv. 16, 729–770. DOI: 10.1016 / S0734-9750 (98) 00003-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Башан Ю., Ольгин Г. (1998). Предложение о разделении ризобактерий, способствующих росту растений, на две классификации: биоконтроль PGPB (бактерии, способствующие росту растений) и PGPB. Soil Biol. Biochem. 30, 1225–1228. DOI: 10.1016 / S0038-0717 (97) 00187-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Башан, Ю., Ольгин, Г., и де-Башан, Л. Э. (2004). Azospirillum – Взаимоотношения растений: физиологические, молекулярные, сельскохозяйственные и экологические достижения. Кан. J. Microbiol. 50, 521–577. DOI: 10.1139 / w04-035

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., and Schulze-Lefert, P. (2013). Структура и функции бактериальной микробиоты растений. Annu. Rev. Plant Biol. 64, 807–838. DOI: 10.1146 / annurev-arplant-050312-120106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кассан, Ф., Майале, С., Мациарелли, О., Видаль, А., Луна, В., и Руис, О. (2009). Производство кадаверина с помощью Azospirillum brasilense и его возможная роль в стимулировании роста растений и смягчении осмотического стресса. Eur. J. Soil Biol. 45, 12–19. DOI: 10.1016 / j.ejsobi.2008.08.003

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэйви, М.Э. и О’лоул Г. А. (2000). Микробные биопленки: от экологии до молекулярной генетики. Microbiol. Мол. Биол. Ред. 64, 847–867. DOI: 10.1128 / MMBR.64.4.847-867.2000

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дворкин М. и Фостер Дж. (1958). Эксперименты с некоторыми микроорганизмами, утилизирующими этан и водород. J. Bacteriol. 75, 592–601.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Глик, Б. Р., Паттен, К. Л., Ольгин, Г., и Пенроуз, Д.М. (1999). Биохимические и генетические механизмы, используемые бактериями, способствующими росту растений. Лондон: Imperial College Press, 267.

Google Scholar

Хол, В. Х., Беземер, Т. М., и Биэр, А. (2013). Экологические аспекты взаимодействия между растениями и бактериями, способствующими росту растений Pseudomonas fluorescens . Фронт. Plant Sci. 4:81. DOI: 10.3389 / fpls.2013.00081

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джа, Б., Гонция, И., и Хартманн, А. (2012). Корни галофита Salicornia brachiata являются источником новых галотолерантных диазотрофных бактерий, способствующих росту растений. Почва растений 356, 265–277. DOI: 10.1007 / s11104-011-0877-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jin, T., Wang, Y., Huang, Y., Xu, J., Zhang, P., Wang, N., et al. (2017). Таксономическая структура и функциональная ассоциация микробиома корней проса лисохвоста. Gigascience 6, 1–12.DOI: 10.1093 / gigascience / gix089

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кинг, Э. О., Уорд, М. К., и Рэйни, Д. Э. (1954). Две простые среды для демонстрации пиоцианина и флуоресцина. J. Lab. Clin. Med. 44, 301–307.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Коннова С.А., Брыкова О.С., Сачкова О.А., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. (2001). Защитная роль полисахарида, содержащего капсульные компоненты Azospirillum brasilense . Микробиология 70, 436–440. DOI: 10.1023 / A: 1010434227671

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лата, К., Гупта, С., и Прасад, М. (2013). Просо лисохвост: модельная культура для генетических и геномных исследований биоэнергетических трав. Crit. Rev. Biotechnol. 33, 328–343. DOI: 10.3109 / 07388551.2012.716809

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лау, Дж. А., Леннон, Дж. Т. (2012). Быстрые реакции почвенных микроорганизмов улучшают приспособленность растений к новым условиям окружающей среды. Proc. Natl. Акад. Sci. США 109, 14058–14062. DOI: 10.1073 / pnas.1202319109

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Ю. М. (ред.). (1997). «Механизм засухоустойчивости и генетическая экспрессия проса лисохвоста», в Foxtail Millet Breeding . (Пекин: Китайская сельскохозяйственная пресса), 433–434.

Google Scholar

Ли, З. Ю. (2011). Высокопроизводительный скрининг и идентификация бактерий, содержащих АЦЦ дезаминазу. Докторская диссертация, Чжэцзянский университет, Ханчжоу.

Лю Х. П., Ван Х. Ю., Лян Ф. Г. и Гао Х. Ф. (2013). Пространственно-временные характеристики годовых осадков в северо-западной провинции Ляонин за последние 45 лет. Водные ресурсы. Мощность 3, 45–53.

Лубсанова Д. А., Зенова Г. М., Кожевин П. А., Манучарова Н. А., Шваров А. П. (2014). Нитчатые актинобактерии засоленных почв засушливых территорий. Московский унив. Почвоведение.Бык. 69, 88–92. DOI: 10.3103 / S0147687414020057

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лугтенберг, Б., Камилова, Ф. (2009). Ризобактерии, способствующие росту растений. Annu. Rev. Microbiol. 63, 541–556. DOI: 10.1146 / annurev.micro.62.081307.162918

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Массимилиано К., Стефан Р., Кристиан С., Ана, М. З. М., Рита, Г. М. и Сильвия, С. (2015). Парадокс способности ризобактерий стимулировать рост растений и их фактическое стимулирующее действие на рост ячменя ( Hordeum vulgare L.) при солевом стрессе. Microbiol. Res. 181, 22–32. DOI: 10.1016 / j.micres.2015.08.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маяк С., Тирош Т., Глик Б. Р. (2004). Бактерии, способствующие росту растений, придают помидорам и перцу устойчивость к водному стрессу. Plant Sci. 166, 525–530. DOI: 10.1016 / j.plantsci.2003.10.025

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мишель Б. Э. и Кауфманн М. Р. (1973).Осмотический потенциал полиэтиленгликоля 6000. Plant Physiol. 51, 914–916. DOI: 10.1104 / стр.51.5.914

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мурашиге Т. и Скуг Ф. (1962). Обновленная среда для быстрого роста и биоанализа с культурами тканей табака. Plant Physiol. 15, 473–497. DOI: 10.1111 / j.1399-3054.1962.tb08052.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пенроуз Д. М. и Глик Б. Р. (2003). Методы выделения и характеристики Ризобактерий, способствующих росту растений, содержащих дезаминазу АСС. Physiol. Завод. 118, 10–15. DOI: 10.1034 / j.1399-3054.2003.00086.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиковская Р. И. (1948). Мобилизация фосфора в почве в связи с жизнедеятельностью некоторых видов микробов. Microbiologia 17, 362–370.

Google Scholar

Qin, S., Zhang, Y.J., Yuan, B., Xu, P.Y., Xing, K., Wangle, J., et al. (2014). Выделение адаптированных к среде обитания симбиотических бактерий, продуцирующих ACC дезаминазу, связанных с галофитом Limonium sinense , (Girard) Kuntze, и оценка их активности, способствующей росту растений, в условиях солевого стресса. Почва растений 374, 753–766. DOI: 10.1007 / s11104-013-1918-3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Роберсон Э. Б. и Файерстоун М. К. (1992). Связь между высыханием и образованием экзополисахаридов в почве Pseudomonas sp. Заявл. Environ. Microbiol. 58, 1284–1291.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Родригес, Р. Дж., Хенсон, Дж., Ван Волкенбург, Э., Хой, М., Райт, Л., Беквит, Ф. и др. (2008).Стрессоустойчивость растений через симбиоз, адаптированный к среде обитания. ISME J. 2, 404–416. DOI: 10.1038 / ismej.2007.106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сандхья В., Али, С. К. З., Гровер, М., Редди, Г., Венкатесварлу, Б. (2009). Снятие воздействия стресса засухи на проростки подсолнечника за счет экзополисахаридов, продуцирующих штамм GAP-P45 Pseudomonas putida . Biol. Fertil. Почвы 46, 17–26. DOI: 10.1007 / s00374-009-0401-z

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Santacruzcalvo, L., Гонсалеслопес, Дж., И Манзанера, М. (2013). Arthrobacter siccitolerans sp. nov., высокоустойчивый к высыханию, продуцирующий ксеропротектор штамм, выделенный из сухой почвы. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 4174–4180. DOI: 10.1099 / ijs.0.052902-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Шэн, X. Ф., Ся, Дж. Дж., Цзян, К. Ю., Хэ, Л. Ю., и Цянь, М. (2008). Характеристика устойчивых к тяжелым металлам эндофитных бактерий из корней рапса ( Brassica napus ) и их потенциала в стимулировании роста и накоплении свинца рапса. Environ. Загрязнение. 156, 1164–1170. DOI: 10.1016 / j.envpol.2008.04.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Р. П., Шелк Г. М., Кумар А. и Джа П. Н. (2015). Биохимия и генетика дезаминазы ACC: оружие для «стресса этилена», производимого в растениях. Фронт. Microbiol. 6: 937. DOI: 10.3389 / fmicb.2015.00937

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тамура К., Дадли Дж., Ней М. и Кумар С.(2007). MEGA4: программа молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA) версии 4.0. Мол. Биол. Evol. 24, 1596–1599. DOI: 10.1093 / molbev / msm092

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тивари С., Лата К., Чаухан П. С. и Наутиял С. С. (2016). Pseudomonas putida настраивает морфофизиологические, биохимические и молекулярные реакции у Cicer arietinum L. во время стресса из-за засухи и восстановления. Plant Physiol. Biochem. 99, 108–117. DOI: 10.1016 / j.plaphy.2015.11.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван дер Линде, К., Лим, Б. Т., Рондель, Дж. М., Антонисен, Л. П., и де Йонг, Г. М. (1999). Улучшенный бактериологический надзор за жидкостями для гемодиализа: сравнение триптического соевого агара и среды Reasoner 2A. Нефрол. Набирать номер. Пересадка. 14, 2433–2437. DOI: 10.1093 / ndt / 14.10.2433

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван Митерен, М.Дж. М., Тиетема, А., ван Лун, Э. Э., и Верстратен, Дж. М. (2008). Микробная динамика и разложение подстилки в условиях изменившегося климата в голландской пустоши. Заявл. Soil Ecol. 38, 119–127. DOI: 10.1016 / j.apsoil.2007.09.006

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Захир, З.А., Мунир, А., Асгар, Х.Н., Шахаруна, Б., и Аршад, М. (2008). Эффективность ризобактерий, содержащих АЦК дезаминазу, для стимуляции роста гороха ( Pisum sativum ) в условиях засухи. J. Microbiol. Biotechnol. 18, 958–963.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Hunter | PGP-12CV | Ротор PGP ULTRA с обратным клапаном 12 …

Особенности и преимущества

PGP Ultra берет основу самого продаваемого PGP Rotor и поднимает планку с помощью множества новых функций, разработанных в результате трех десятилетий исследований, отзывов клиентов и лабораторных испытаний. Среди наиболее заметных улучшений PGP Ultra – зубчатая передача без снятия изоляции и автоматический возврат дуги.Эти две функции позволяют поворачивать турель без повреждений и возвращать турель к исходной дуге независимо от того, где она повернута. Другие расширенные функции включают 34 варианта сопел с несколькими вариантами радиуса, а также прорезь с головкой и установочный винт. Разнообразие PGP Ultra предлагает установщикам системы множество эффективных опций на любом сайте.

• Модели: Куст
• Настройка дуги: от 50 до 360 градусов
• Резиновая крышка, установленная на заводе
• Регулировка дуги через верхнюю часть
• Механизм быстрой проверки дуги
• Зубчатая передача с водяной смазкой
• Включает: набор из 12 форсунок (8 стандартных и 4 малых угла), 1 инструмент для регулировки на заказ, 1 инструкция по набору

Подробнее о продукте

• Радиус: от 17 футов до 47 футов
• Расход: 0.От 36 до 14,8 галлона в минуту
• Рекомендуемый диапазон давления: от 25 до 70 фунтов на кв. Дюйм
• Диапазон рабочего давления: от 20 до 100 фунтов на кв. Дюйм
• Норма осадков: прибл. 0,4 дюйма / час.
• Траектория сопла: Станд. = 25 градусов, Малый угол = 13 градусов
• Общая высота: 17 дюймов
• Высота всплывающего окна: 12 дюймов
• Открытый диаметр: 1-3 / 4 “
• Размер входа: 3/4 дюйма, внутренняя резьба NPT

Статьи и видео по теме

Статьи

Видео

Диаграмма высоты и траектории сопла Hunter

МОДЕЛЬ	НОМЕР ФОРСУНКИ.	ДАВЛЕНИЕ, PSI	ГРАДУСОВ ТРАЕКТОРИИ – (A)	МАКСИМАЛЬНАЯ ВЫСОТА РАСПЫЛЕНИЯ (ФУТОВ) – (B)	РАССТОЯНИЕ ОТ ГОЛОВЫ (ФУТОВ) ДО МАКСИМАЛЬНОЙ ВЫСОТЫ – (C)
PGP Ультра-синий
	1	50	26	7 ‘	22 ‘
	2	50	26	7 ‘	22 ‘
	3	50	26	8 ‘	23 ‘
	4	50	26	8 ‘	23 ‘
	5	50	27	9 ‘	26 ‘
	6	50	27	10 ‘	28 ‘
	7	50	26	11 ‘	30 ‘
	8	50	26	11 ‘	30 ‘
	9	50	27	12 ‘	32 ‘
	10	60	25	13 ‘	32 ‘
	11	60	25	13 ‘	38 ‘
	12	60	25	13 ‘	40 ‘
МОДЕЛЬ	НОМЕР ФОРСУНКИ.	ДАВЛЕНИЕ, PSI	ГРАДУСОВ ТРАЕКТОРИИ – (A)	МАКСИМАЛЬНАЯ ВЫСОТА РАСПЫЛЕНИЯ (ФУТОВ) – (B)	РАССТОЯНИЕ ОТ ГОЛОВЫ (ФУТОВ) ДО МАКСИМАЛЬНОЙ ВЫСОТЫ – (C)
PGP Сверхнизкий угол
	4	50	15	5 ‘	22 ‘
	5	50	15	4 ‘	22 ‘
	6	50	14	4 ‘	22 ‘
	7	50	14	4 ‘	22 ‘
	8	50	14	5 ‘	24 ‘
	9	50	15	5 ‘	26 ‘
	10	60	15	6 ‘	0 ‘
МОДЕЛЬ	НОМЕР ФОРСУНКИ.	ДАВЛЕНИЕ, PSI	ГРАДУСОВ ТРАЕКТОРИИ – (A)	МАКСИМАЛЬНАЯ ВЫСОТА РАСПЫЛЕНИЯ (ФУТОВ) – (B)	РАССТОЯНИЕ ОТ ГОЛОВЫ (ФУТОВ) ДО МАКСИМАЛЬНОЙ ВЫСОТЫ – (C)
PGP Ультракороткий радиус
	1,5	45	25	8 ‘	23 ‘
	2,0	45	25	8 ‘	23 ‘
	2.5	45	25	9 ‘	26 ‘
	3,0	45	25	10 ‘	28 ‘
	4,0	45	25	11 ‘	30 ‘
	5,0	45	25	11 ‘	30 ‘
	6.0	55	25	12 ‘	32 ‘
	8,0	55	25	13 ‘	32 ‘
МОДЕЛЬ	НОМЕР ФОРСУНКИ.	ДАВЛЕНИЕ, PSI	ГРАДУСОВ ТРАЕКТОРИИ – (A)	МАКСИМАЛЬНАЯ ВЫСОТА РАСПЫЛЕНИЯ (ФУТОВ) – (B)	РАССТОЯНИЕ ОТ ГОЛОВЫ (ФУТ.) ДО МАКСИМАЛЬНОЙ ВЫСОТЫ – (C)
PGP Ультра синий
	1,5	45	25	8 ‘	23 ‘
	2,0	45	25	8 ‘	23 ‘
	2,5	45	25	9 ‘	26 ‘
	3.0	45	25	10 ‘	28 ‘
	4,0	45	25	11 ‘	30 ‘
	5,0	45	25	11 ‘	30 ‘
	6,0	55	25	12 ‘	32 ‘
	8.0	55	25	13 ‘	32 ‘
PGP Сверхнизкий угол
	2.0LA	50	13	5 ‘	22 ‘
	2.5LA	50	13	4 ‘	22 ‘
	3.5LA	50	13	4 ‘	22 ‘
	4.5LA	50	13	4 ‘	22 ‘
PGP Ультракороткий радиус
	0,5	50	15	5 ‘	8 ‘
	1,0	50	14	6 ‘	9 ‘
	2,0	50	3	1 ‘	6 ‘
PGP Ультракороткий радиус
	0.75	50	22	7 ‘	13 ‘
	1,50	50	18	7 ‘	13 ‘
	3,00	50	8	1 ‘	6 ‘

Скрининг признаков, способствующих росту растений, у устойчивых к мышьяку бактерий, выделенных из ризосферы растений сои из сельскохозяйственных земель Аргентины, на JSTOR

Цели. Целью данного исследования было изучить признаки, способствующие росту растений, у местных и высокоустойчивых к мышьяку (As) штаммов бактерий, выделенных из ризосферы растений сои (Glycine max), выращенных на сельскохозяйственных полях Аргентины.Методы. Определение MIC (минимальная ингибирующая концентрация) проводили на твердой среде с добавлением арсенита (As 3+) или арсената (As 5+). Были проведены морфологические, культуральные, физиологические, биохимические и молекулярные характеристики, а также определение in vitro свойств стимуляции роста растений (PGP) у изолятов, устойчивых к As. Мышьяк в образцах почвы определяли с помощью ICP-OES, тогда как остаточный мышьяк в культуральной среде после удаления и его накопление в клетках оценивали с помощью GF-AAS после влажного кислотного переваривания.Результаты. Выделенные штаммы включали γ-протеобактерии, такие как Enterobacter sp. и Pseudomonas sp. и актинобактерии, такие как Rhodococcus sp. Все бактериальные штаммы росли в присутствии очень высоких концентраций арсенита (более 24 мМ) и арсената (более 400 мМ). Pseudomonas sp. Штаммы одновременно проявляли несколько признаков PGP in vitro, хотя Rhodococcus erythropolis AW3 не проявлял признаков PGP. Однако R. erythropolis AW3 был наиболее устойчивым к As штамм и удалял и накапливал наибольшее количество металлоида.Заключение Присутствие резистентных к As и способствующих росту растений штаммов бактерий в ризосфере Glycine max в сельскохозяйственных почвах, содержащих мышьяк, позволяет предположить, что они потенциально могут играть важную роль в стимулировании роста растений в стрессовых условиях. Эти штаммы были способны удалять и накапливать As из жидких сред, поэтому они могут быть полезными для устойчивого растениеводства.

Информация о журнале

Plant and Soil публикует оригинальные статьи и обзорные статьи, исследующие взаимодействие биологии растений и почвоведения и предлагающие четкий механистический компонент.Это включает как фундаментальные, так и прикладные аспекты минерального питания, взаимоотношений растений и воды, симбиотических и патогенных взаимодействий растений и микробов, анатомии и морфологии корней, биологии почвы, экологии, агрохимии и агрофизики. Статьи, в которых обсуждается важная молекулярная или математическая составляющая, также попадают в рамки журнала.

Информация об издателе

Springer – одна из ведущих международных научных издательских компаний, издающая более 1200 журналов и более 3000 новых книг ежегодно, охватывающих широкий круг предметов, включая биомедицину и науки о жизни, клиническую медицину, физика, инженерия, математика, компьютерные науки и экономика.

Значения пероксидного числа, растворимости в воде и содержания влаги PGP и …

Съедобная пленка может быть альтернативной упаковкой безопасных и биоразлагаемых продуктов. Ожидается, что использование каучукового крахмала Ceara (Manihot glaviovii) в качестве материала для изготовления съедобной пленки с добавлением олеиновой фракции и олеиновой кислоты улучшит характеристики съедобной пленки на основе крахмала. Целью данного исследования является: (i) узнать о существовании взаимодействия между обработкой концентрацией крахмала Ceara и добавлением олеиновой фракции и олеиновой кислоты на физические характеристики и барьер съедобной пленки, (ii) узнать влияние обработки Концентрация крахмала Ceara на физические характеристики и барьер съедобной пленки, и (iii) знать влияние олеиновой фракции и добавления олеиновой кислоты на физические характеристики и барьер съедобной пленки.В этом исследовании используется факториал рандомизированного полностью блочного дизайна (RCBD), состоящий из двух факторов. Первым фактором была разница в концентрации каучукового крахмала ceara, состоящая из 3 уровней (3%, 4% и 5%), а вторым фактором было добавление липидов (0% липидов, 15% RBDPO и 15% олеиновая кислота (мас. / мас. полимер)) с 3 повторениями. Измеряемыми параметрами были толщина, прозрачность, скорость пропускания водяного пара (СПВП), эластичность, прочность на разрыв, растворимость и микроструктура съедобной пленки.Результаты показали, что существует взаимодействие между концентрацией каучукового крахмала Ceara с добавлением липидов в WVTR, эластичностью и параметром прочности на разрыв съедобной пленки. Концентрация каучукового крахмала Ceara оказывает значительное влияние на параметры толщины, прозрачности и растворимости. Добавление липидов существенно повлияло на параметры толщины, прозрачности и WVTR. Наилучшая обработка была получена P2A3 (4% каучукового крахмала + 15% олеиновой кислоты) со средней толщиной 0,133 мм, прозрачностью 0,818 a / мм, 17 246 г / м2.дневная скорость пропускания водяного пара, эластичность 48,781%, прочность на разрыв 1,458 МПа и растворимость 44,035%.

Новое понимание роли переносчиков ABC во взаимодействии паразитов и хостов

Abstract

Эозинофилы являются одними из основных эффекторных клеток млекопитающих, с которыми гельминты сталкиваются во время инфекции. В настоящем исследовании мы исследовали эффекты воздействия гранул эозинофилов на паразитическую нематоду овец Haemonchus contortus в качестве модели. Яйца H. contortus , подвергшиеся воздействию продуктов из гранул эозинофилов, показали повышенный отток родамина 123, и этот эффект не был связан с потерей целостности яйца. Известно, что Rh223 является специфическим субстратом P-гликопротеина (Pgp) и привел к гипотезе о том, что помимо своей критической роли в устойчивости к ксенобиотикам, переносчики ABC гельминтов, такие как Pgp, также могут участвовать в детоксикации цитотоксических продуктов хозяина. Мы показали с помощью количественной ОТ-ПЦР, что среди девяти различных генов H. contortus Pgp, Hco-pgp-3, Hco-pgp-9.2, Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 были специфически активированы на паразитарных стадиях жизни, что свидетельствует о потенциальном участии этих Pgps в детоксикации продуктов гранул эозинофилов. Используя выведенных из оболочки личинок L3, которые имитируют первую стадию жизни в контакте с хозяином, мы продемонстрировали, что гранулы эозинофилов индуцировали дозозависимую сверхэкспрессию Hco-pgp-3 и близкородственного Hco-pgp-16 . Взятые вместе, наши результаты предоставляют первое свидетельство того, что подмножество Pgps гельминтов взаимодействует с продуктами хозяина и может участвовать в их детоксикации.Это открывает путь для дальнейших исследований, направленных на изучение роли Pgps гельминтов во взаимодействии паразит-хозяин, включая уклонение от иммунного ответа хозяина.

Образец цитирования: Issouf M, Guégnard F, Koch C, Le Vern Y, Blanchard-Letort A, Che H, et al. (2014) Haemonchus contortus P-гликопротеины взаимодействуют с гранулами эозинофилов хозяина: новое понимание роли переносчиков ABC во взаимодействии паразитов и хозяев. PLoS ONE 9 (2): e87802. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0087802

Редактор: Раффи В. Ароян, UCSD, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 4 сентября 2013 г .; Одобрена: 30 декабря 2013 г .; Опубликовано: 3 февраля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Issouf et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: MI является благодарным получателем докторской степени от французского департамента Майотта. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Гельминты, передающиеся через почву, оказывают серьезное влияние на здоровье людей и животных. Эти паразиты ответственны за повышение заболеваемости, смертности и преждевременных родов [1] – [4].Хотя иммунный ответ хозяина против паразитических гельминтов очень сложен, известно, что гранулоциты участвуют как в фазе инициации, так и в фазе эффекторного иммунного ответа [5], [6]. Эти ответы связаны с пролиферацией лимфоцитов Т-хелперов 2, плазматических клеток, эозинофильных клеток, базофилов и тучных клеток [7], [8]. Среди этих гранулоцитов эозинофилы составляют гомогенную популяцию клеток, которые набираются из костного мозга в кровь, а затем в ткани хозяина, где они выживают в течение нескольких дней или даже недель [6]. Исследования in vitro показали, что гранулоциты взаимодействуют с патогенными гельминтами, вызывая серьезный ущерб паразитам [9]. Во время дегрануляции эозинофилы выделяют катионные белки со значительной цитотоксической активностью, такие как основной основной белок, пероксидаза эозинофилов и нейротоксин, полученный из эозинофилов [10]. В этом отношении ожидается, что для успешного установления паразита in vivo могут потребоваться эффективные механизмы детоксикации для защиты от продуктов иммунного ответа хозяина.На сегодняшний день эти механизмы остаются в значительной степени неизвестными у гельминтов.

Pgps – это мембранные насосы, участвующие в активном транспорте многих биологических и ксенобиотических веществ с использованием энергии, обеспечиваемой гидролизом АТФ. Они представляют здесь особый интерес, поскольку было показано, что Pgps позвоночных участвует в транспорте продуктов иммунных клеток [11] – [16]. Например, ингибирование активности Pgp в естественных клетках-киллерах коррелирует со снижением их цитотоксичности [17]. У нас есть прецедент из исследования устойчивости к антигельминтному препарату ивермектин, чтобы ожидать, что Pgps от паразита может играть ту же роль, что и у хозяина, и, таким образом, обеспечивать защиту за счет транспорта продуктов гранулоцитов хозяина [18] – [20].

Паразитическая нематода овец Haemonchus contortus представляет собой один из наиболее патогенных видов, влияющих на животноводство [21]. Воздействие инфекционных личинок H. contortus на эозинофилы in vitro снижает их способность устанавливать последующую инфекцию in vivo , что делает этот вид подходящей моделью для исследования взаимодействия между эозинофилами и паразитом [22]. Ранее мы разработали анализ на основе яиц, в котором флуоресцентный транспорт родамин-123 из H.contortus опосредуется Pgp [23], [24]. В этом исследовании мы наблюдали, что белки гранул эозинофилов увеличивают этот транспорт Rh223, предполагая роль Pgp в защите паразита. Пытаясь идентифицировать задействованные молекулярные механизмы, мы клонировали последовательности нескольких различных генов Pgp из H. contortus . Количественная ПЦР была использована для исследования кинетики экспрессии генов Pgp на разных стадиях развития с целью выявления тех, которые потенциально могут быть вовлечены в детоксикацию продукта хозяина in vivo .Мы также исследовали изменения в экспрессии гена Pgp, вызванные воздействием гранул эозинофилов in vitro .

Здесь мы впервые сообщаем, что несколько H. contortus Pgps демонстрируют повышенную экспрессию, специфически связанную с паразитарными стадиями, и что две из них показывают специфическое увеличение экспрессии после воздействия продуктов гранулоцитов хозяина.

Результаты

Выделение эозинофилов барана и очистка гранулированного продукта

Мы объединили метод градиента Перколла с анализами проточной цитометрии, чтобы выбрать интактную популяцию эозинофилов из крови инфицированной овцы (рис. 1А).Этот подход позволил нам получить популяцию клеток, содержащую примерно 95% эозинофилов (рисунок 1B). Чистоту эозинофилов дополнительно проверяли окрашиванием по Гимзе-Маю-Грюневальду (рис. 1С). Эти очищенные клетки позволили нам экстрагировать белки гранул эозинофилов с помощью ультрацентрифугирования для последующих экспериментов, включая функциональный анализ in vitro и модуляцию экспрессии мРНК Pgp. Очищенные гранулярные белки анализировали с помощью SDS-PAGE, выделяя приблизительно 10 отдельных полос в диапазоне от 11 до 70 кДа.Напротив, общий лизат эозинофилов, используемый в качестве контроля для эффективности очистки гранул, содержал несколько дополнительных белков в диапазоне от 11 до более 100 кДа (фигура 1D).

Рисунок 1. Очистка эозинофильных клеток от овец, инфицированных H. contortus .

Популяции клеток гранулоцитов выделяли из популяции лейкоцитов с помощью проточной цитометрии с использованием параметров прямого рассеяния (FS) и разброса по размеру (SS). Точечные гистограммы с общей популяцией лейкоцитов (A) и точечные гистограммы после разделения по плотности Перколла (B) выделяют популяцию клеток, обогащенную R2, соответствующую эозинофилам.Чистоту популяции эозинофильных клеток дополнительно проверяли окрашиванием по Гимзе-Маю-Грюнвальду (GMG) (C). GMG окрашивает ядра эозинофильных клеток в фиолетовый цвет, а цитоплазматические гранулы – в оранжевый. Общий лизат эозинофилов (1) и очищенные белки гранул эозинофилов (2) разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле и окрашивали кумасси синим (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.g001

Гранулы эозинофилов модулируют активность

H. contortus Pgps

Ранее мы сообщали, что активность Pgp может быть проанализирована в H.contortus с использованием анализа оттока родамина (Rh223) [23], [24]. В настоящей работе отток Rh223 увеличивался пропорционально воздействию гранулярных белков (рис. 2). Эта взаимосвязь была установлена ​​до концентрации белка 1250 мкг / мл, после которой было достигнуто плато 75% стимуляции (P <0,0069). Потеря Rh223 из яиц не была связана с потерей целостности яйца, поскольку FITC был исключен как из необработанных яиц, так и из яиц, подвергшихся воздействию продуктов в виде гранул эозинофилов, тогда как FITC легко мог проникать в яйца, поврежденные замораживанием (рисунок S1).Этот результат предоставил первое функциональное доказательство того, что активность паразита Pgp может модулироваться продуктами гранул эозинофилов хозяина.

Рис. 2. Анализ оттока родамина Rh223, проведенный на яйцах Haemonchus contortus , стимулированных белками гранул эозинофилов.

Линия регрессии была получена на основе логарифмического агониста (гранулярные белки) в сравнении с моделью ответа с переменным наклоном с использованием программного обеспечения Prism. Наблюдалось значительное влияние продуктов гранул эозинофилов на активацию Pgp (P <0.0069).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.g002

Идентификация транскриптов Pgp на взрослой стадии

H. contortus

В настоящей работе эксперименты с 3′-RACE-PCR позволили идентифицировать 8 частичных последовательностей кДНК, соответствующих 3′-концу различных транскриптов Pgp H. contortus. Затем все эти последовательности кДНК были дополнительно удлинены на их соответствующем 5′-конце с помощью ОТ-ПЦР, и среди восьми кандидатов были получены четыре полные кодирующие последовательности кДНК.Описания последовательностей, включая размер и ближайших гомологов у C. elegans и других видов нематод, приведены в таблице 1. Когда полученные полные или частичные последовательности однозначно совпадают с одним ортологичным геном в C. elegans , соответствующий H Последовательности кДНК Pgp. contortus были названы в соответствии с Beech et al [25]. Не удалось идентифицировать четкий ортолог Hco-pgp-16 в C. elegans , поэтому числовой ряд генов Pgp был расширен.Интересно, что мы идентифицировали три различные последовательности Pgp H. contortus , для которых ближайшим гомологом в C. elegans был Cel-pgp-9 (т.е. Hco-pgp-9.1 , Hco-pgp-9.2 и Hco-pgp-9.3 ). Был проведен филогенетический анализ полных последовательностей, полученных у H. contortus , включая гомологичные последовательности у ближайших видов ( Caenorhabditis elegans , (Cel), Caenorhabditis briggsae (Cbr), Ascaris suum (Asu), Parascaris equorum (Peq)).Сетевой анализ расщепления-разложения выявил филогенетическую близость последовательности Hco-pgp-3 с группой Cel-pgp-3 / Cel-pgp-4 (рис. 3). Hco-pgp-9.1 и Cel-pgp-9 явно являются ортологичными генами. Hco-pgp-16 в кластере с Peq-pgp-16 , Asu-mrp-3 и Cbr-CBG12369 , что позволяет предположить, что последовательность Ascaris была идентифицирована неправильно. Несмотря на то, что последовательность Hco-pgp-16 не имеет ортолога в C.elegans , он сгруппирован в группе Cel-pgp-3 и Cel-pgp-4 . Выравнивание выведенной аминокислотной последовательности Hco-PGP-16 с Cel-PGP-4 и Cel-PGP-3 выявило некоторое аминокислотное сходство в диапазоне от 66 до 67% соответственно (рисунок S2)

Рисунок 3. Филогенетическая сеть расщепления-декомпозиции, включающая последовательностей C. elegans, Pgp, Hco-pgp-3 , Hco-Pgp-16 и их ближайших гомологов.

Числа над ветвями представляют значения начальной загрузки для 1000 псевдорепликатов.Трехбуквенные префиксы в именах генов Pgp Hco, Cel, Cbr, Peq и Asu относятся к H. contortus, C. elegans, C. brigsae, Parascaris equorum и Ascaris suum соответственно. Номера доступа Genbank для нуклеотидных последовательностей представлены в таблице S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.g003

Подмножество генов Pgp специфически активируется во время паразитарной фазы жизненного цикла

H. contortus

Для предоставления информации о H.contortus Pgps, которые потенциально могут участвовать во взаимодействии паразит-хозяин, мы исследовали кинетику их экспрессии на разных стадиях развития паразита. H. contortus представляет собой простой жизненный цикл, включающий свободную жизнь и паразитическую фазу в пределах одного хозяина. Яйца, выпущенные с фекалиями хозяина, развиваются на пастбище в течение трех последовательных личиночных стадий (от L1 до L3). Переход к паразитизму происходит, когда хозяин поедает инфекционных личинок третьей стадии (L3) во время выпаса.Затем личинки выходят из оболочки (xL3) и развиваются через четвертую личиночную стадию (L4) в зрелых взрослых червей в сычуге хозяина.

Уровень экспрессии 9 различных мРНК Hco-pgp (включая Hco-pgp-2 ) исследовали в яйцах, на стадиях L3, L4 и взрослых самцов с помощью ПЦР в реальном времени. Обратите внимание, что взрослые самки не были включены, поскольку они содержат яйца, которые могут мешать анализу экспрессии Pgp.

Было обнаружено, что все гены Pgp экспрессируются на четырех различных стадиях развития, изученных в этой работе.Однако для некоторых Pgps наблюдаются разительные различия в уровне экспрессии между свободноживущими и паразитическими стадиями (рис. 4). Например, Hco-pgp-3 , Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 транскриптов оказались значительно более многочисленными на стадиях паразитарной жизни (L4 и / или взрослый самец) по сравнению со свободноживущими стадиями (яйца и / или L3) с повышенной экспрессией в диапазоне от 7,5 раз ( Hco-pgp-16 ) до 250 раз ( Hco-pgp-11 ) .Внутри паразитарных стадий было обнаружено, что Hco-pgp-3 одинаково экспрессируется в L4 и взрослых, тогда как Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 мРНК оказались более многочисленными на взрослой стадии, чем у взрослых. L4. Среди трех гомологов H. contortus Pgp-9 следует отметить, что только Hco-pgp-9.2 было временно повышено на стадии L4 в отличие от Hco-pgp-9.1 и Hco-pgp. -9,3 , которые более широко экспрессируются на стадиях свободного существования. Hco-pgp-3 , Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 представляют собой кандидатов, представляющих большой интерес для их потенциального участия в детоксикации продукта хозяина in vivo , хотя мы не можем исключить, что другие Pgps также могут играть важную роль во взаимодействии с паразитами хозяина. Эти четыре Pgps были выбраны для дальнейшей характеристики с целью изучения их потенциального взаимодействия с продуктами в виде гранул эозинофилов.

Рисунок 4.Экспрессия мРНК Pgp в течение жизненного цикла H. contortus .

Эксперименты ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в трех экземплярах для каждой стадии развития: яйца (E) и личинки третьей стадии (L3), соответствующие свободноживущим стадиям, а также личинки четвертой стадии (L4) и взрослые самцы ( А) соответствующие паразитарным стадиям. Уровни экспрессии мРНК, наблюдаемые в яйцах, были нормализованы к 1. Кратные изменения мРНК были рассчитаны с использованием трех различных эталонных генов ( gapdh, актин и β-тубулин ).Для каждого образца проводили ОТ-ПЦР в реальном времени в трех экземплярах и дважды повторяли с использованием двух независимых матриц кДНК. * Значимое отличие от контрольных значений после множественного сравнительного теста Бонферрони (* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.g004

Гранулы эозинофилов индуцируют специфическую сверхэкспрессию генов

Hco-pgp-3 и Hco-pgp-16 у личинок L3 без оболочки

Данные анализа транспорта Rh223 предполагают, что продукты гранул эозинофилов могут напрямую взаимодействовать с транспортерами Pgp в H.contortus яиц. Предыдущие исследования бактерий, млекопитающих и нематод показали, что субстраты Pgp могут специфически индуцировать сверхэкспрессию соответствующего им гена Pgp [26] – [29]. Воспользовавшись этим свойством, мы исследовали, какие генов Pgp H. contortus специфически отвечают на продукты гранул хозяина in vivo . Экспрессию Hco-pgp-3 , Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 контролировали с помощью qRT-PCR в искусственно изолированном L3 H.contortus , которые имитируют первую паразитарную стадию при контакте с гранулами эозинофилов in vivo . Личинки в течение 24 часов подвергались воздействию возрастающих концентраций гранулированных продуктов от 300 до 2 000 мкг / мл. Сравнение стимулированного и нестимулированного L3 без оболочки (контроль) показало значительное ( P <0,01, n = 6 ) и дозозависимое увеличение уровней экспрессии мРНК Hco-pgp-3 и Hco-pgp-16. у стимулированных личинок, тогда как экспрессия Hco-pgp-9.2 и Hco-pgp-11 остались без изменений (рисунок 5). Этот результат показывает, что продукты в виде гранул эозинофилов содержат соединения, которые специфически модулируют экспрессию Hco-pgp-3 и Hco-pgp-16 , и предлагает их в качестве кандидатов Pgps, которые специфически защищают H. contortus от продуктов в виде гранул in vivo. .

Фигура 5. Экспрессия мРНК Pgp в личинках xL3 H. contortus после 24-часовой стимуляции возрастающими концентрациями белков гранул эозинофилов.

Эксперименты ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в трех экземплярах для каждого образца с использованием двух различных препаратов кДНК на образец. Уровни экспрессии мРНК нормализовали с использованием нестимулированного xL3. Изменения кратности мРНК рассчитывали с использованием трех различных эталонных генов ( gapdh, актин и β-тубулин ). ** Значительное отличие от контрольных значений после анализа теста Мэн-Уитни ( P <0,01 ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.g005

Обсуждение

Гельминты Pgps широко изучались на предмет их участия в транспорте ксенобиотиков и их связи с лекарственной устойчивостью. Их роль в других критических функциях, таких как взаимодействие паразит-хозяин, еще предстоит изучить. Мы обнаружили, что продукты из гранул эозинофилов специфически влияют на транспорт Rh223, который, как ранее было показано, опосредуется переносчиками Pgp. Известно, что эозинофилы являются ключевыми эффекторами при заражении гельминтами, и мы предположили, что паразитарный гельминт Pgp может играть роль в детоксикации продуктов гранул эозинофилов.Гранулы эозинофилов в основном состоят из четырех очень основных белков, которые, как было доказано, токсичны для гельминтов. К ним относятся пероксидаза эозинофилов (EPO), основной основной белок (MBP), катионный белок эозинофилов (ECP) и нейротоксин, полученный из эозинофилов (EDN) [30], [31]. Белки-гранулы эозинофилов хранятся в кристаллоидной структуре, которую можно очистить ультрацентрифугированием [32]. Однако очистка популяции эозинофильных клеток из овечьей крови остается сложной задачей. Например, Terefe et al. [22] сообщил, что один градиент Перколла (1,090 г / мл) позволяет очищать эозинофилы барана с чистотой от 43 до 63%. В настоящей работе мы оптимизировали этот подход, используя два градиента плотности Перколла в сочетании с сортировкой клеток, в результате чего клеточная популяция содержала 95% эозинофилов. Таким образом, мы могли предположить, что большая часть белка, собранного после лизиса эозинофилов и ультрацентрифугирования, будет соответствовать гранулированным продуктам. Разделение очищенного белка гранул эозинофилов овцы с помощью SDS-PAGE выявило набор белков в диапазоне от 11 до 20 кДа.Возникает соблазн предположить, что по крайней мере некоторые из них могут соответствовать основным катионным белкам (MBP, ECP и EDN), имеющим сходную молекулярную массу, как сообщается для белков гранул эозинофилов человека (т.е. 13, 16 и 18 кДа соответственно) [33]. Эти белки-гранулы затем использовали в анализе оттока Rh223 для оценки их потенциальной роли как модуляторов активности Pgp. Используя яиц H. contortus , мы показали, что белки гранул эозинофилов способны специфически взаимодействовать с паразитом Pgp.Этот результат обеспечивает функциональное доказательство того, что гранулярные белки могут представлять потенциальные субстраты для паразита Pgp in vivo . Интересно, что взаимосвязь между концентрацией белка в гранулах и результирующим оттоком Rh223 сходна с отношениями, наблюдаемыми с классическими субстратами Pgp, такими как колхицин [34], указывая на сильное взаимодействие между H. contortus Pgps и гранулированными белками. Таким образом, этот результат стал убедительным аргументом в пользу дальнейшего изучения этого взаимодействия на молекулярном уровне.

Чтобы идентифицировать генов H. contortus Pgp, потенциально участвующих в транспорте белка гранул in vivo , нашей первой целью было изучить их экспрессию на паразитарной стадии (взрослый самец) H. contortus . В отличие от млекопитающих нематоды обладают большим разнообразием генов Pgp. Модельная нематода Caenorhabditis elegans , которая тесно связана с H. contortus , кодирует до 14 генов Pgp (от pgp-1 до pgp-14 ) [35].Однако в H. contortus на сегодняшний день описана только одна полная последовательность Pgp ( Hco-pgp-2 ) [36]. В недавнем исследовании Williamson и др. разработали количественную ПЦР для некоторых из них, соответствующих последовательностям частичных транскриптов, идентифицированных на стадии инфекционной личинки (L3), что послужило основой для анализа экспрессии Pgp H. contortus [37]. В настоящей работе транскриптов Pgp H. contortus были дополнительно исследованы на взрослой стадии с использованием подхода ОТ-ПЦР.Мы также расширили информацию о последовательностях транскриптов, включая области 3’UTR, чтобы оптимизировать дизайн специфичных для транскриптов праймеров для последующих количественных экспериментов ПЦР.

В настоящем исследовании мы нашли соответствующую частичную или полную последовательность кДНК для 8 из них (т.е. Hco-pgp-3 , Hco-pgp-9.1 , Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-9.3 , Hco-pgp-10 , Hco-pgp-11 , Hco-pgp-14 и Hco-pgp-16 ) и дополнительно подтвердили экспрессию ранее описанного Hco-pgp-2 [ 36] в H.contortus взрослых самцов.

Анализ последовательностей Pgp H. contortus показал высокую степень консервативности с соответствующими гомологами у C. elegans , за исключением Hco-pgp-16 , которому соответствует ближайший гомолог, обнаруженный в Genbank. к недавно описанной последовательности pgp-16 от отдаленно родственного паразита лошади Parascaris equorum . Несмотря на отсутствие четкого ортолога у свободно живущих видов C.elegans , ближайшим гомологом в H. contortus была последовательность Hco-pgp-3 . Примечательно, что полная последовательность кДНК, соответствующая гену Hco-pgp-3 , идентифицированному в настоящей работе, полностью перекрывается с двумя отдельными частичными последовательностями кДНК, ранее обозначенными как Hco-pgp-3 (HM635768) и Hco-pgp- 4 (HM635766), подчеркивая необходимость получения полной последовательности кДНК перед определением окончательной номенклатуры генов H. contortus .Интересно, что мы смогли идентифицировать три потенциальных гомолога C. elegans Pgp-9 , которые в основном различаются по их соответствующему участку 3’UTR (данные не показаны). Происхождение и функциональное значение таких потенциальных событий дублирования еще предстоит изучить.

Для паразитарных нематод переход к паразитизму предполагает некоторые важные адаптации, такие как уклонение от иммунного ответа хозяина и изменения в питании, метаболизме и росте [38], [39]. Чтобы идентифицировать H.contortus Pgp гены, потенциально участвующие во взаимодействии паразита и хозяина, и, более конкретно, гены, участвующие в детоксикации продуктов гранул эозинофилов, мы сравнили уровень экспрессии H. contortus Pgps на стадиях свободного существования (яйца и L3) и паразитарных стадиях (L4 и взрослый). Наши результаты показали, что мРНК Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-11 , Hco-pgp-3 и Hco-pgp-16 сверхэкспрессируются в L4 и / или взрослых по сравнению с свободными мРНК. живые этапы.

Гомологи pgp-9, и pgp-11 были связаны с антигельминтной устойчивостью паразитических нематод Teladorsagia circus и Parascaris equorum соответственно [40], [41]. Сверхэкспрессия этих генов на паразитарных стадиях H. contortus поднимает вопрос о потенциальных функциях во время взаимодействия между хозяином и паразитом. Ближайший гомолог Hco-pgp-3 , идентифицированный в банке данных, – это C.elegans pgp-3 , который участвует в защите от природных токсинов, продуцируемых растениями и бактериями [42], [43]. Интересно, что наш филогенетический анализ показал, что pgp-16 ортологов H. contortus , Ascaris suum и Parascaris equorum сгруппированы в той же группе, что и Cel-pgp-3 , что подчеркивает важность этого Pgp. группа для будущих исследований.

Заманчиво предположить, что специфическая сверхэкспрессия Hco-pgp-3 , Hco-pgp-9.2 , Hco-pgp-11 и Hco-pgp-16 на паразитарных стадиях могут отражать их потенциальную активацию во время взаимодействия хозяин / паразит. Сообщалось, что субстраты Pgp могут вызывать сверхэкспрессию родственных им генов Pgp у нематод [28], [29], и мы смогли показать, что Hco-pgp-3 и Hco-pgp-16 , но не Hco-pgp-9.2 или Hco-pgp-11 , были специфически индуцированы у личинок L3 (xL3) без оболочки, подвергнутых воздействию белка гранул эозинофилов дозозависимым образом.Специфическая индукция Hco-pgp-3 и близкородственного Hco-pgp-16 представляет собой привлекательный и многообещающий результат, предполагающий, что подмножество H. contortus Pgps может участвовать в детоксикации продуктов иммунных клеток хозяина. Это закладывает основу для будущей работы, направленной на более подробную расшифровку механизма действия фракционированных белков эозинофилов и других продуктов хозяина на Pgps паразитических гельминтов.

В заключение, исследование нематод Pgps до настоящего времени в основном основывалось на их участии в детоксикации лекарств в довольно искусственных условиях антигельминтного лечения.Настоящая работа впервые демонстрирует, что взаимодействия происходят между паразитическими гельминтами Pgps и продуктами клетки-хозяина, и дает новое понимание потенциальных молекулярных механизмов, участвующих в преодолении иммунного ответа хозяина. Это, в свою очередь, может предоставить новые потенциальные цели для будущей борьбы с H. contortus и другими гельминтами, имеющими медицинское и ветеринарное значение.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все эксперименты на животных были одобрены Региональным центром-Лимузенским комитетом по этике (CL2006-012) и проводились на основании лицензии, выданной Управлением ветеринарных служб в Туре; Франция с номером аккредитации: B-37-175-3.

Очистка эозинофилов

эозинофилов из периферической крови овец, инфицированных Haemonchus contortus (21 день после заражения), очищали с помощью прерывистых градиентов плотности Перколла в сочетании с сортировкой с помощью проточной цитометрии. Вкратце, собирали 600 мл крови и сразу же смешивали с 50 мл раствора, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в концентрации 40 мг на мл, чтобы избежать свертывания крови. Для лизиса эритроцитарных клеток 150 мл крови смешивали с 275 мл воды при перемешивании.Через 20 с лизис клеток останавливали добавлением 275 мл 2,5-кратного раствора PBS. Затем клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 мин и осадок 3 раза промывали в 50 мл 1X PBS (0,14 М NaCl, 8 мМ Na2HP04, 3 мМ KCl, 1,5 мМ Kh3P04. PH 7,4). Был подготовлен множественный прерывистый градиент плотности (1,040, 1,055, 1,070 и 1,080 г / мл). Растворы Перколла наливали в центрифужную пробирку на 15 мл, начиная с раствора самой низкой плотности (1,040 г / мл) и заканчивая раствором самой высокой плотности (1.080 г / мл). Суспензию клеток осторожно наслаивали поверх градиента и центрифугировали при 400 g в течение 15 мин. Очищенные клетки собирали на границе раздела 1,070 / 1,080 г / мл и промывали 1X PBS. Выделенные клетки дополнительно очищали проточной цитометрией (MoFlo®, DakoCytomation, 4850 Innovation Drive, Fort Collins, CO) с использованием параметров прямого рассеяния (FS) и разброса по размеру (SS). SS – это светорассеяние под углом 90 градусов, которое отражает гранулярность ячеек, а прямое угловое рассеяние света (FS) пропорционально размеру ячейки.Чистоту клеточной популяции дополнительно проверяли окрашиванием Giemsa May-Grunwald (Reactifs RAL ^® , Martillac, Франция) (GMG) в соответствии с рекомендациями производителя.

Выделение гранул

Гранулы выделяли ультрацентрифугированием в соответствии с методами, описанными Slifman et al. [44]. Вкратце, клетки эозинофилов центрифугировали при 600 g в течение 10 мин и полученный осадок промывали в 5 мл 1X PBS. Затем эозинофилы лизировали в 0.25 M сахарозы путем многократного пропускания через иглу 18 размера, прикрепленную к шприцу. Лизат эозинофилов центрифугировали при 600 g в течение 10 мин для отделения целых клеток и гранул. Затем гранулы осаждали ультрацентрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Количество белков в гранулах определяли с помощью спектрофотометра с нанокапельками (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) и хранили при -80 ° C до использования.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)

Лизат эозинофилов и очищенные белки в гранулах эозинофилов разделяли на акриламидных гелях SDS-PAGE и окрашивали кумасси синим [45].Оба образца суспендировали в буфере для денатурации, нагревали при 100 ° C в течение 5 мин и наносили на 10% полиакриламидные гели. Белки визуализировали после окрашивания геля в 0,25% растворе кумасси синего.

Паразиты

Для всех экспериментов использовали изолят Weybridge Haemonchus contortus . Овцы были инфицированы 6000 инфекционными личинками третьей стадии (L3). Яйца собирали через 28 дней после заражения с фекалиями хозяина, как описано ранее [46]. Личинки L3 были собраны из совместных культур и впоследствии подвергнуты искусственному вымыванию (xL3) после воздействия 0.1% раствор гипохлорита на 10 мин. Личинок четвертой стадии (L4) и взрослых самцов нематод (A) собирали со слизистой оболочки сычуга овец, вскрытых через 7 или 25 дней после заражения, соответственно.

Rhodamine 123 (Rh223), анализ

Влияние продуктов эозинофилов на активность Pgp паразитов определяли по изменению накопления родамина (Rh223) в яйцах H. contortus . Примерно пятнадцать тысяч яиц суспендировали в деионизированной воде (1 мл) и центрифугировали при 1000 g в течение 1 мин.Супернатант отбрасывали. Раствор Rh223 (2 мл 1,5 мкМ Rh223 в деионизированной воде) добавляли к осадку яиц и инкубировали в течение 5 мин при 20 ° C в темноте. Затем добавляли продукты в виде гранул эозинофилов при четырех различных конечных концентрациях (300, 600, 1250 и 2500 мкг / мл белков гранул), и яйца инкубировали еще 10 мин при 20 ° C, а затем центрифугировали при 1000 g в течение 1 часа. мин. Супернатант удаляли, и яйца трижды промывали 5 мл ледяной деионизированной воды.Перед анализом яйца выдерживали в темноте 60 мин. Удельную флуоресценцию измеряли с помощью спектрофлуориметра Quanta Master (PTI, NJ, USA), оснащенного ксеноновой лампой мощностью 75 Вт (λ возбуждения = 495 нм, λ испускания = 525 нм). Данные были представлены в условных единицах зеленой флуоресценции с поправкой на естественную зеленую флуоресценцию яиц и выражены как процент флуоресценции в контрольных яйцах. Было проанализировано три повтора для каждого условия. Отток Rh223 без гранул эозинофилов был нормализован до 0.Уравнение Хилла использовалось для описания зависимостей “доза-реакция” [47] путем вычисления следующего уравнения:

Y = Низ + (Верх – Низ) / (1 + 10∧ ((logEC50-X)))

, где Bottom – это исходный уровень, а Top – максимальный эффект, EC50 – доза, дающая половину максимального эффекта, X – концентрация белка в гранулах (log). Нижние значения были доведены до 0, что соответствует флуоресценции контрольных яиц.

Молекулярная биология

Для идентификации H.contortus Pgps, суммарную РНК экстрагировали у 10 взрослых самцов. Замороженные гранулы паразитов гомогенизировали в реагенте Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) и выделяли РНК в соответствии с рекомендациями производителя. Осадки РНК растворяли в 35 мкл раствора для безопасной ресуспендирования РНК (Ambion, Остин, Техас, США). ДНК удаляли из образцов РНК с использованием ДНКазы, свободной от РНКазы RQ1 (Promega,). Концентрации РНК измеряли с помощью спектрофотометра с нанокаплями (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) и доводили до 100 нг / мкл.

Синтез первой цепи кДНК выполняли на 1 мкг общей РНК с использованием праймера oligo (dT) RACER (Invitrogen) и обратной транскриптазы с надстрочным индексом III (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Используя первую цепь кДНК, полученную из взрослого человека H. contortus , 3′-концы кДНК Pgp были выделены с помощью 3’RACE PCR с использованием набора GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Ампликоны 3’RACE PCR получали с прямыми праймерами, сконструированными для H.contortus суперконтигов (доступны по адресу http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/h_contortus). Чтобы расширить последовательность на их 5′-концах, был проведен новый набор экспериментов ПЦР с использованием либо праймер SL1 (GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG) или прямые праймеры, сконструированные из последовательностей суперконтигов. Полный список праймеров представлен в таблице S1. Все реакции ПЦР проводили с помощью программируемого термоциклера (Biometra, Геттинген, Германия). Эксперименты по 3 ‘RACE проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 15 нг кДНК первой цепи, 0.5 единиц полимеразы LongAmp ™ Taq (New England Biolabs, Ипсвич, Соединенное Королевство), 200 мкМ каждого dNTP и 0,4 мкМ каждого праймера. Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 94 ° C в течение 30 секунд с последующими 32 циклами: 94 ° C в течение 30 секунд, 54–60 ° C (в зависимости от конкретной температуры плавления праймеров) в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 30 секунд. –240 сек (в зависимости от размера ампликона). Последнюю стадию удлинения проводили при 72 ° C в течение 7 минут. Продукты амплификации были клонированы в векторе PGEM-T (Promega, Шарбоньер, Франция) и секвенированы GATC biotech (Констанц, Германия).

Сравнение последовательностей и филогенетический анализ

Поиск в базе данных

был выполнен с использованием сервера Haemonchus contortus blast (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/h_contortus) и BLAST Network Service (Национальный центр биотехнологической информации), используя алгоритм BLASTX [48].

Нуклеотидные последовательности (номера доступа Genbank представлены в таблице S3) были транслированы, а аминокислотные последовательности выровнены с использованием MUSCLE [49].Соответствующие выравнивания нуклеотидов были получены путем конкатенации кодонов с использованием сервера REVTRANS (http://www.cbs.dtu.dk/services/RevTrans/) [50]. Модель нуклеотидной замены, которая лучше всего соответствовала данным, была определена с помощью jModeltest версии 2.0 [51] на сервере Phylemon 2 [52].

Филогенетические отношения между последовательностями Pgp были определены для всех нуклеотидных последовательностей полной длины с использованием метода расщепления-разложения, реализованного в SPLITSTREE версии 4.11.3 [53], с использованием общей схемы замены во времени (GTR) с моделью гамма-распределения скоростей сайтов вариация (результаты jModeltest).

ПЦР в реальном времени

Экспрессию Pgps H. contortus на различных стадиях развития анализировали с использованием общей РНК, экстрагированной из 25 мкл яичного осадка, 5000 L3, 400 L4, 10 взрослых самцов, соответственно, с использованием реагента Trizol (Invitrogen). Чтобы исследовать влияние гранул эозинофилов на модуляцию экспрессии Pgp, общую РНК экстрагировали из xL3, инкубированного в воде (контроль) или с возрастающими концентрациями продуктов гранул эозинофилов (от 300 до 2000 мкг / мл белков) в течение 24 часов.Один микрограмм общей РНК из разных стадий нематод использовали для создания кДНК с праймером oligo (dT) RACER (Invitrogen) и обратной транскриптазой с надстрочным индексом III (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Количественные эксперименты с ОТ-ПЦР проводили с конкретными прямыми и обратными праймерами, сконструированными либо в идентифицированных последовательностях. Последовательности праймеров, использованные для количественных экспериментов с ОТ-ПЦР, представлены в таблице S2. Продукты амплификации ПЦР обрабатывали на геле для электрофореза и секвенировали, чтобы гарантировать отсутствие неспецифических продуктов амплификации и пригодность праймеров для qRT-PCR.

Эксперименты ПЦР в реальном времени проводили путем мониторинга увеличения флуоресценции IQ SYBR® Green в реальном времени (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) с помощью Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Сидней, Австралия). Относительные кратные изменения экспрессии генов рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа экспрессии генов (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) с использованием H. contortus gapdh, актина и β-тубулина в качестве эталонных генов. Экспрессия мРНК Pgp в яйцах или xL3, инкубированных в отсутствие гранул эозинофилов, была нормализована до 1.Данные представлены в виде кратных изменений среднего значения ± SEM экспрессии мРНК. Для анализа экспрессии мРНК Р-гликопротеина H. contortus на разных стадиях развития нематод статистически значимые различия между яйцами и другими стадиями были проанализированы с помощью одностороннего теста ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Бонферрони. Различия считались достоверными при P <0,05. Статистически значимые различия между xL3 в присутствии и отсутствии гранул эозинофилов анализировали с помощью непараметрического теста Мана-Уитни с использованием программного обеспечения Prism (v5.02, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Анализ поглощения флуоресцеина изотиоцианата (FITC), проведенный на яйцах H. contortus после воздействия продуктов из гранул хозяина. Для контроля жизнеспособности яиц H. contortus после контакта с продуктами гранул эозинофилов хозяина был проведен анализ поглощения FITC на яйцах, инкубированных в PBS (A), яйцах, инкубированных с продуктами гранул эозинофилов (B), яйцах, замороженных при температуре -80 ° C. ° C.Отсутствие поглощения FITC яйцами, инкубированными с продуктами в виде гранул эозинофилов хозяина (A и B) или без них, подтвердило их жизнеспособность. Напротив, сильная флуоресценция, связанная с поглощением FITC, наблюдалась в яйцах, предварительно замороженных при -80 ° C в течение одного часа (C). Эти окрашенные яйца представляют собой контроль смертности яиц. Прутки: 50 мкм. Метод: Приблизительно одна тысяча яиц H. contortus суспендировали в PBS 1X и инкубировали 1 час при комнатной температуре с белками гранул хозяина в конечной концентрации 2 500 мкг / мл.В качестве контроля жизнеспособности или смертности яйца также инкубировали в PBS 1X при комнатной температуре или замораживали при -80 ° C в течение одного часа соответственно. Раствор флуоресцеинизотиоцианата (FITC) (20 мкл 1 мг / мл FITC в PBS 1X) добавляли к яйцам и инкубировали в течение 1 ч при 24 ° C в темноте. Затем яйца трижды промывали 1 мл ледяной деионизированной воды и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (камера DP50, Olympus) с полосовым фильтром с возбуждением от 450 до 480 нм и эмиссией 515 нм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Выравнивание последовательностей Hco-PGP-16, Hco-PGP-3, Cel-PGP-3 и Cel-PGP-4. Последовательности Hco-PGP-16, Hco-PGP-3, Cel-PGP-3 и Cel-PGP-4 были сопоставлены с использованием алгоритма MUSCLE [49] и дополнительно обработаны с помощью программы GeneDoc. Выделены типичные особенности Pgp, включая мотивы Walker A и Walker B, сигнатуры транспортеров ABC и 12 трансмембранных доменов. Аминокислоты, общие для четырех последовательностей, заштрихованы темно-синим цветом.Аминокислоты, консервативные между Hco-PGP-3, Cel-PGP-3, Cel-PGP-4, но не Hco-PGP-16, заштрихованы голубым. Аминокислоты, консервативные между Hco-PGP-16, Cel-PGP-3, Cel-PGP-4, но не Hco-PGP-3, заштрихованы красным.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087802.s002

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить «платформу для экспериментальных инфекционных болезней», особенно Т. Чаумей и Э. Гиттон, за то, что они предоставили нам животных. Мохамед Иссуф – благодарный получатель докторской степени французского департамента Майотта.Мы благодарим C. Chylinski за чтение и исправление этой рукописи.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: MI DK CN. Проведены эксперименты: MI FG CK YL ABL HC. Проанализированы данные: MI FG YL ABL RNB DK CN. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: FG CK ABL. Написал статью: MI ABL RNB DK CN.

Ссылки

1. 1. Кристиан П., Хатри С.К., Вест КП-младший (2004) Антенатальное антигельминтное лечение, вес при рождении и выживаемость младенцев в сельских районах Непала.Ланцет 364: 981–983.
2. 2. Chan MS, Guyatt HL, Bundy DA, Medley GF (1996) Динамические модели заболеваемости шистосомозом. Am J Trop Med Hyg 55: 52–62.
3. 3. Raso G, Luginbuhl A, Adjoua CA, Tian-Bi NT, Silue KD, et al. (2004) Множественные паразитарные инфекции и их связь с самооценкой заболеваемости в сельской местности Кот-д’Ивуара. Int J Epidemiol 33: 1092–1102.
4. 4. de Silva NR (2003) Влияние массовой химиотерапии на заболеваемость нематодами, передающимися через почву.Acta Trop 86: 197–214.
5. 5. Аллен Дж. Э., Майзелс Р. М. (2011) Разнообразие и диалог в иммунитете к гельминтам. Nat Rev Immunol 11: 375–388.
6. 6. Энтони Р. М., Рутицки Л. И., Урбан Дж. Ф. младший, Штадекер М. Дж., Гаузе В. К. (2007) Защитные иммунные механизмы при заражении гельминтами. Nat Rev Immunol 7: 975–987.
7. 7. Meeusen EN, Balic A, Bowles V (2005) Клетки, цитокины и другие молекулы, связанные с отторжением желудочно-кишечных паразитов нематод.Vet Immunol Immunopathol 108: 121–125.
8. 8. Balic A, Bowles VM, Meeusen EN (2000) Клеточные профили слизистой оболочки сычуга и лимфатического узла во время первичной инфекции Haemonchus contortus у овец. Vet Immunol Immunopathol 75: 109–120.
9. 9. Makepeace BL, Martin C, Turner JD, Specht S (2012) Гранулоциты при гельминтозной инфекции – кто решает? Curr Med Chem 19: 1567–1586.
10. 10. Шамри Р., Ксенакис Дж. Дж., Спенсер Л. А. (2011) Эозинофилы в врожденном иммунитете: развивающаяся история.Cell Tissue Res 343: 57–83.
11. 11. Драч Дж., Гсур А., Гамильтон Дж., Чжао С., Ангерлер Дж. И др. (1996) Участие Р-гликопротеина в трансмембранном транспорте интерлейкина-2 (ИЛ-2), ИЛ-4 и гамма-интерферона в нормальных Т-лимфоцитах человека. Кровь 88: 1747–1754.
12. 12. Raghu G, Park SW, Roninson IB, Mechetner EB (1996) Моноклональные антитела против P-гликопротеина, продукта гена MDR1, ингибируют высвобождение интерлейкина-2 из PHA-активированных лимфоцитов. Exp Hematol 24: 1258–1264.
13. 13. Randolph GJ, Beaulieu S, Pope M, Sugawara I, Hoffman L, et al. (1998) Физиологическая функция p-гликопротеина (MDR-1) во время миграции дендритных клеток из кожи через афферентные лимфатические сосуды. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 6924–6929.
14. 14. Франк М.Х., Дентон, доктор медицины, Александр С.И., Хури С.Дж., Сайег М.Х. и др. (2001) Специфическая блокада Р-гликопротеина MDR1 ингибирует активацию аллоиммунных Т-клеток человека in vitro. J Immunol 166: 2451–2459.
15. 15.Pawlik A, Baskiewicz-Masiuk M, Machalinski B, Kurzawski M, Gawronska-Szklarz B (2005) Вовлечение полиморфизмов генов множественной лекарственной устойчивости C3435T и G2677T в высвобождение цитокинов из мононуклеарных клеток периферической крови, обработанных метотрексатом и дексаметазатом. Eur J Pharmacol 528: 27–36.
16. 16. Пендсе С.С., Бехджати С., Шаттон Т., Идзава А., Сайег М.Х. и др. (2006) Р-гликопротеин действует как переключатель дифференцировки при созревании антигенпредставляющих клеток. Am J Transplant 6: 2884–2893.
17. 17. Ludescher C, Pall G, Irschick EU, Gastl G (1998) Дифференциальная активность P-гликопротеина в нормальных подгруппах лимфоцитов крови. Br J Haematol 101: 722–727.
18. 18. Pouliot JF, L’Heureux F, Liu Z, Prichard RK, Georges E (1997) Обращение к ивермектину связанной с P-гликопротеином множественной лекарственной устойчивости. Биохимическая фармакология. 53: 17–25.
19. 19. Nobmann S, Bauer B, Fricker G (2001) Экскреция ивермектина изолированными функционально неповрежденными эндотелиальными капиллярами головного мозга.Британский журнал фармакологии 132: 722–728.
20. 20. Kerboeuf D, Riou M, Neveu C, Issouf M (2010) Мембранный перенос лекарств у гельминтов. Противоинфекционный агент в медицинской химии 9: 113–129.
21. 21. Уоллер П.Дж., Чандраватани П. (2005) Haemonchus contortus: проблема паразитов № 1 из тропиков – Полярный круг. Проблемы и перспективы борьбы на основе эпидемиологии TropBiomed 22 (2) 131–137.
22. 22. Терефе Дж., Гризес С., Прево Ф, Бержео Дж. П., Дорчи П. и др.(2007) Предварительное воздействие на Haemonchus contortus L3 кровяных эозинофилов in vitro снижает их потенциал установления у овец. Vet Res 38: 647–654.
23. 23. Kerboeuf D, Chambrier P, Le Vern Y, Aycardi J (1999) Анализ проточной цитометрии механизмов транспорта лекарств у Haemonchus contortus, чувствительных или устойчивых к глистогонным средствам. Parasitol Res 85: 118–123.
24. 24. Kerboeuf D, Guégnard F (2011) Глистогонные средства являются субстратами и активаторами гликопротеина p нематоды.Антимикробные агенты Chemother 55: 2224–2232.
25. 25. Бук RN, Wolstenholme AJ, Neveu C, Dent JA (2010) Гены паразита нематод: что в названии? Тенденции Parasitol 26: 334–340.
26. 26. Burse A, Weingart H, Ullrich MS (2004) Индуцируемый фитоалексином насос для оттока нескольких лекарственных препаратов AcrAB способствует вирулентности возбудителя бактериального ожога, Erwinia amylovora. Mol Plant Microbe Interact 17: 43–54.
27. 27. Haslam IS, Jones K, Coleman T, Simmons NL (2008) Индукция экспрессии и функции P-гликопротеина в эпителиальных клетках кишечника человека (T84).Biochem Pharmacol 76: 850–861.
28. 28. Ardelli BF, Prichard RK (2013) Ингибирование P-гликопротеина повышает чувствительность Caenorhabditis elegans к ивермектину. Vet Parasitol 191: 264–275.
29. 29. De Graef J, Demeler J, Skuce P, Mitreva M, Von Samson-Himmelstjerna G и др. (2013) Анализ экспрессии генов переносчиков ABC в устойчивом изоляте онкофоры Cooperia после воздействия макроциклических лактонов in vivo и in vitro. Паразитология 140: 499–508.
30. 30. Gleich GJ, Adolphson CR (1986) Эозинофильный лейкоцит: структура и функция. Adv Immunol 39: 177–253.
31. 31. Hamann KJ, Barker RL, Ten RM, Gleich GJ (1991) Молекулярная биология белков гранул эозинофилов. Int Arch Allergy Appl Immunol 94: 202–209.
32. 32. Охнуки Л.Е., Вагнер Л.А., Георгелас А., Лёгеринг Д.А., Чекель Д.Л. и др. (2005) Дифференциальная экстракция белков гранул эозинофилов. J Immunol Methods 307: 54–61.
33. 33. Hamann KJ, Barker RL, Loegering DA, Gleich GJ (1987) Сравнительная токсичность очищенных белков гранул эозинофилов человека для новорожденных личинок Trichinella spiralis. J Parasitol 73: 523–529.
34. 34. Shapiro AB, Ling V (1997) Положительно кооперативные сайты для транспорта лекарств с помощью P-гликопротеина с различными лекарственными специфичностями. Eur J Biochem 250: 130–137.
35. 35. Sheps JA, Ralph S, Zhao Z, Baillie DL, Ling V (2004) Семейство генов-переносчиков ABC Caenorhabditis elegans имеет значение для эволюционной динамики множественной лекарственной устойчивости у эукариот.Геном Биол 5: R15.
36. 36. Сюй М., Моленто М., Блэкхолл В., Рибейро П., Бич Р. и др. (1998) Устойчивость к ивермектину у нематод может быть вызвана изменением гомолога Р-гликопротеина. Mol Biochem Parasitol 91: 327–335.
37. 37. Williamson SM, Wolstenholme AJ (2011) P-гликопротеины Haemonchus contortus: разработка ПЦР-анализов в реальном времени для исследований экспрессии генов. J Гельминтол: 1–7.
38. 38. Moser JM, Freitas T, Arasu P, Gibson G (2005) Профили экспрессии генов, связанные с переходом к паразитизму у личинок Ancylostoma caninum.Mol Biochem Parasitol 143: 39–48.
39. 39. Delannoy-Normand A, Cortet J, Cabaret J, Neveu C (2010) Набор генов, экспрессируемых во время перехода к паразитарному образу жизни у трихостронгилидной нематоды Haemonchus contortus, кодирует потенциально секретируемые белки, сохраненные в Teladorsagia Circiccta. Ветеринарный паразитол 174: 106–114.
40. 40. Dicker AJ, Nisbet AJ, Skuce PJ (2011) Изменения экспрессии гена в P-гликопротеине (Tci-pgp-9), предположительно связанные с устойчивостью к ивермектину у Teladorsagia circusiccta.Int J Parasitol 41: 935–942.
41. 41. Янссен И.Дж., Крукен Дж., Демелер Дж., Басиага М., Корнас С. и др. (2013) Генетические варианты и повышенная экспрессия P-гликопротеина-11 Parascaris equorum в популяциях со сниженной восприимчивостью к ивермектину. PLoS One 8: e61635.
42. 42. Broeks A, Janssen HW, Calafat J, Plasterk RH (1995) P-гликопротеин защищает Caenorhabditis elegans от естественных токсинов. EMBO J 14: 1858–1866.
43. 43. Tan MW, Ausubel FM (2000) Caenorhabditis elegans: модельный генетический хозяин для изучения патогенеза синегнойной палочки.Curr Opin Microbiol 3: 29–34.
44. 44. Slifman NR, Loegering DA, McKean DJ, Gleich GJ (1986) Рибонуклеазная активность, связанная с нейротоксином, полученным из эозинофилов человека, и катионным белком эозинофилов. J Immunol 137: 2913–2917.
45. 45. Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW, Laemmli UK (1977) Пептидное картирование с помощью ограниченного протеолиза в додецилсульфате натрия и анализ с помощью гель-электрофореза. J Biol Chem 252: 1102–1106.
46. 46. Россаниго CE, Грюнер Л. (1995).Требования к влажности и температуре фекалий для развития свободноживущих стадий желудочно-кишечных нематод овец, крупного рогатого скота и оленей. J. helminthol. 69: 357–362.
47. 47. Goutelle S, Maurin M, Rougier F, Barbaut X, Bourguignon L и др. (2008) Уравнение Хилла: обзор его возможностей в фармакологическом моделировании. Fundam Clin Pharmacol 22: 633–648.
48. 48. Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шаффер А.А., Чжан Дж., Чжан З. и др. (1997) Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска в базе данных белков.Nucleic Acids Res 25: 3389–3402.
49. 49. Edgar RC (2004) MUSCLE: метод множественного выравнивания последовательностей с уменьшенной временной и пространственной сложностью. BMC Bioinformatics 5: 113.
50. 50. Вернерссон Р., Педерсен А.Г. (2003) RevTrans: множественное выравнивание кодирующей ДНК из выровненных аминокислотных последовательностей. Nucleic Acids Res 31: 3537–3539.
51. 51. Посада Д. (2008) jModelTest: усреднение филогенетической модели. Mol Biol Evol 25: 1253–1256.
52. 52. Санчес Р., Серра Ф., Таррага Дж., Медина I, Карбонелл Дж. И др.(2011) Phylemon 2.0: набор веб-инструментов для молекулярной эволюции, филогенетики, филогеномики и проверки гипотез. Nucleic Acids Res 39: W470–474.
53. 53. Хусон Д.Х., Брайант Д. (2006) Применение филогенетических сетей в эволюционных исследованиях. Mol Biol Evol 23: 254–267.

Медно-резистентные бактерии снижают окислительный стресс и поглощение меди в растениях чечевицы: потенциал для бактериальной биоремедиации

Aebi H (1974) Каталазы.Методы Enzym Anal 2: 673–684

Статья Google Scholar

Ахтар С., Али Б. (2011) Оценка ризобактерий как нерзобиальных инокулянтов для маша. Aust J Crop Sci 5: 1723–1729

CAS Google Scholar

Александр Д.Б., Зуберер Д.А. (1991) Использование реактивов хромазурола S для оценки продукции сидерофоров ризосферными бактериями. Biol Fert Soils 12: 39–45

Статья CAS Google Scholar

Аллен Э., Гримшоу Х., Паркинсон Дж., Куэмби С., Робертс Дж. (1986) Химический анализ.Методы экологии растений. Blackwell Scientific, Лондон, стр. 285–344

Google Scholar

Арнон Д.И. (1949) Ферменты меди в изолированных хлоропластах. Полифенолоксидаза в Beta vulgaris . Plant Physiol 24: 1–15

Статья CAS Google Scholar

Arora N, Kang S, Maheshwari D (2001) Выделение штаммов Rhizobium meliloti, продуцирующих сидерофор, и их потенциал биологического контроля против Macrophomina phaseolina, вызывающей угольную гниль арахиса.Curr Sci 81: 673–677

Google Scholar

Bates L, Waldren R, Teare I (1973) Быстрое определение свободного пролина для исследований водного стресса. Растительная почва 39: 205–207

Статья CAS Google Scholar

Белимов А., Сафронова В., Демчинская С., Пилуцца Г., Буллитта С. (2005) Ризобактерии, способствующие росту устойчивых к кадмию растений, связанных с корнями индийской горчицы ( Brassica juncea L.Черн.). Soil Biol Biochem 37: 241–250

Статья CAS Google Scholar

Bergey DH, Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA (1994) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9-е изд., (Breed RS, Murray EGD и Smith NR, ред.) Williams and Wilkims, Baltimore

Брэдфорд М.М. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель.Analy biochem 72: 248-254

Bremner J, Mulvaney C (1982) Общий азот. Методы анализа почвы. Часть 2. Химические и микробиологические свойства 595–624

Брюинз М., Капил С., Оем Ф. (2000) Устойчивость микробов к металлам в окружающей среде. Ecot Environ Saf 45: 198–207

Статья CAS Google Scholar

Cambroll J, Mateos-Naranjo E, Redondo-Gomez S, Luque-Palomo M, Figueroa M (2011) Рост, репродуктивная и фотосинтетическая реакции на медь в желторогом маке, Glaucium flavum Crantz.Environ Exp Bot 71: 57–64

Статья CAS Google Scholar

Cohu CM, Pilon M (2007) Регулирование экспрессии супероксиддисмутазы доступностью меди. Physiol Plant 129: 747–755

Статья CAS Google Scholar

Demiral T, Türkan İ (2005) Сравнительное перекисное окисление липидов, системы антиоксидантной защиты и содержание пролина в корнях двух сортов риса, различающихся солеустойчивостью.Environ Exp Bot 53: 247–257

Статья CAS Google Scholar

Демиревская-Кепова К., Симова-Стоилова Л., Стоянова З., Хёльцер Р., Феллер У. (2004) Биохимические изменения в растении ячменя после избыточного предложения меди и марганца. Environ Exp Bot 52: 253–266

Статья CAS Google Scholar

Dhindsa SR, Matowe W (1981) Засухоустойчивость двух мхов: коррелирует с ферментативной защитой от перекисного окисления липидов.J Exp Bot 32: 79–91

Статья CAS Google Scholar

Duganath N, Reddy KN, Nagasowjanya J, Sridhar S, Jayaveera KN (2010) Оценка фитохимической и антиоксидантной активности in vitro Filicium decipiens. Ann Biol Res 1: 134–140

Duponnois R, Kisa M, Assigbetse K, Prin Y, Thioulouse J, Issartel M, Moulin P, Lepage M (2006) Флуоресцентные псевдомонады, встречающиеся в структурах холмов Macrotermes subhyalinus, снижают токсичность Cd и улучшить его накопление в растениях сорго.Sci Total Environ 370: 391–400

Статья CAS Google Scholar

Fiske C, Subbarow Y (1925) Колориметрическое определение фосфора. J Biol Chem 66: 375–400

CAS Google Scholar

Gamalero E, Berta G, Massa N, Glick BR, Lingua G (2008) Синергетические взаимодействия между бактерией, продуцирующей дезаминазу ACC Pseudomonas putida UW4 и грибком AM Gigaspora rosea , положительно влияют на рост растений огурца.FEMS Microbiol Ecol 64: 459–467

Артикул CAS Google Scholar

Gao S, Yan R, Cao M, Yang W, Wang S, Chen F (2008) Влияние меди на рост, антиоксидантные ферменты и активность фенилаланин-аммиак-лиазы у проростков Jatropha curcas L. Plant Soil Environ 54 (3): 117–122

CAS Google Scholar

Гиббонс С., Ферис К., МакГирл М., Моралес С., Хиннинен А., Рэмси П., Ганнон Дж. (2011) Использование микрокалориметрии для определения затрат и преимуществ штамма Pseudomonas putida KT2440, несущего гены оттока кадмия.Appl Environ Microbiol 77 (1): 108–113

Статья CAS Google Scholar

Gill S, Tuteja N (2010) Активные формы кислорода и антиоксидантные механизмы в устойчивости к абиотическому стрессу у сельскохозяйственных культур. Plant Physiol Biochem 48: 909–930

Статья CAS Google Scholar

Glick BR ​​(2005) Модуляция уровней этилена в растениях бактериальным ферментом ACC дезаминазой.FEMS Microbiol Lett 251: 1–7

Статья CAS Google Scholar

Glickman E, Dessaux Y (1995) Критическое исследование специфичности реактива Сальковского в отношении индольных соединений, продуцируемых фитопатогенными бактериями. Appl Environ Microbiol 61: 793–796

Google Scholar

González-Mendoza D, Espadas y Gil F, Escoboza-Garcia F, Santamaría JM, Zapata-Perez O (2013) Медный стресс при фотосинтезе черной мангле ( Avicennia germinans ).An Acad Bras Cienc 85 (2): 665–670

Статья Google Scholar

Gratão PL, Polle A, Lea PJ, Azevedo RA (2005) Немного упрощая жизнь растений, подвергающихся стрессу от тяжелых металлов. Func Plant Biol 32: 481–494

Статья CAS Google Scholar

Gururani M, Upadhyaya C, Baskar V, Venkatesh J, Nookaraju A, Park S (2012) Ризобактерии, способствующие росту растений, повышают устойчивость к абиотическому стрессу у solanum tuberosum, вызывая изменения в экспрессии ферментов, поглощающих ros, и улучшая фотосинтез представление.J Регламент роста растений 32: 245–258

Статья CAS Google Scholar

Gururani M, Upadhyaya C, Baskar V, Venkatesh J, Nookaraju A, Park S (2013) Ризобактерии, способствующие росту растений, повышают устойчивость к абиотическому стрессу у solanum tuberosum, вызывая изменения в экспрессии ферментов, поглощающих ros, и улучшая фотосинтез представление. J Регламент роста растений 32 (2): 245–258

Статья CAS Google Scholar

Холливелл Б., Гаттеридж Дж. (1984) Кислородная токсичность, кислородный радикал, переходные металлы и болезни.Biochem Int J 219: 1–14

Статья CAS Google Scholar

Harley (2014) Справочник лабораторных ресурсов лабораторные занятия по микробиологии. 9-е издание. McGraw-Hill Education

Huaidong H, Zhihong Y, Danjing Y, Junlan Y, Xiao L, Zhong T, Yuan M, Cai X, Fang Z, Jing Y (2012) Характеристика эндофитного Rahnella sp . JN6 из Polygonum pubescens и его потенциал в стимулировании роста и поглощения Cd, Pb, Zn Brassica napus .Chemosphere 90: 1960–1965

Google Scholar

Ислам Ф., Ясмин Т., Али К., Али С., Ариф М.С., Хусейн С., Ризви Х. (2014a) Влияние синегнойной палочки как PGPR на толерантность к окислительному стрессу у пшеницы в условиях Zn-стресса. Ecotox Environ Safe 104: 285–293

Артикул CAS Google Scholar

Islam F, Yasmeen T, Riaz M, Arif MS, Ali S, Raza SH (2014b) Proteus mirabilis снижает токсичность цинка, предотвращая окислительный стресс у растений кукурузы (Zea mays).Ecotox Environ Safe 110: 143–152

Артикул CAS Google Scholar

Джексон М. (1967) Химический анализ почвы. Prentice Hall of India Ltd, Нью-Дели

Google Scholar

Джалили Ф., Хавази К., Пазира Э., Неджати А., Рахмани Х., Садагиани Х., Мирансари М. (2009) Выделение и характеристика флуоресцентных псевдомонад, продуцирующих АЦК дезаминазу, для снижения солевого стресса на каноле ( Brassica napus .) рост. J Plant Physiol 166: 667–674

Статья CAS Google Scholar

Janas K, Ska-Tomaszewska J, Rybaczek D, Maszewski J, Posmyk M, Amarowicz R, Kosińska A (2010) Влияние ионов меди на рост, перекисное окисление липидов, накопление и локализацию фенольных соединений в чечевице (линза culinaris Medic.) саженцы. J Plant Physiol 167: 270–276

Статья CAS Google Scholar

Kafel A, Nadgórska-Socha A, Gospodarek J, Babczyńska A, Skowronek M, Kandziora M, Rozpędek K (2010) Влияние заражения Aphis fabae на антиоксидантный ответ и содержание тяжелых металлов в полевых условиях. coronarius растений.Sci Total Environ 408: 1111–1119

Статья CAS Google Scholar

Кардас М., Гозен А.Г., Северкан Ф. (2014) ИК-Фурье спектроскопия дает намек на широко распространенные молекулярные изменения у акклиматизированных к кобальту пресноводных бактерий. Aquat Toxicol 155: 15–23

Статья CAS Google Scholar

Ke W, Xiong Z, Xie M, Luo Q (2007) Накопление, субклеточная локализация и экофизиологические реакции на медный стресс у двух Daucus carota L.населения. Растительная почва 292: 291–304

Артикул CAS Google Scholar

Хан Н., Таффин М., Стаффорд В., Кэри К., Лакап Д.К., Пойнтинг С.Б., Коуэн Д. (2011) Гиполитические микробные сообщества кварцевых пород из долины Майерс, Сухие долины Мак-Мердо, Антарктида. Polar Biol 34: 1657–1668

Kovacik J, Backor M (2008) Состав фенольных соединений и физиологические характеристики Matricaria chamomilla , выращенной в избытке меди.Environ Exp Bot 62: 145–152

Статья CAS Google Scholar

Кумар П., Душенков В., Девиз Н., Раскин И. (1995) Фитоэкстракция: использование растений для удаления тяжелых металлов. Environ Sci Technol 29: 1232–1238

Статья CAS Google Scholar

Lamb DT, Ming H, Megharaj M, Naidu R (2009) Распределение тяжелых металлов (Cu, Zn, Cd и Pb) и биодоступность в незагрязненных и долгосрочно загрязненных почвах.J Harzad Mater 171: 1150–1158

Статья CAS Google Scholar

Li J, McConkey BJ, Cheng Z, Guo S, Glick BR ​​(2013) Идентификация белков, способствующих росту растений, способствующих развитию бактерий, в корнях огурца в условиях гипоксического стресса с использованием протеомного подхода. J Proteom 84: 119–131

Статья CAS Google Scholar

Lima A, Corticeiro S, Figueira E (2006) Опосредованная глутатионом секвестрация кадмия в Rhizobium leguminosarum .Enzy Microb Technol 39: 763–769

Статья CAS Google Scholar

Лин Дж., Цзян В., Лю Д. (2003) Накопление меди в корнях, гипокотилях, семядолях и листьях подсолнечника ( Helianthus annuus L.). Biores Technol 86: 151–159

Статья CAS Google Scholar

Лю Т., Шен С., Ван И, Хуанг С., Ши Дж. (2014) Новые взгляды на регуляцию протеома и полисахарида в клеточной стенке Elsholtzia splendens в ответ на стрессовое воздействие на медь.Plos One 9 (10): 1–13

Google Scholar

млн лет назад, Прасад М., Раджкумар М., Фрейтас Х. (2011) Ризобактерии и эндофиты, способствующие росту растений, ускоряют фиторемедиацию металлоносных почв. Biotechnol Adv 29: 248–258

Статья CAS Google Scholar

Ma Y, Rajkumar M, Luo Y, Freitas H (2013) Фитоэкстракция почв, загрязненных тяжелыми металлами, с использованием Sedum plumbizincicola, инокулированного металлом, мобилизующим Phyllobacterium myrsinacearum RC6b.Chemosphere, 93 (7): 1386–1392

Martínez-Alcalá I, Clemente R, Bernal M (2009) Доступность металлов и химические свойства в ризосфере Lupinus albus L., растущего в высокометаллических известняках. пачкаться. Water Air Soil Poll 201: 283–293

Статья CAS Google Scholar

Маяк С., Тирош Т., Глик Б.Р. (2004) Бактерии, способствующие росту растений, придают растениям томатов устойчивость к солевому стрессу.Plant Physiol Biochem 42: 565–572

Статья CAS Google Scholar

McLellan T, Marr ES, Wondrack LM, Subashi TA, Aeed PA, Han S, Xu Z, Wang IK, Maguire BA (2009) Систематическое исследование очистки 50S рибосомной субъединицы, обеспечивающее надежную кристаллизацию. Acta Crystallo 65: 1270–1282

CAS Google Scholar

Mishra S, Srivastava S, Tripathi R, Govindarajan R, Kuriakose S, Arasad M (2006) Синтез фитохелатина и реакция антиоксидантов во время кадмиевого стресса в Bacopa monnieri L.Plant Physiol Biochem 44: 25–37

Статья CAS Google Scholar

Møller I, Jensen P, Hansson A (2007) Окислительные модификации клеточных компонентов у растений. Анну Рев Завод Биол 58: 459–481

Артикул CAS Google Scholar

Nakano Y, Asada K (1981) Перекись водорода улавливается аскорбатспецифической пероксидазой в хлоропластах шпината.Физиология растительных клеток 22: 867–880

CAS Google Scholar

Nautiyal C, Srivastava S, Chauhan P (2008) Колонизация ризосферы: молекулярные детерминанты с точки зрения сосуществования растений и микробов. В: Nautiyal CS, Dion P (eds) Молекулярные механизмы растений, сосуществование микробов, серия почвенной биологии. Springer, Berlin, pp. 99–124

Глава Google Scholar

Nies D (2003) Опосредованная оттоком устойчивость к тяжелым металлам у прокариот.FEMS Microbiol Rev 27: 313–339

Статья CAS Google Scholar

Opdenakker K, Remans T, Keunen E, Vangronsveld J, Cuypers A (2012) Воздействие на Arabidopsis thaliana избытка Cd или Cu приводит к опосредованным окислительным стрессом изменениям в уровнях транскрипта MAPKinase. Environ Exp Bot 83: 53–61

Статья CAS Google Scholar

Овес М., Хан М., Заиди А. (2013) Новый штамм Pseudomonas aeruginosa OSG41, снижающий содержание хрома и способствующий росту растений, усиливает рост нута в почвах с добавлением хрома.Eur J Soil Biol 56: 72–83

Статья CAS Google Scholar

Peng H, Yang X, Yang M, Tian S (2006) Ответы антиоксидантной ферментной системы на токсичность меди и детоксикацию меди в листьях Elsholtzia splendens . J Plant Nutr 29: 1619–1635

Артикул CAS Google Scholar

Penrose DM, Glick BR ​​(2003) Методы выделения и характеристики содержащих АСС дезаминазу ризобактерий, способствующих росту растений.Physiol Plant 118: 10–15

Статья CAS Google Scholar

Pinto AP, Alves AS, Candeias AJ, Cardoso AI, de Varennes A, Martins LL, Mourato MP, Gonçalves ML, Mota AM (2009) Накопление кадмия и антиоксидантная защита в Brassica juncea L. Czern, Nicotiana tobacum L. и Solanum nigrum L. Int J Environ 89: 661–676

CAS Google Scholar

Rajkumar M, Prasad M, Freitas H, Ae N (2009) Биотехнологические применения серпентиновых почвенных бактерий для фиторемедиации следов металлов.Crit Rev Biotechnol 29: 120–130

Статья CAS Google Scholar

Rajkumar M, Prasad M, Sandhya S, Freitas H (2013) Взаимодействие растений, металлов и микробов, вызванное изменением климата. Environ Int 53: 74–86

Статья CAS Google Scholar

Рао Л., Перес Д., Уайт Е. (1996) Протеолиз ламина облегчает ядерные события во время апоптоза. J Cell Biol 135: 1441–1455

Статья CAS Google Scholar

Rascio N, Navari-Izzo F (2011) Гипераккумулирующие растения тяжелых металлов: как и почему они это делают? И что делает их такими интересными? Plant Sci 180: 169–181

Статья CAS Google Scholar

Shanker AK, Cervantes C, Loza-Tavera H, Avudainayagam S (2005) Хромовая токсичность для растений.Environ Int 31: 739–753

Статья CAS Google Scholar

Siripornadulsil S, Siripornadulsil W (2013) Устойчивые к кадмию бактерии снижают поглощение кадмия рисом: потенциал для микробной биоремедиации. Ecotoxicol Environ Safe 94: 94–103

Статья CAS Google Scholar

Судиша Дж., Ниранджана С.Р., Умеша С., Пракаш Х.С., Шетти Х.С. (2006) Передача семенной инфекции дыни Didymella bryoniae и влияние обработки семян на заболеваемость и урожайность плодов.Biol Cont 37: 196–205

Статья Google Scholar

Так Х.И., Ахмад, Бабалола О.О. (2013) Достижения в применении стимулирующих рост растений ризобактерий в фиторемедиации тяжелых металлов. Rev Environ Contamin Toxicol In Whitacre, D.M (Ed). IX, 147 с. 21 илл., 3 илл. Vol. 223

Великова В., Йорданов И., Едрева А. (2000) Окислительный стресс и некоторые антиоксидантные системы у растений фасоли, обработанных кислотными дождями: защитная роль экзогенных полиаминов.Plant Sci 151: 59–66

Статья CAS Google Scholar

Вивас А., Биро Б., Руис-Лозано Дж., Бареа Дж., Азкон Р. (2006) Два бактериальных штамма, выделенные из загрязненной цинком почвы, усиливают рост растений и эффективность микоризирования при токсичности цинка. Chemosphere 62: 1523–1533

Статья CAS Google Scholar

Wang H, Xu R, You L, Zhong G (2013) Характеристика Cu-толерантных бактерий и определение их роли в стимулировании роста, накоплении Cu и снижении токсичности Cu в Triticum aestivum L.Ecotoxicol Environ security 94: 1-7

Wang L, Yang X, Ren Z, Hu X, Wang X (2014) Снижение подавления фотосинтеза у томатов, подвергшихся стрессу медью, за счет восстановления баланса содержания ионов экзогенным оксидом азота. Turk J Bot 38: 1312–1317

Google Scholar

Вани П., Хан М., Заиди А. (2008) Влияние устойчивых к металлам растений Rhizobium, способствующих росту растений, на производительность гороха, выращенного в почве с добавками металлов. Arch Environ Contam Toxicol Appl Pharmacol 55: 33–42

Статья CAS Google Scholar

Ян Дж., Клёппер Дж., Рю С. (2009) Ризосферные бактерии помогают растениям переносить абиотический стресс.Trends Plant Sci 14: 1–4

Статья CAS Google Scholar

Yilmaz EI (2003) Устойчивость к металлам и биосорбционная способность штамма Bacillus circans EB1. Res Microbiol 154: 409–415

Статья CAS Google Scholar

Заиди С., Усмани С., Сингх Б., Мусаррат Дж. (2006) Значение штамма Bacillus subtilis SJ-101 в качестве биоинокулянта для одновременного стимулирования роста растений и накопления никеля в Brassica juncea .Chemosphere 64: 991–997

Статья CAS Google Scholar

Zhang LL, He XJ, Chen M, An RD, An XL, Li J (2014) Ответы азотного метаболизма на медный стресс в корнях Luffa cylindrica . J Soil Sci Plant Nutr 14 (3): 616–624

Google Scholar

Оценка свойств эндофитных грибов пшеницы по стимулированию роста растений и устойчивости к абиотическим стрессам

Целью настоящей работы было выделить и охарактеризовать эндофитные сообщества грибов, ассоциированных со здоровой пшеницей ( Triticum aestivum L.) растения, собранные в Северном Китае. Сегрегированные эндофиты были проверены на их свойства PGP, абиотические стрессы (тяжелые металлы, засоление, засуха и температура) и чувствительность к антибиотикам. В общей сложности 16 эндофитных грибов были выделены с использованием культурально-зависимого подхода из различных частей тканей растений пшеницы. На основе секвенирования гена внутренней транскрибируемой спейсерной (ITS) рДНК 15 из 16 изолятов были отобраны для дальнейшего анализа. В современном исследовании ряд протестированных эндофитов показал достаточно хорошую дезаминазу 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (ACCD) (0.03 ± 0,011 до 1,43 ± 0,01 µ моль -КБ мг ⁻¹ белок час ⁻¹ ), индолуксусная кислота (IAA) (от 1,125 ± 0,04 до 36,12 ± 0,004 µ г мл ⁻¹ ) и индекс солюбилизации фосфата (PSI) (от 2,08 ± 0,03 до 5,16 ± 0,36) активности. Более 30% изолятов дали положительный результат для тестов на сидерофор и аммиак, тогда как все изоляты показали активность каталазы, но только 2 (582PDA1 и 582PDA11) продуцировали цианистый водород. Штаммы Trichoderma показали высокую устойчивость к соли, тяжелым металлам и засухе, а также проявили устойчивость ко всем протестированным антибиотикам.Штамм 582PDA4 оказался наиболее устойчивым к температуре (55 ° C) изолятом. Результаты этого исследования показали, что микробные эндофиты, выделенные из растений пшеницы, обладающие важной функцией для улучшения роста растений, могут быть использованы в качестве биоудобрений или биоагентов для создания устойчивой системы растениеводства.

1. Введение

В мировом масштабе пшеница считается одной из основных зерновых культур. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО), к 2020 году его спрос вырастет до 746 миллионов тонн [1].Этот рост производства желает достичь, несмотря на перспективные проблемы современного сельского хозяйства, а также ограничения в применении пестицидов [2], озабоченность по поводу доступности и воздействия на окружающую среду удобрений [3], а также потенциальные вредные воздействия изменение климата на урожайность пшеницы и спектр болезней [4]. Выращивание высокоурожайных сортов сельскохозяйственных культур, строгая система возделывания сельскохозяйственных культур и неравномерное использование химических удобрений являются основными факторами, которые вызывают несоответствие питательных веществ в почве, урожайность приземистых растений, сокращение плодородия почвы и низкое качество пищи.Следовательно, разработка устойчивой тактики смягчения неблагоприятного воздействия интенсивных практик, применяемых крестьянами, становится серьезной проблемой [5]. Вопрос об устойчивости первичного производства стоит в большей степени в отношении пшеницы. Ученые-аграрии по всей планете круглосуточно работают над поиском новых вариантов повышения продуктивности и устойчивости сельского хозяйства, но это, несомненно, представляет собой огромную проблему для них. Использование полезных микробных симбионтов растений с целью повышения продуктивности сельского хозяйства является одним из наиболее важных методов устойчивого развития [6].Относительно уменьшения вредного воздействия традиционных методов ведения сельского хозяйства; инновационные схемы, основанные на микробной инокуляции, в настоящее время привлекают все большее внимание. Растения и микроорганизмы образуют симбиотический альянс с компенсацией для обеих когорт. Кроме того, симбиоз растений и микробов влияет на рост и здоровье растений, что эффективно улучшает сельскохозяйственные характеристики и улучшает качество почвы и круговорот питательных веществ [7–9].

Обычно обнаруживается, что ряд микробов приобретает питательные вещества для продолжения своего существования посредством взаимодействия с растениями, которое может быть беспристрастным, вредным (паразитизм) или полезным (мутуализм или симбиоз) для хозяина [10, 11].Микробы, обитающие в тканях растений, лишенные причинения существенного ущерба или получения вознаграждения, кроме обеспечения их проживания, считаются «эндофитами». Природа благословила растения разнообразной популяцией эндофитных микроорганизмов, включая полезные бактерии, грибы и актиномицеты. Они проводят весь или часть своего жизненного цикла, живя внутри растения, не вызывая визуальных симптомов болезни [12]. Организация таких полезных микробов, связанных с растениями, постоянно привлекает внимание научного сообщества и промышленности из-за их способности улучшать качество и рост растений [13, 14].

Виды грибов, которые обитают в тканях живых растений и не вызывают симптомов болезни у своего хозяина, известны как грибковые эндофиты [15]. Они являются основными представителями эндофитной популяции, которые полностью обитают в тканях растений и могут быть связаны с корнями, стеблями и / или листьями. На каждом растении во Вселенной есть хотя бы один или несколько эндофитных грибов [16, 17]. В последние годы они широко изучались в различных географических и климатических регионах, и было обнаружено, что они повсеместно распространены в тканях растений и богаты видовым разнообразием [18–21].Исследователи обнаружили их бесценную роль в обеспечении питательными веществами, акклиматизации окружающей среды, защите от биотических и абиотических стрессов, стимулировании роста и повышении биоразнообразия сообществ растений-хозяев [22–26]. Они также могут действовать как защитники от хищников [27] и противников микробных патогенов [28]. Предыдущие сообщения показали, что многие виды трав показали улучшение вегетативного роста в присутствии их грибных симбионтов, которые, как считается, в первую очередь улучшают приспособленность растений [29, 30].Тем не менее, поздние исследования показали, что стимулирование роста растений может быть связано с выбросом вторичных метаболитов, способствующих росту растений (гиббереллинов, ауксинов, цитокининов), эндофитными грибами в ризосфере [29]. Обзор литературы дополнительно продемонстрировал, что грибы, способствующие росту растений (PGPF), поддерживают рост растений за счет генерации ряда важных ферментов, таких как ACCD, уреаза, каталаза и т. Д., Солюбилизации фосфата, образования сидерофоров и ИУК и антагонизма по отношению к фитопатогенам и играют решающую роль. в росте растений [30–33].Ранее сообщалось, что эндофиты PGP, устойчивые к антибиотикам, могут быть хорошим источником средств биоконтроля [34, 35].

Хотя раньше ряд исследований проводился на эндофитных грибах пшеницы [36–38], но до сих пор не было найдено сообщений об их свойствах PGP, а также об их структуре устойчивости к абиотическим стрессам и антибиотикам. Поэтому мы разработали это исследование для оценки свойств, способствующих росту растений, а также свойств устойчивости к абиотическому стрессу и устойчивости к антибиотикам эндофитных грибов пшеницы, которые в обозримом будущем станут потенциальным источником биоудобрений в устойчивой системе выращивания органических культур.

2. Материалы и методы

2.1. Отбор образцов растений и выделение эндофитных грибов

Образцы растений пшеницы были собраны в провинции Хэнань (район Цзиньшуй – 34 ° 46 ′ 22,59 ^″ N, 113 ° 43 ′ 9,62 ^″ E, высота 100 метров), Шаньдун (Dezhou-37 ° 26′N, 116 ° 16′E, высота 50 метров) и Хэбэй (округ Анксин – 38 ° 55′N 115 ° 56′E, высота 80 метров) северного Китая, 20 апреля 2017 г. и обработано в лаборатории. в течение 24 ч. Их тщательно проверяли на наличие каких-либо симптомов заболевания или поверхностных повреждений и тщательно промывали в проточной водопроводной воде, чтобы удалить поверхностную грязь с частей растений.После промывки образцы разделяли на листья, стебли и корни. Эндофитные грибы выделяли из здоровых и бессимптомных корней, листьев и стеблей экспериментальных образцов растений на основании опубликованных протоколов [38, 39]. Компетентность стратегии поверхностной стерилизации подтверждена методом гравировки [14]. Стерилизованные части растений асептически помещали на среду картофельного агара с декстрозой (PDA) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-7 дней. Грибки, появившиеся на краях засеянных частей, выделяли и идентифицировали, и чистые культуры поддерживали на скошенных картофельных агарах с декстрозой.

2.2. Молекулярная идентификация и филогенетический анализ изолированного эндофитного грибка

Молекулярная идентификация была проведена на основе грибкового внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рДНК объединяет амплификацию и анализ последовательности. Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора для ДНК Tiangen Fungus (Biotech, Beijing, Co., Ltd.) в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию ITS-области грибов проводили с использованием ITS1 и ITS4 в качестве прямого и обратного праймеров соответственно [40].Продукты ПЦР проверяли на ожидаемый размер на 1% агарозном геле и секвенировали поставщиком услуг по секвенированию Sangon (Sangon Inc., Пекин, Китай). Нуклеотидные последовательности сравнивали с базами данных нуклеотидов с помощью программы NCBI BLASTn для идентификации ближайших известных таксонов. Ген ITS-рДНК вместе с их ближайшими гомологичными последовательностями были выровнены с использованием программы множественного выравнивания последовательностей CLUSTALW algorithm, реализованной в программе MEGA 7 с параметрами по умолчанию [41]. Филогенетическое дерево построено методом объединения соседей с помощью программы MEGA7.В качестве статистической поддержки для узлов филогенетического дерева использовались репликации начальной загрузки (1000). На основании отчета молекулярной идентификации для дальнейшего исследования было выбрано 15 грибов. Чтобы сделать снимки грибов пшеницы с помощью сканирующего электронного микроскопа, они были обезвожены в этаноловом растворе с изменяемой установкой, высушены до критической точки (CO ₂ ), покрыты тонким слоем золота и исследованы с помощью сканирующего электронного микроскопа (Hitachi S -3400Н). Некоторые СЭМ-изображения грибов пшеницы приведены на рисунке 1.

2.3. Оценка некоторых важных свойств PGP

Все изоляты были проверены на широкий спектр жизненно важных свойств PGP. Потенциал ACCD грибковых изолятов проверяли как качественными, так и количественными способами, используя среду с минимальными солями Dworkin and Foster (DF) [42] с добавлением 3 мМ ACC в качестве единственного источника азота [43–45]. Конечная активность ACCD выражалась в наномоль-кетобутират (-KB) мг ^-1 белка ч ^-1 . Способность продуцировать ИУК была проверена с использованием реактива Сальковски, как описано Acuña et al.[46]. Способность выбранных эндофитов к продуцированию сидерофоров изучали с помощью универсального метода чашек с агаром Chrome Azurol S (CAS) [47]. Свойство всех грибковых изолятов солюбилизировать фосфат было проверено добавлением бромфенолового синего (0,01-0,001 мг литр ^-1 ) в агаризованную среду Пиковской [48]. Способность продуцировать аммиак (NH ₃ ), уреазу и каталазу изучали, как в ранее описанных методах [49]. Свойство цианогенеза (образование цианистого водорода-HCN) грибковых изолятов проверяли с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной пикриновой кислотой, содержащей пластины PDA [50].

2.4. Устойчивость к абиотическому стрессу

Ряд тестов на устойчивость к абиотическому стрессу (соль, тяжелые металлы, засуха и температура) был проведен на разных уровнях со свежими культурами изолированных эндофитных грибов. Тест-культуры на внутреннюю соленость проверяли, наблюдая за их ростом на среде PDA, дополненной различной концентрацией (2,5-10% мас. / Об.) Хлорида натрия (NaCl) при 28 ° C в течение 5 дней. Стресс толерантности к тяжелым металлам оценивали путем выращивания грибов на свежеприготовленных пластинах PDA с добавлением различных растворимых солей тяжелых металлов (никель-Ni, свинец-Pb, медь-Cu, кадмий-Cd и кобальт-Co) в различных концентрациях от От 50 до 300 µ г мл ⁻¹ при 28 ° C в течение 5 дней [43].Устойчивость к стрессу засухи оценивали Leo Daniel et al. метод [50] с 10-40% полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000 Да) исправленных пластин КПК. Температурную устойчивость оценивали инкубацией грибов при различных температурных режимах (а именно, 5, 15, 25, 35, 45 и 55 ° C) в течение 5 дней [51].

2.5. Тест на чувствительность к антибиотикам

Устойчивость к антибиотикам рассматривается как один из параметров для поиска эффективных средств биологической борьбы [52], и предыдущая литература показала, что это свойство может в определенной степени инициировать рост растений [34, 35, 53].Здесь мы оценили чувствительность выделенных штаммов к антибиотикам против нистатина (10 µ г), кетоконазола (50 µ г) и итраконазола (30 µ г), пропитанных дисками (диаметром 6 мм) от Kirby Bauer disk. -диффузионный анализ. В зависимости от зоны ингибирования организмы были сгруппированы как устойчивые или чувствительные в соответствии с опубликованной литературой [54, 55]. Каждый эксперимент повторяли трижды для каждого гриба.

2.6. Статистический анализ

Microsoft Excel 2013 использовался для проведения статистического анализа.Филогенетическое дерево было построено с помощью программы MEGA7. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Были оценены и применены средние значения и стандартные отклонения.

3. Результаты

В современном исследовании мы проанализировали ряд признаков PGP выделенных грибов, которые могут играть решающую роль в росте растений как прямым, так и косвенным образом (все результаты приведены в таблице 2). При скрининге ACCD 11 грибов прошли качественный тест и были выбраны для количественного анализа, среди них 9 штаммов эндофитных грибов показали активность фермента от незначительной до умеренной (0.03 ± 0,011 до 1,43 ± 0,01 µ моль -КБ мг ^-1 белка час ^-1 ). Девять грибов дали положительный ответ на ИУК, при этом изолят 582PDA4 был основным продуцентом (21,125 ± 0,009 мкМ мкл ^-1 ), что доказало, что они являются стимуляторами роста растений. Способность продуцировать сидерофор была обнаружена только для 3 (581PDA1, 582PDA6 и 582PDA7) изолятов в различной степени, о чем свидетельствует образование оранжевого ореола вокруг колонии в чашке CAS. Среди 15 грибов 11 штаммов были помечены как солюбилизаторы фосфата с очевидными зонами гало вокруг их колоний на агаризованной среде Пиковской по шкале переменного индекса солюбилизации фосфата (PSI) (2.08 ± 0,03 до 5,16 ± 0,36). Тест на HCN был положительным только для 2 изолятов, тогда как NH ₃ продуцировали около 34% протестированных микробов. Для тестов на уреазу и каталазу мы обнаружили, что ни один из изолятов не обладает ферментом уреазой, но все они проявляли активность каталазы.

Способность изолятов к абиотическому стрессу была проверена путем изучения их роста при различных уровнях содержания соли, тяжелых металлов, засухи и температуры. Наибольшую толерантность к росту продемонстрировали 582PDA6 и 582PDA7 в условиях солевого стресса, тогда как почти все грибы были способны расти при 5% соли (за исключением 582PDA5 и 582PDA11), что доказало их способность поддерживать сельхозугодья, подверженные засолению (Таблица 3).Опять же, эндофиты грибов продемонстрировали пятнистый уровень устойчивости к испытанным тяжелым металлам. Было обнаружено, что штаммы 582PDA6 и 582PDA7 устойчивы ко всем протестированным концентрациям тяжелых металлов, в то время как другие изоляты были устойчивы к различным концентрациям металлов на разных уровнях (Таблица 4). Это исследование показало, что все отобранные эндофитные грибы пшеницы способны противостоять засухе в различных диапазонах. Обильное спороношение наблюдалось при концентрации ПЭГ 10-20% для всех штаммов, тогда как при концентрации ПЭГ 35% споруляция полностью устранялась для всех штаммов.Наибольшую засухоустойчивость наблюдал штамм 582PDA6 (таблица 5). Здесь мы также изучили влияние различных температурных диапазонов на тестируемые изоляты грибов и обнаружили, что оптимальная температура роста максимальных штаммов составляет 25 ° C. Наименьшая и максимальная температура, переносимая изолятами, составила 5 ° C (581PDA1) и 55 ° C (582PDA4), соответственно (Таблица 6). Таким образом, мы можем сказать, что эти микробы в определенной степени помогают переносить температурный стресс.

Структура устойчивости к антибиотикам всех экспериментальных штаммов варьировала от антибиотика к антибиотику.Было обнаружено, что четыре штамма грибов (581PDA3, 581PDA4, 582PDA6 и 582PDA7) устойчивы ко всем трем протестированным антибиотикам, тогда как три грибка, 581PDA2, 581PDA5 и 581PDA7, были чувствительны ко всем трем антибиотикам (таблица 7).

4. Обсуждение

Необходимость увеличения производства продуктов питания и истощение генетических ресурсов пшеницы повысили интерес к альтернативным подходам к улучшению пшеницы, включая использование эндофитов. Предыдущие исследования эндофитов пшеницы показали, что все сорта пшеницы содержат относительно широкий спектр эндофитов, преимущественно грибов [56, 57].Вдохновленные предыдущими исследованиями, текущее исследование было разработано для выделения и характеристики эндофитных грибов, связанных с пшеницей, а также для проверки их способности поддерживать рост растений с помощью полифазного подхода. Шестнадцать эндофитных грибов были выделены из листьев, стеблей и корней различных образцов растений пшеницы и идентифицированы с использованием их последовательностей ITS-рДНК, и на основе их результатов секвенирования мы выбрали 15 изолятов для нашей работы (Таблица 1). Последовательности близких родственников были получены из Gen Bank для реконструкции филогенетического дерева (рис. 2).После идентификации все изоляты были проверены на PGP, устойчивость к стрессу и чувствительность к антибиотикам. Большинство выделенных грибов демонстрируют ряд соответствующих параметров, способствующих росту, включая различную ферментативную активность (ACCD, уреаза и каталаза), солюбилизацию неорганического фосфата; Продукция ИУК, HCN, сидерофоров и NH ₃ (таблица 2). Они также показали переменный уровень устойчивости к различным абиотическим стрессам и протестировали антибиотики.

.17907 9697927 9697 Штамм Гомологичный микроорганизм (% идентичности) Номер доступа 581PDA1 Aspergillus niger 100 KY702576.1 581PDA2 900xy11porusarium 9279 581PDA2 900xy11porum90 9279 9279 9279 Penicillium aurantiogriseum 100 GU566234.1 581PDA4 Fusarium incarnatum 100 KU204760.1 581PDA5 Alternaria alternata 100 KY026592.1 581PDA7 Alternaria tenuissima 100 2 2 2 2 2 100 MF372580.1 582PDA4 Talaromyces funiculosus 100 AB8 582PDA5 Aspergillus flavus 100 MF319893.1 582PDA6 Trichoderma aureoviride Trichoderma aureoviride Trichoderma aureoviride 9012 12 7 7 7 927 7 100 KX343087.1 582PDA8 Penicillium janthinellum 100 KY427360.1 582PDA9 Fusarium proliferatum 100 MF471668.1 582PDA11 Fusarium equiseti Fusarium equiseti 100 10092 100 KU866665.1

93Каталаза7790 – 907 992DA17907 992 992 моль мг −1 белок час −1 IAA µ гмл −1 Производство сидерофоров (PSI) NH 3 Производство HCN Уреаза 581PDA1 0.99 ± 0,005 – + 2,64 ± 0,34 ++ – – ++ 581PDA2 – 9279 9279 9279 – – – – + 581PDA3 0,54 ± 0,015 – – 2,64 ± 0,34 – – – – – 581PDA4 – – – 3.13 ± 0,37 – – – + 581PDA5 0,61 ± 0,02 – – 2,11 ± 0,17 – 907 992 07 927 – 907 992 927 581PDA7 0,73 ± 0,015 2,62 ± 0,14 – 2,08 ± 0,03 – – – + – + 7 – – + – + 582PDA4 – 36.12 ± 0,004 – 2,29 ± 0,19 + – – + 582PDA5 0,57 ± 0,005 4,00 ± 0,003 4,00 ± 0,003 – – ++ 582PDA6 1,41 ± 0,005 1,125 ± 0,04 ++ 4,09 ± 0,22 ++ – ++ – 582PDA7 1.43 ± 0,01 2,12 ± 0,05 ++ 2,49 ± 0,16 – – – + 582PDA8 0,64 ± 0,01 5,1 ± 0,36 – – – + 582PDA9 0,03 ± 0,011 1,375 ± 0,018 – – – – 582PDA11 – 21.125 ± 0,009 – 2,49 ± 0,17 – + – + 582PDA13 0,89 ± 0,01 – – – – – 2,1 – – +

– = отрицательный; + = плохой рост; ++ = умеренный рост; +++ = отличный рост. Значения представляют собой среднее значение трех измерений ± стандартное отклонение.

Здесь рост 9774; – = нет роста.

7,590%7,5 907 9077 Штамм 2,5% 5% 5% + + + – 581PDA2 + + + – 581PDA3 90 581PDA4 + + + – 581PDA5 + + + – 5892 90 + 7 7 582PDA1 + + – – 582PDA4 + + – – 582PDA5 + – – – 582PDA6 + + 2 2 + + + 582PDA8 + + + – 582PDA9 + + 2 – – – 582PDA13 + + – –

927 927 927 927 927 927 927 927 927 927 927 927 927 927792 9270 + 9270 +90-7 927 90 + 9270- 90 + 907 992 90 + 9270 + 90 + 90779 9270 +90-907 907DA9292 9277DA92929277DA + 9270 + 582PDA11 9270 + 9270 + Штамм Никель Медь Кадмий Кобальт Свинец 50 100 50 100 50 100 150 200 250 300 50 100 150 200 250 300 50 250 1002790 300 50 100 90 792 150 200 250 300 581PDA1 + + + + – – + + + + + + + – – + + + + – – – – -90 + + + + 581PDA2 + + + + – – – + 907 – + + + + – – + + + + – – 2 + + + – – 581PDA3 + + + + – – – – + + + + – – + + + + – + + – – 581PDA4 + + + + – – + + + – + + + + – – + + + + – – + + + 2 + + – 581PDA5 + + + + – – + + + 907 992 + + + + – – + + + + – – + + – – 581PDA7 + + + + – – + + + + + + + + + – – + + + + – – + + + + + 2 + 582PDA1 + + + + + – + + + + + – – + + + + + – + + + 582PDA4 + + + + – – + + + + – -90 + – -90 + – – + + + + – – + + + 92 + – – 582PDA5 + + + + – – + + + + – – -907 992 -907 992 -907 – – + + + + – – + + + + – 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – – + + + + – – + + + – – – – + + + – – + + + + + – 582PDA9 + 907 + + + + + + + + – + + + + + + + + + – + + + + + – 582PDA11 + + + + 90 – – + + + + + – + + + + + + – + + – + + + + + – 582PDA13 + + + + + + – – + + + + + + + + + + + + – + + – + + + + + +

обозначает рост; здесь +

– означает отсутствие роста.

2 Напряжение 10% 20% % 20% 1 581PDA1 34,91 26,72 18,04 4,52 – 581PDA2 73,33 632790 547907.67 7,0 – 581PDA3 66,56 49,30 13,41 – – 581PDA4 9 09 581PDA5 71,58 54,51 39,97 7,63 – 581PDA7 68,47 42,48 14,2906 90,79049 – 582PDA1 29,47 8,98 – – – 582PDA4 40,64 2 2 2 2 2 52,61 35,60 7,8 – – 582PDA6 84,15 69,79 54,59 35,68 7,804 67,59 55,63 46,56 – 582PDA8 39,57 11,96 22,78 – 2 9 – 582PDA11 37,79 12,45 5,19 – – 582PDA13 37,23 12.13 3,23 – –

Здесь – означает отсутствие роста.

90 ++DA62790 582 907 9279 0- 35792 5 ° C 5 ° C ° C ° C 50 ° C 55 ° C 581PDA1 + ++ +++ +++ + + + + + + + + 581PDA2 – + +++ ++ + – – 581PDA3 – – – 581PDA4 – + +++ ++ + – – 581PDA4 581 +++ ++ + + – 581PDA7 – ++ +++ ++ + + + 582PDA1 + ++ +++ +++ – – – 582PDA4 – ++ ++90 ++ ++90+ ++90 + + + 582PDA5 – ++ +++ ++ + + – 582 +++ ++ + – – 582PDA7 – ++ +++ ++ + 582PDA8 – ++ 907 92 +++ ++ + – – 582PDA9 – ++ +++ ++ + – – 582PDA11 – ++ +++ ++ ++ + – 582PDA13 – ++ ++ ++ ++ ++ + –

Здесь – = нет роста; + = плохой рост; ++ = умеренный рост; +++ = отличный рост.

+

907 907 907 907 92777 927 927 927 9279 – 927792 90 787 Штамм Нистатин Кетоконазол Итраконазол 581PDA1 + – – 581PDA2 – – – 581PDA3 + + + – – 581PDA7 – – – 582PDA1 – – + + + + – 582PDA5 + – – 582PDA6 + + + 582PDA7 + + + 582PDA8 9 – – 582PDA11 – + + 582PDA13 – ++ ++ 92 ++ ++ 92 4 ++ ++ 92 4 – = чувствителен к антибиотикам; + = слабоустойчивый; ++ = умеренно стойкий; +++ = высокая стойкость. Ученые доказали, что ACCD-содержащие PGPF могут успешно защищать от торможения роста, вызванного наводнением, повышенным содержанием соли, засухой и присутствием грибковых и бактериальных патогенов, повреждением нематод; и наличие высоких уровней металлов и органических загрязнителей, а также низкотемпературного стресса. В современном исследовании среди 15 выделенных грибов 11 были способны проявлять незначительную активность ACCD (от 0,03 ± 0,011 до 1,43 ± 0,01 µ моль -КБ мг -1 белка час -1 ).Предыдущий документ показал, что уровень активности ACCD при приседании, такой как или более 0,02 µ моль -KB мг -1 белка час -1 , достаточен для того, чтобы микроб ускорял рост растений в качестве PGPE [30]. ИУК играет роль в росте клеток, замедляет рост боковых побегов, способствует опадению, образует ткань ксилемы и флоэмы, а также влияет на рост и удлинение корней [57]. Среди протестированных грибов 9 были способны продуцировать ИУК, при этом изолят 582PDA4 был основным продуцентом (таблица 2).На основании вышеизложенного можно утверждать, что для исследованных штаммов продукция ИУК играет решающую роль в регуляции этой характеристики PGP. Эндофиты, продуцирующие сидерофоры, полезны для растений, потому что они ингибируют фитопатогены, уменьшая доступность железа для патогенов, и, таким образом, препятствуют их росту внутри растений и косвенно ускоряют рост растений. Мы проверили способность выделенных грибов продуцировать сидерофор с помощью универсального агара CAS и обнаружили 3 изолята (581PDA1, 582PDA6 и 582PDA7), обладающих способностью продуцировать сидерофор в виде оранжевого ореола вокруг колоний (таблица 2).Оптимистическая реакция роста была зарегистрирована у различных культурных растений, инокулированных эндофитами, растворяющими фосфат [58]. Наши результаты показали, что 12 из 15 протестированных эндофитных грибов дали PSI в диапазоне от 2,11 ± 0,17 до 5,16 ± 0,36 (таблица 2). HCN и NH 3 косвенно влияют на стимуляцию роста растений. HCN является летучим по своей природе и способен проявлять противогрибковое действие, тогда как NH 3 может помочь обеспечить потребность растения-хозяина в азоте и в больших количествах подавляет колонизацию растений патогенами [59].Тест на HCN был положительным только для 2 изолятов (582PDA1 и 582PDA11), тогда как NH 3 продуцировали около 34% протестированных микробов (Таблица 2). Для тестов на уреазу и каталазу мы наблюдали, что ни один из изолятов не обладает ферментом уреазой, но все они показали положительный ответ на фермент каталазу (Таблица 2). Фермент каталаза играет первостепенную роль в защите организма от токсичных свободных радикалов, которые образуются преимущественно под воздействием окружающей среды, механических и химических стрессов и могут косвенным образом способствовать росту растений [60].В текущем исследовании все грибы дали положительный ответ на фермент каталазу; следовательно, мы можем сказать, что они косвенно усиливают рост растений. Эти данные согласуются с опубликованными ранее [61]. Хорошо известно, что абиотический стресс приводит к ряду морфологических, физиологических, биохимических и молекулярных изменений, которые отрицательно влияют на рост и продуктивность растений [62]. Следовательно, отбор, проверка и применение стрессоустойчивых PGPF для лучшего ведения сельского хозяйства значительно облегчили бы фермерское сообщество, преодолев такие экстремальные климатические изменения.Кроме того, известно, что такое применение микробов помогает преодолеть фатальный эффект химических удобрений и пестицидов. Таким образом, при скрининге активности, способствующей росту, мы также предприняли инициативу, чтобы затянуть и познакомиться с многообещающими эндофитными грибами пшеницы с устойчивостью к абиотическому стрессу и чувствительностью к антибиотикам для лучшего стимулирования роста растений. Солеустойчивые микробы – перспективный биоресурс для зон, подверженных засолению. С другой стороны, предыдущие исследования показали, что если бы эти эндофиты также обладали свойствами, способствующими росту растений, они были бы идеальными для использования в устойчивом сельском хозяйстве [63].Из 15 грибных изолятов растений пшеницы 13,33% проявили толерантность к высокой концентрации соли (10% NaCl). Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами превратилось в серьезную проблему, поскольку они не разлагаются, как органические загрязнители, и накапливаются в различных частях пищевой цепи, что представляет угрозу для здоровья растений и животных. С этой точки зрения, предыдущие исследования дали информацию о различных эндофитах, обладающих способностью снижать стресс, вызываемый растениями из-за присутствия тяжелых металлов, увеличивать доступность металла для поглощения растениями и способствовать росту растений [64, 65].В нашем текущем исследовании мы также обнаружили ряд эндофитных грибов пшеницы, проявляющих устойчивость к испытанным солям тяжелых металлов (Ni, Cu, Cd, Co и Pb) в различных диапазонах наряду с их свойствами PGP. В последнее время все большее внимание привлекают микробы, ассоциированные с сельскохозяйственными растениями, обладающие хорошей устойчивостью к засухе. Влияя на морфологию, развитие и физиологические и биохимические реакции растений на стресс, эндофиты грибов могут спровоцировать механизмы ухода от засухи, смягчения засухи и восстановления после засухи у своих хозяев [66, 67].В ходе нашего исследования мы обнаружили, что все отобранные эндофитные грибы пшеницы способны противостоять засухе в различных диапазонах. Был изучен ряд эндофитов, которые помогают растениям справляться с температурным стрессом, а также стимулируют рост различных культур в различных климатических условиях [68]. Мы изучили влияние различной температуры на все протестированные изоляты грибов и обнаружили, что оптимальная температура роста максимальных штаммов составляет 25 ° C. Наименьшая и максимальная температура, переносимая изолятами, составляла 5 ° C (581PDA1) и 55 ° C (582PDA4), соответственно.Напрашивается вывод, что эти микробы в определенной степени помогают переносить температурный стресс. Использование в растениях различных типов материалов, таких как тяжелые металлы, вместе с антибиотиками, создает давление отбора в окружающей среде, которое, следовательно, приводит к мутации в организме, которая помогает им выживать и размножаться [69]. Предыдущие исследования показали, что устойчивость эндофитов к антибиотикам может ускорять рост растений [34, 35, 53]. Обсудив это, мы проверили устойчивость PGPF к антибиотикам, и мы заметили, что структура их устойчивости варьируется от антибиотика к антибиотику.Также сообщалось, что в условиях окружающей среды, вызванной металлическим стрессом, устойчивые к металлам и антибиотикам микроорганизмы будут адаптироваться быстрее за счет распространения R-факторов, чем за счет мутаций и естественного отбора. Несоответствие в устойчивости ко многим протестированным антибиотикам, вероятно, связано с вариациями в условиях роста и воздействием на микробы PGP стрессовых условий или токсичных веществ, а также с наличием или отсутствием механизмов устойчивости, которые могут кодироваться хромосомой и / или R-плазмидой. [68, 69]. 5. Заключение Настоящее исследование показало, что растение пшеницы является экологической нишей для различных предполагаемых грибковых эндофитов. Способность этих микробов стимулировать рост растений может быть связана с их способностью секретировать повышенные количества различных благоприятных метаболитов, способствующих росту, и, следовательно, помочь своим растениям-хозяевам выжить в условиях стресса. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Сохранить моё имя, email и адрес сайта в этом браузере для последующих моих комментариев. ➤